中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 张海华北京协和医学院(中国医学科学院) 2004年博士导师: 柯美云;陈建德共925页

摘要 : 功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)指具有消化不良症状,但无明显胃肠道器质性病变的一种临床综合征.其病因和发病机制仍不清楚,目前认为胃电紊乱、胃肠运动异常、近端胃感觉异常在其中起重要作用.胃电图(electrogastrography,EGG)是用体表电极... 展开

关键词 : 功能性消化不良胃电紊乱多通道胃电图

2. 国人内脏静脉血栓的病因及经颈内静脉肝内门体分流术治疗的系列临床研究

[学位论文] 祁兴顺第四军医大学 2014年博士导师: 樊代明共290页

摘要 : 【背景】内脏静脉血栓（splanchnic vein thrombosis，SVT）包括门静脉系血栓形成（portal venous system thrombosis，PVST）及Budd-Chiari综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）。虽然SVT的发病率较低，但常可并发严重的致死性事件。在西方国家... 展开【背景】内脏静脉血栓（splanchnic vein thrombosis，SVT）包括门静脉系血栓形成（portal venous system thrombosis，PVST）及Budd-Chiari综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）。虽然SVT的发病率较低，但常可并发严重的致死性事件。在西方国家，80%以上的SVT患者伴有至少一项血栓危险因素。因此指南推荐，一旦患者被诊断为SVT，应常规筛查血栓危险因素，以助于明确病因并判断抗凝持续时间。但尚无研究系统地评估中国SVT患者血栓危险因素的患病率情况。经颈内静脉肝内门体分流术（transjugular intrahepatic portosystemic shunt，TIPS）是肝硬化门静脉高压并发症的主要治疗手段。然而，在SVT患者中，TIPS的技术难度及并发症风险将显著增加。其中，门静脉血栓（portal vein thrombosis，PVT）也被列为TIPS的相对禁忌证。既往小样本病例系列研究初步探讨了TIPS在PVT患者的可行性及安全性，但尚缺乏数据评判手术成功以及患者术后生存的因素。另一方面，西方BCS患者以肝静脉（hepatic vein，HV）阻塞为主，TIPS是常用的治疗方法之一。然而，中国BCS患者以下腔静脉（inferior vena cava，IVC）型或HV/IVC混合型阻塞为主要表现，经皮开通术是最为常用的治疗方法，而很少使用TIPS。究竟中国 BCS 患者在接受 TIPS 后的结局如何呢？总体上，我们尚不确定西方研究结果是否可照搬用于中国患者。【目的】本论文围绕SVT病因与治疗探讨以下几项问题。首先，总体分析关于SVT文献发表的数量与类型，并总结中国BCS治疗方法的选择以强调与西方国家之间的区别。然后，应用荟萃分析的方法分别探讨常规筛查不同血栓危险因素在SVT患者中的临床意义。同时，分析入住我院的SVT患者中血栓危险因素患病率情况，以明确中国患者是否需常规筛查血栓危险因素。最后，分别探讨TIPS治疗中国非肝硬化PVT、肝硬化PVT、BCS患者的结局。此外，还报道一项比较TIPS与内镜联合药物预防肝硬化PVT患者静脉曲张再出血的随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）的试验方案及初步结果。【方法】 1.应用PubMed、EMBASE、Cochrane library数据库检索全球所有关于SVT的文献。分析不同国家发表文献数量及其时间趋势，并特别强调来自中国的文献。我们也分析发表文章的类型。其中，高质量的临床研究被定义为样本量超过10且绝大多数纳入的患者为SVT。另外，应用Google Scholar检索文献被引用次数。 2.应用PubMed、VIP、CNKI数据库检索所有关于中国BCS的文献。通过阅读所有全文鉴定有关临床治疗方面的研究，并评估不同治疗方式的比例及随时间的变化趋势。 3.首先，应用PubMed数据库检索有关JAK2 V617F基因突变与SVT的文献。荟萃分析JAK2 V617F基因突变或骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm， MPN）在SVT中的患病率，比较JAK2 V617F基因突变患病率在SVT患者与其他部位静脉血栓栓塞患者或健康受试者之间的差异，比较 MPN 患病率在伴有和不伴有JAK2 V617F基因突变患者之间的差异。其次，我们分析2009.9-2011.5期间入住我院诊断为SVT且检测JAK2 V617F基因突变的患者。计算JAK2 V617F基因突变的患病率，并评估预测JAK2 V617F基因突变阳性的相关危险因素。 4.应用PubMed、EMBASE、Cochrane library数据库检索有关遗传性抗凝血酶（antithrombin，AT）、蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）缺乏在SVT患者的文献。荟萃分析遗传性AT、PC、PS缺乏在SVT患者的患病率，并比较遗传性AT、PC、PS缺乏的患病率在SVT患者与健康受试者之间的差异。组间差异表达为优势比（odds ratio，OR）。 5.应用PubMed数据库检索有关AT、PC、PS水平在肝硬化PVT患者的文献。比较伴有和不伴有PVT的肝硬化患者之间AT、PC、PS水平之间的差异，表达为标准化均数差（standardized mean difference，SMD）。 6.应用PubMed、EMBASE、Cochrane library、ScienceDirect数据库检索有关凝血因子V Leiden（factor V Leiden，FVL）或II G20210A突变与SVT之间关系的文献。比较FVL以及凝血因子II G20210A突变患病率在不同组间的差异，包括BCS或非肝硬化PVT患者v.s.健康人或其他部位静脉血栓患者、肝硬化PVT患者v.s.肝硬化无PVT患者。组间差异表达为OR。 7.应用PubMed、EMBASE、Cochrane library、ScienceDirect数据库检索有关5,10，-亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）C677T基因突变、高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HH）和（或）血浆同型半胱氨酸水平与SVT之间关系的文献。比较MTHFR基因突变患病率、HH患病率以及血浆同型半胱氨酸水平在以下不同组之间的差异，包括BCS或非肝硬化PVT患者v.s.健康人、肝硬化PVT患者v.s.肝硬化无PVT患者、肝癌PVT患者v.s.肝癌无PVT患者。组间差异表达为OR或加权均数差（weighted mean difference，WMD）。 8.分析2009.9-2011.12期间入住我院诊断为SVT且检测红细胞及白细胞上CD55 及 CD59 表达情况的患者。计算阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的患病率。 9. 1999.7-2011.12期间入住我科的169例原发性BCS患者进行全面血栓危险因素的筛查。另外，2009.7-2012.8期间入住我科的141例非肝硬化非肿瘤PVT患者进行血栓危险因素筛查。计算不同血栓危险因素在中国BCS及非肝硬化非肿瘤PVT患者的患病率。 10.首先，应用PubMed数据库检索有关TIPS治疗PVT的文献。分析当前文献发表现状、TIPS治疗策略、手术成功率、并发症发生率等情况。其次，回顾性分析2002.7-2009.12期间20例非肝硬化门静脉海绵样变性（cavernous transformation of the portal vein，CTPV）患者入住我科并接受TIPS治疗的结局，包括手术成功率、并发症发生率、预后。比较TIPS成功组与失败组之间静脉曲张再出血及死亡率。然后，回顾性分析2001.12-2008.9期间57例伴有门脉高压并发症的肝硬化PVT患者入住我科并接受TIPS治疗的结局，包括手术成功率、并发症发生率、分流道功能障碍、术后脑病、生存。Logistic回归模型计算独立预测TIPS手术成功的因素；Cox回归模型计算独立预测生存的因素。最后，描述一项有关 TIPS 在肝硬化 PVT 患者中预防静脉曲张再出血的RCT的试验流程以及入组情况。 11.首先，应用PubMed、EMBASE、Cochrane library数据库检索有关TIPS治疗BCS的文献。分析文献发表现状、TIPS成功率、并发症发生率、TIPS有效性以及预后。然后，回顾性分析2004-2012期间51例BCS患者入住我科并接受TIPS治疗的结局，包括分流道功能障碍、术后脑病、生存的累积风险。Cox 回归模型计算相关预测因素。Log-rank检验比较早行与转行TIPS组间差异。【结果】 1.共6691篇PVT的文献以及4325篇BCS的文献被鉴定。论文发表数量随时间呈增长趋势。其中，美国发表的文献数量最多（PVT：n=1417；BCS：n=888）。自从2001年以来，中国发表文献数量显著增高（PVT文献数量排列在第三位，BCS文献数量排列在第二位）。临床研究是最常见的文章类型（PVT：n=2667/5395；BCS：n=1092/3171），但不到一半的研究纳入超过 10 例患者（PVT：n=976/2667；BCS：n=466/1092）。在样本量超过 10 的临床研究中，少于一半的研究属于高质量研究（PVT：n=976/2667；BCS：n=466/1092）。根据研究设计，高质量研究被划分为队列研究（PVT：n=865；BCS：n=421）、病例对照研究（PVT：n=98；BCS：n=45）、RCT（PVT：n=13；BCS：n=0）。 2.共300篇有关中国BCS临床治疗的原创性文章被纳入，包括23352例BCS患者。论文发表数量及文献报道患者数量随时间呈增长趋势。治疗方法包括外科治疗（n=8625）、介入治疗（n=13940）、外科联合介入治疗（n=363）、药物治疗（n=277）、其他治疗（n=91）、未治疗（n=56）。2005年之后，接受外科治疗的患者数量显著下降，而接受介入治疗的患者数量仍被维持。分流术是最常被用的外科治疗方式（n=3610），而肝移植很少被报道（n=2）。球囊扩张伴或不伴支架置入是最常用的介入治疗方式（n=13747），而TIPS很少被报道（n=81）。 3.首先，共23篇有关JAK2 V617F基因突变与SVT的文献被纳入荟萃分析。JAK2 V617F基因突变在BCS及PVST患者的患病率分别为37%和24%。当排除预先确诊为MPN的患者，JAK2 V617F基因突变的患病率分别为26%和19%。研究间存在显著的异质性。与其他部位血栓患者或者健康人相比，SVT 患者有着显著更高的JAK2 V617F基因突变患病率。与不伴有JAK2 V617F基因突变患者相比，伴有JAK2 V617F基因突变患者有着显著更高的MPN患病率。其次，在92例中国BCS患者中，4例（4.3%）伴有JAK2 V617F基因突变，且均有脾大、血小板水平（platelets count，PLT）超过100*109/L（107-188*109/L）。在64例非肿瘤非肝硬化PVT患者中，17例（26.6%）伴有JAK2 V617F基因突变。其中，PLT（P=0.005，OR=1.006，95%CI：1.002-1.011）和年龄（P=0.001，OR=1.117， 95%CI：1.064-1.302）是独立预测JAK2 V617F基因突变存在的危险因素；在仅包括脾大患者的亚组分析中，伴有及不伴有JAK2 V617F基因突变组间的PLT差异尤为显著；而在仅包括切脾患者的亚组分析中，伴有及不伴有JAK2 V617F基因突变组间的PLT并未达到显著性差异。在71例肝硬化PVT患者中，仅1例（1.4%）伴有JAK2 V617F基因突变。 4.共9篇文献被纳入荟萃分析。遗传性AT、PC、PS缺乏的患病率在PVST患者中分别为3.9%、5.6%、2.6%；在BCS患者中分别为2.3%、3.8%、3.0%。除了遗传性 PC 缺乏在 BCS 患者中的患病率分析以外，研究间的异质性均不显著。基于 3项研究的荟萃分析显示，与健康人相比， PVST 患者有着显著更高的遗传性 AT （OR=8.89，95%CI：2.34-33.72，P=0.0011）、PC（OR=17.63，95%CI：1.97-158.21， P=0.0032）、PS（OR=8.00，95%C 收起

关键词 : 内脏静脉血栓门静脉血栓 Budd-Chiari综合征血栓危险因素经颈内静脉肝内门体分流术

3. TIPS治疗门静脉高压并发症的系列临床研究

[学位论文] 吕勇空军军医大学 2019年博士导师: 樊代明共289页

摘要 : [背景] 静脉曲张出血是门脉高压的严重并发症。30%患者在首次出血事件中死亡，而60%~70%的生存者有再次出血的危险。因此，所有发生出血的患者都应当积极治疗并预防再出血。 2010年Garcia-Pagan发表在《新英格兰医学杂志》的一项随机对照研... 展开 [背景] 静脉曲张出血是门脉高压的严重并发症。30%患者在首次出血事件中死亡，而60%~70%的生存者有再次出血的危险。因此，所有发生出血的患者都应当积极治疗并预防再出血。 2010年Garcia-Pagan发表在《新英格兰医学杂志》的一项随机对照研究显示对肝功能Child-PughB级伴有内镜下活动性出血或Child-PughC级的患者，早期(出血后72h内)使用覆膜支架行经颈静脉肝内门体分流术(早期TIPS)，与内镜联合药物治疗相比提高了生存率。但是，生存并不是该研究的主要观察终点，并且在随后的三项根据early-TIPS标准纳入“高危”患者的观察性研究中，早期TIPS与标准治疗相比并没有明显提高生存率。因此，早期TIPS能否延长肝硬化急性静脉曲张出血患者的生存时间仍需要进一步研究。其次，早期TIPS的最佳适应人群仍然存在争议。一些研究发现对于Child-PughB级伴有活动性出血的患者并不属于真正的高危患者，不需要进行早期TIPS治疗。因此，一些学者提出了定义急性静脉曲张出血“高危”患者的其他标准，如：终末期肝病模型(MELD)评分≥19(MELD11-19标准)或Child-PughC级伴有基线肌酐≥1mg／dL(ChildC-C1标准)被认为是“高危”患者(6周死亡率大于20%)。但是在根据这些标准诊断的“高危”患者，早期TIPS是否能改善生存，尚没有相应的研究。此外，“低危”和“高危”患者从早期TIPS患者获益程度是否相同，目前也尚不清楚。门静脉血栓在肝硬化患者中患病率为10%~25%，而门静脉血栓的形成可显著增加肝硬化患者急性静脉曲张出血控制失败率，再出血率及6周死亡率，使得静脉曲张出血的治疗和预防更加复杂和困难。对于没有门静脉血栓的患者，指南推荐的药物和内镜作为预防再出血的一线措施，而TIPS为药物和内镜止血失败后的二线选择。但是对于伴有门静脉血栓患者应该如何选择，尚缺乏高质量的随机对照研究。肝硬化门静脉高压症患者由于肝血管床内阻力增加，常形成门体侧支循环，绕过肝脏，分流门脉血流进入体循环。这些侧支循环有两种形成方式。在大多数情况下，门静脉与体循环之间广泛的交通支开放，形成曲张静脉。2%~18%患者已经关闭的胚胎静脉通道重新开放，形成多种自发性门体分流(Spontaneous portosystemic shunts，SPSS)。随着门脉压力的升高，SPSS管径增粗，功能上类似于外科分流术，可部分缓解升高的门静脉压力。然而，SPSS代偿往往是不充分的，一些患者门脉压力持续升高，最终发生失代偿性并发症(如静脉曲张出血、腹水)。此外，研究显示，SPSS的形成可减少肝门静脉血流灌注，增加慢性肝性脑病的风险和死亡率。在一些因门脉高压并发症而接受TIPS检查的患者中，可以在门静脉造影过程中发现SPSS。SPSS是否对TIPS术后的结局有影响，更重要的是，它们是否需要栓塞或封堵还不清楚。食管胃静脉曲张出血是特发性非肝硬化门脉高压症(Idiopathic non-cirrhotic portal hypertension, INCPH)的主要临床表现和致命性并发症。由于缺乏数据，目前对INCPH患者静脉曲张出血预防和治疗策略主要遵循肝硬化静脉曲张出血的指南。这包括将TIPS作为内镜和药物治疗难以控制的急性静脉曲张出血或反复发生的静脉曲张出血的“挽救治疗”和二线选择。然而，最近一些研究表明，INCPH的自然病程与肝硬化并不完全相同。自然历史的不同可能会影响TIPS的治疗。因此，按照肝硬化的指南治疗INCPH可能并不合适。然而，到目前为止，还没有相应研究对这两种疾病的患者接受TIPS治疗之后的结局进行比较。 [目的] 1)通过前瞻性随机对照试验评估对于肝硬化急性静脉曲张出血患者，早期应用覆膜支架TIPS与内镜联合药物治疗相比是否可以延长生存； 2)通过多中心回顾性队列研究和危险分层分析，确定从早期TIPS(相对内镜联合药物治疗)获益最大的人群； 3)通过随机对照试验比较覆膜支架TIPS与内镜联合普萘洛尔/抗凝预防肝硬化静脉血栓患者静脉曲张再出血的有效性及安全性； 4)通过回顾性队列研究探讨TIPS术前存在SPSS以及术中栓塞SPSS对TIPS术后结局的影响； 5)通过回顾性队列研究比较TIPS治疗特发性非肝硬化门静脉高压vs肝硬化门静脉高压患者静脉曲张出血的结局。 [方法] 1)2011年6月至2017年9月，129例进展期肝硬化(Child-PughB级或Child-PughC级＜14分)急性食道胃静脉曲张出血患者按照2:1的比例被随机分配至早期TIPS组(n=84)或内镜联合药物组(n=45)。所有患者在入院时均接受血管活性药物和内镜治疗。TIPS治疗组在入院72小时内行聚四氟乙烯覆膜支架TIPS治疗；内镜联合药物组则继续接受血管活性药物治疗,5天后给予普萘洛尔及内镜套扎治疗预防再出血,在上述治疗措施失败后,再用TIPS作为补救措施。研究的主要观察终点是无移植存活率，次要终点包括控制出血失败或再出血、新发腹水或原有腹水程度加重、显性肝性脑病、门脉高压的其他并发症和不良事件。 2)纳入2010至2016年中国12家医院诊断为肝硬化急性静脉曲张出血、接受标准治疗(标准治疗组，n=1219)或早期TIPS治疗(早期TIPS组，n=206)的1425例患者。早期TIPS定义为入院72小时内行TIPS。排除标准为肝细胞癌超出米兰标准，年龄＞75，肌酐≥3mg/dl，完全性门静脉血栓或Child-Pugh评分＞13。采用竞争风险分析比较早期TIPS组和标准治疗组的6周及1年死亡率，并使用多因素回归模型及倾向评分模型调整混杂因素。 3)2011年5月至2017年9月，共有49例肝硬化门静脉血栓并在6周内发生静脉曲张出血的患者随机分配至TIPS治疗组(24例)和内镜联合药物治疗组(25例)，两组都辅以抗凝以治疗门静脉血栓并预防血栓复发。主要观察终点是静脉曲张再出血，次要观察终点包括：生存、显性肝性脑病、门静脉脉血栓再通及在再通后复发、其他门脉高压并发症(腹水、细菌性腹膜炎、肝肾综合征等)及不良事件。 4)纳入2004年1月至2014年12月所有因门静脉高压并发症(出血或顽固性腹水)在西京消化病医院接受TIPS治疗的肝硬化的患者。根据TIPS术前造影是否存在SPSS及TIPS手术时是否栓塞SPSS，将患者分为无SPSS组(N-SPSS组)、有SPSS但未栓塞组(SPSS组)和有SPSS并进行栓塞组(SPSS+E组)。采用竞争风险分析比较三组TIPS术后结局(显性肝性脑病、临床症状复发、支架功能障碍及生存)，并使用多因素回归模型调整混杂因素。 5)纳入2001年3月至2015年9月在西京消化病医院接受急诊或择期TIPS治疗的所有INCPH和肝硬化患者。对每例INCPH患者，选取1例肝硬化门脉高压症接受TIPS的患者与之匹配，匹配的因素有年龄、性别、Child-Pugh分级、TIPS手术适应证(急诊vs择期)、支架类型(覆膜支架vs裸支架)和TIPS手术时间(±0.5年)。采用竞争风险分析比较两组TIPS术后结局(生存、控制出血失败或再出血、支架功能障碍及显性肝性脑病)，并使用多因素回归模型调整混杂因素。 [结果] 1)与内镜联合药物治疗组相比，早期TIPS组无移植存活率较高(6周：99%vs84%；1年：86%vs73%；2年：79%vs64%；p=0.039)。在Cox回归分析中调整了肝脏疾病的严重程度后，早期TIPS将2年死亡率或移植的相对风险降低了56%(调整后的风险比:0.44；95%可信区间:0.22~0.88)。此外，在大多数亚组中都显示早期TIPS优于内镜联合药物治疗，没有明显异质性。并且，早期TIPS降低了控制出血或再出血、新发腹水或原有腹水程度加重的发生率，并且没有增加显性肝性脑病和其他不良事件发生频率和严重程度。 2)在总体人群中，与标准治疗(内镜联合药物)组相比，早期TIPS组6周死亡的相对风险(relative risk reduction)降低了80%(调整后风险比：0.20;95%可信区间：0.10~044;p＜0.001)，1年死亡的相对风险降低了51%(调整后风险比：0.49；95%可信区间：0.32~0.73;p＜0.001)。分层分析显示，死亡率的相对风险降低程度在不同的风险分层之间没有明显异质性(交互作用检验：p＞0.1)。然而，死亡的绝对风险降低的程度(absolute risk reduction，ARR)在高危患者中更为明显(交互作用检验：P＜0.001)。具体而言，在MELD≤11(低危),MELD12-18(中危)和MELD≥19(高危)的患者中，6周死亡率的绝对风险降低程度分别为-2.1%,-10.2%和-32.4%；1年死亡的绝对风险降低程度分别为-1.7%,-5.4%,和-32.7%。在Child-PugA级(低危),Child-PugB级(中危)和Child-PugC级(高危)的患者中，6周死亡率的绝对风险降低程度分别为-1.5%,-9.1%和-23.2%；1年死亡的绝对风险降低程度分别为-3.6%,-5.2%,和-20.3%。调整肝功能和其他混杂因素后，在MELD≥19和Child-PughC级的患者中，早期TIPS(与标准治疗相比)提高了6周及1年的生存率，但是在MELD≤11和Child-PugA级的患者中，早期TIPS既没有提高6周生存率也没有提高1年生存率。在MELD12-18的患者中，早期TIPS提高了6周生存率但没有提高1年的生存率。在Child-PugB级伴有活动性出血的患者中，早期TIPS提高了6周及1年的生存率，但是在Child-PugB级不伴有活动性出血的患者中，早期TIPS既没有提高6周生存率也没有提高1年生存率。但是，内镜下活动性出血的比率在各中心存在较大异质性。此外，早期TIPS降低了控制出血失败或再出血、新发腹水的和原有腹水程度加重的发生率，并且没有增加显性肝性脑病的风险。 3)TIPS组与内镜联合药物组的中位随访时间都为30个月。TIPS组全因再出血率显著低于内镜套扎联合药物组(1年：15%vs45%，2年：25%vs50%；风险比：0.28,95%?可信区间0.10~0.76,p=0.008)，TIPS组门静脉再通率显著高于内镜联合药物组(95%vs70%，p=0.03)，并且血栓复发率较低((5%vs33%,p=0.06)。两组在生存(67%vs84%,p=0.152)、显性肝性脑病发生率(25%vs16%，p=0.440)、门静脉高压其他并发症及不良事件方面无显著差异。 4)全队列患者在27.7个月的中位随访期间内，368例(41%)患者出现显性肝性脑病，256例(28%)出现临床症状复发，164例(18%)出现支架功能障碍，379例(42%)死亡。与N-SPSS和SPSS+E组相比，SPSS组的显性肝性脑病风险较高(调整后的风险比[95%可信区间]：N-SPSSvsSPSSvsSPSS+E：1vs1.36[1.06~1.75]vs0.77[0.46~1.29];p=0.027)。在分层分析中，仅在SPSS较大(SPSS直径≥6mm)的患者中观察到显性肝性脑病风险显著增加。此外，TIPS术中对粗大的SPSS进行栓塞或封堵可显著降低TIPS术后的显性肝性脑病的发生风险(调整后的风险比:0.51;95%可信区间：0.29~0.91;p=0.034)。临床症状复发率(p=0.584)，分流功能障碍发生率(p=0.267)和死亡率(p=0.4743)在各组之间没有显著差异。 5)INCPH患者与匹配的肝硬化患者相比，虽然TIPS术后控制出血失败或再出血发生率(5年：33%vs32%;风险比：0.7 收起

关键词 : 经颈内静脉肝内门体分流术肝硬化门静脉血栓

4. 儿童超说明书用药管理指南的制订及其指南实施的影响因素研究

[学位论文] 孟敏重庆医科大学 2023年博士导师: 李秋;陈耀龙共288页

摘要 : 背景：由于儿童药物的研发速度缓慢、儿童临床试验招募困难、药品说明书更新滞后等原因，儿童超说明书用药成为临床的普遍现象。但是超说明书用药存在有效性不明确、安全风险大等问题，且已有研究表明儿童超说明书用药存在不合理的情况。目前，儿童超... 展开背景：由于儿童药物的研发速度缓慢、儿童临床试验招募困难、药品说明书更新滞后等原因，儿童超说明书用药成为临床的普遍现象。但是超说明书用药存在有效性不明确、安全风险大等问题，且已有研究表明儿童超说明书用药存在不合理的情况。目前，儿童超说明书用药已经成为全球的公共卫生问题，受到全球儿科医生和学者的关注。特别是我国，面临儿童药品严重短缺，药品说明书中儿童用药信息严重不足，各医疗机构的儿童超说明书用药管理能力存在较大差异等情况，导致儿童超说明书用药问题更加严峻。然而，现有的现状调研存在样本量较小、纳入医院数目较少、未呈现超说明书用药处方的证据分布、缺乏中国儿童超说明书用药经济负担的数据等缺点，因此当前我国的儿童超说明书用药现状仍不明晰。 2022年3月1日施行的《中华人民共和国医师法》明确指出，超说明书用药需要基于临床实践指南（ClinicalPracticeGuidelines，CPGs）等循证医学依据，然而儿童临床实践指南中的超说明书用药证据等级、研究类型分布等情况存在研究空白。目前，我国没有针对儿童超说明书用药管理的循证指南，虽然2016年发布的《中国儿科超说明书用药专家共识》实用性较强，广泛应用于临床，但是存在部分地区知晓率低、实施程度不佳等问题。另外，国外的相关指南常常纳入较少的中国证据，且制订过程未考虑我国国情。目的：分析儿童超说明书用药处方情况（以甘肃省为例），并梳理儿童指南中超说明书用药推荐意见的证据现状，在此研究基础上，制订我国儿童超说明书用药管理的循证指南，探索该指南的实施研究，识别其主要推荐意见的实施影响因素，为开发指南匹配的干预措施提供研究基础。方法：对甘肃省196家二级、三级医院的门诊儿童处方开展回顾性、多中心的横断面研究。根据国家卫生健康委员会发布的《医院处方点评管理规范（试行）》和药品说明书开展处方点评，明晰儿童超说明书用药处方现状，通过分析相关临床实践指南和Micromedex?梳理儿童超说明书用药处方的循证医学证据情况，采用Logistic回归分析儿童超说明书用药的影响因素，根据儿童超说明书用药处方占比测算其经济负担。以2018年1月1日～2020年12月31日发表的儿童临床实践指南为研究对象，开展横断面研究，对其中超说明书用药推荐意见进行分析。系统检索PubMed、Embase、中国知网（ChinaNationalKnowledgeInfrastructure，CNKI）、万方以及中国生物医学文献数据库（ChineseBioMedicalLiteratureDatabase，CBM），限制语言为中、英文。系统分析了纳入临床实践指南的基本特征，超说明书用药的药品信息及证据分布特点。对指南中出现的超说明书药品或药品分类频次进行排名，并分析所有超说明书药品的世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）《儿童基本药物目录》（2021年）收录情况。中国儿童超说明书用药管理指南的制订方法和流程主要基于2014年WHO发布的《世界卫生组织指南制订手册》及中华医学会发布的《制订/修订lt;临床诊疗指南gt;的基本方法及程序》，依据指南研究与评价工具（AppraisalofGuidelinesforResearchandEvaluationⅡ，AGREEⅡ）和国际实践指南报告规范清单（ReportingItemsforPracticeGuidelinesinhealthcare，RIGHT）的具体要求制订及报告指南。指南启动时间为2021年4月12日，定稿时间为2021年12月21日。指南实施的影响因素研究，应用解释性序列的混合研究方法。量性研究采用问卷调查法，针对指南的21条推荐意见，邀请主要利益相关方，针对推荐意见开展现状、实施迫切程度、实施困难程度进行选择和评分，遴选出难度最高（开展的困难程度得分最高）、同时最为临床急需（开展的迫切程度得分最高）的推荐意见。质性研究采取专家访谈法，针对遴选出的推荐意见，开展关键利益相关方专家访谈。根据实施研究综合框架（ConsolidatedFrameworkforImplementationResearch,CFIR），识别出指南的实施影响因素，并运用实施研究综合框架——实施变革的专家建议汇编（ConsolidatedFrameworkforImplementationResearch-ExpertRecommendationsforImplementingChangecompilation，CFIR-ERIC）工具映射实施策略。结果：甘肃省门诊儿童超说明书用药处方研究，共纳入196家医疗机构114844张处方，超说明书用药处方39480张（34.4%，39480/114844），有循证医学证据的处方占比为25.6%（18130/39480）。最常见的诊断是呼吸系统疾病（40.1%,15831/39480），最常见的超说明书用药类型为超适应证（49.6%,25891/52213）。共有超说明书药品1171种，排名第一的是多酶片（3.50%,1790/51172）。测算超说明书用药的经济负担为106116.3元/天，未基于循证医学证据的用药经济负担为81940.6元/天。三级医院的超说明书用药处方占比比二级医院低20%（OR=0.80，95%CI0.78-0.82），外用制剂的超说明书用药处方占比比其他制剂高58%（OR=1.58,95%CI1.53-1.63），高级职称医生开具超说明书用药处方的处方占比比初级职称医生高27%（OR=1.27,95%CI1.23-1.31）。儿童指南中超说明书用药分析显示，纳入的108篇中文儿童临床实践指南包含364条超说明书用药相关的推荐意见，可以明确识别推荐意见者不足10%，且标注引证文献的超说明书用药推荐意见不足25%。通过对引证文献类型为临床实践指南、专家共识和综述的文章进行溯源，发现存在原始引文无引证文献、无对应药品、推荐意见不一致等诸多问题。近90%的中文临床实践指南没有进行证据分级，且所有临床实践指南均未报告其存在潜在的利益冲突。纳入的66篇英文儿童临床实践指南，包含605条超说明书用药相关的推荐意见，约85%的推荐意见的参考文献的研究类型呈现多样化，约15%的推荐意见无引证文献。采用制订与评价分级系统（Gradingofrecommendationsassessment,developmentandevaluation，GRADE）的推荐意见中，超过1/4的推荐意见是基于低质量或极低质量证据作出的强推荐。报告存在利益冲突的临床实践指南中，近15%的推荐意见在推荐相应的儿童超说明书药品方面，可能存在潜在利益冲突。中、英文儿童临床实践指南中的超说明书用药类型均以超适应证、超人群和超年龄为主，超说明书药品品种、药品信息的报告内容均存在较大差异。中国儿童超说明书用药管理指南聚焦了儿童超说明书用药管理的八个主题，包括：儿童超说明书用药管理的一般原则和特点、建立儿童超说明书用药专家委员会、证据评估、风险-效益评估步骤和注意事项、知情同意、临床循证实践、不良反应风险的监测和评估以及患者教育，最终形成了21条推荐意见。指南实施的影响因素研究显示，指南推荐意见的开展率为41.1%～65.5%。根据推荐意见的实施迫切程度和实施困难程度总得分排名，筛选的关键推荐意见为6.2、6.1、4.1、1.2和4.2（详见指南原文）。据实施科学CFIR框架识别了指南实施的57个影响因素，包括27个促进因素，29个阻碍因素以及1个中性因素。这些影响因素较为复杂，针对不同的职业角色存在诸多的共同障碍。根据CFIR-ERIC图谱，匹配出了针对主要阻碍因素的实施建议，包括：定制实施策略、改进推荐意见的适应性、呼吁国家卫生行政部门推动、构建医生-药师沟通网络等。结论：儿童门诊超说明书用药较为普遍，甘肃省的儿童门诊超说明书用药处方中，3/4的处方存在不合理用药的可能，造成每日约8万元的医疗经济负担。儿童临床实践指南中普遍存在超说明书用药的推荐意见，可能存在误导临床实践的风险，主要表现为：部分推荐意见没有引文作为依据，低等级证据质量生成强推荐意见缺乏透明度，超说明书药品的报告内容差异较大，可能存在潜在的利益冲突。因此，制订的中国儿童超说明书用药管理指南，采取循证医学方法学，基于当前最佳证据，旨在解决我国儿童超说明书用药管理的关键临床问题，规范我国儿童超说明书用药管理，并为未来中国的医疗政策提供建议。针对该指南实施的影响因素研究，探索了医院中不同角色的卫生技术工作者关于儿童超说明书用药的管理经验，一定程度上缩短了儿童超说明书用药管理实施领域的研究差距，促进了临床实践指南的实践转化，并为其它国家开展儿童超说明书用药管理提供了一定参考。收起

关键词 : 超说明书用药儿童患者循证医学实施科学不良反应风险

5. 幽门螺杆菌感染和根除对胃肠道菌群的影响及益生菌的调节作用

[学位论文] 彭超南昌大学 2021年博士导师: 吕农华共256页

摘要 : 背景与目的：胃癌是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其发生是多因素多步骤过程，受到遗传因素、环境因素和幽门螺杆菌（Hp）感染的影响。Hp是常见的胃内致病菌，感染了全球50%以上的人口，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴... 展开背景与目的：胃癌是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其发生是多因素多步骤过程，受到遗传因素、环境因素和幽门螺杆菌（Hp）感染的影响。Hp是常见的胃内致病菌，感染了全球50%以上的人口，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌的发生密切相关，几乎100%的Hp感染者有慢性活动性胃炎，然而仅1-3%的Hp感染者最终发展成了胃癌，说明存在除了Hp以外的潜在因素在胃癌发生过程中发挥重要作用。近年来，大量研究证实菌群与疾病的发生发展密切相关。胃癌发生过程中胃内菌群的紊乱也逐渐被关注，然而，目前研究主要为对胃黏膜菌群的研究，而缺乏对胃液菌群的研究。此外，胃内微环境变化（包括胃酸、菌群和代谢产物）与胃癌发生的风险之间的关联也需要进一步研究。Hp感染影响宿主胃肠道菌群结构，可能参与了Hp诱导的胃内炎症和胃癌发生。既往研究表明益生菌可以抑制炎症，调节免疫和菌群。益生菌抑制Hp感染诱导的炎症已有报道，然而益生菌对Hp感染介导的胃癌发生风险的影响尚未见文章报道。根除Hp能够显著降低胃癌发生风险，根除方案中包含的PPI和抗生素已被证实可以影响胃肠道菌群。胃肠道菌群紊乱与疾病发生关系密切，因此大规模根除Hp应该考虑对于胃肠道菌群的影响。因此，本论文的目的是基于人体水平研究胃内微环境（胃酸、胃黏膜菌群、胃液菌群、代谢产物）改变与胃癌发生风险的关联，以及根除Hp对人体胃肠道菌群的短期和长期影响；基于动物水平研究益生菌对于Hp感染小鼠胃癌发生风险的影响和可能机制，以及益生菌对于根除Hp后胃肠道菌群、肠道屏障功能及短链脂肪酸含量的调节作用。材料与方法： 1.收集胃炎、肠上皮化生（肠化）、胃癌患者的胃黏膜、胃液样本，提取样本DNA，扩增目标16SrRNAV4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析胃黏膜和胃液菌群结构变化。应用笔形pH计检测胃液pH,盐酸萘乙二胺法检测胃液亚硝酸盐含量，循环酶法检测胃液中总胆汁酸含量，气相色谱分析法检测胃液中各短链脂肪酸含量。 2.构建HpPMSS1感染的INS-GAS小鼠模型，布氏肉汤灌胃的INS-GAS小鼠作为对照组，分别给予含唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的益生菌饮水和普通饮水。处死小鼠前一天收集粪便样本，处死小鼠后，应用笔形pH计测量小鼠胃内pH，取小鼠胃组织。Steiner银染法检测小鼠胃内Hp定植，HE染色观察小鼠胃内病理改变，免疫组化染色检测胃组织炎症指标CD45表达。提取小鼠胃组织和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析小鼠胃内和肠道菌群结构变化。提取小鼠胃组织RNA，富集mRNA，将mRNA片段化后反转合成cDNA，连接adaptor后进行片段筛选和文库富集，在IlluminaHiSeqXten高通量测序平台上机测序。应用生物信息学方法分析胃组织转录水平的变化。使用RT2ProfilerPCRArray方法分析小鼠胃组织“炎症应答和自身免疫”相关基因的表达情况，并使用蛋白质印迹法检测胃组织炎症免疫相关蛋白TLR2和IL-17的表达。 3.招募无症状的年轻成年志愿者，13C尿素呼气试验检测志愿者Hp感染状态，收集志愿者粪便。对Hp阳性志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本，之后给予Hp阳性者14天铋剂四联方案（艾司奥美拉唑20mg，枸橼酸铋钾220mg，阿莫西林1000mg，呋喃唑酮100mg，均为bid）根除Hp，在根除结束后4周时复查13C尿素呼气试验，收集Hp根除志愿者粪便，对Hp根除志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本。根除结束后24周，收集Hp根除志愿者粪便，对Hp根除志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本。提取志愿者胃黏膜和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析志愿者胃肠菌群结构变化。 4.构建HpPMSS1感染的C57BL/6小鼠模型，布氏肉汤灌胃的C57BL/6小鼠作为对照组，分别给予Hp根除药物和生理盐水处理14天。给予根除药物处理结束的小鼠益生菌（屎肠球菌R0026和枯草芽孢杆菌R0179）处理4周。收集根除药物处理结束时和益生菌处理结束时的小鼠粪便、胃黏膜和结肠样本。应用Giemsa染色法检测小鼠胃内Hp定植情况，HE染色观察小鼠胃组织炎症和病理情况。提取小鼠胃组织和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析小鼠胃内和肠道菌群结构变化。应用气相色谱法检测小鼠粪便各SCFA含量，蛋白质印迹法检测小鼠结肠组织紧密连接蛋白Occuludin和Claudin1的表达。结果：（一）胃癌发生过程中的胃内菌群结构和特定代谢产物变化及其与幽门螺杆菌的关系 1.胃癌发生过程中胃黏膜菌群的变化（1）α多样性分析：胃炎患者胃黏膜菌群的Chao指数和Shannon指数与肠化患者均无显著差异（P＞0.05），胃癌患者胃黏膜菌群的Chao指数显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.01）和肠化胃黏膜组（P＜0.001），Shannon指数也显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.01）和肠化胃黏膜组（P＜0.01）。胃癌旁组织和癌组织菌群Chao指数无显著差异，而胃癌胃黏膜组的Shannon指数显著高于癌旁胃黏膜组（P＜0.05）。此外，我们还将胃癌旁和胃炎患者胃黏膜菌群α多样性进行比较，发现癌旁胃黏膜组Chao指数显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.05），Shannon指数无显著差异。Hp感染患者的胃黏膜菌群Chao指数（P＜0.001）和Shannon指数（P＜0.001）显著降低。胃炎组和肠化组中Hp阳性者Chao指数和Shannon指数均显著低于Hp阴性者（allP＜0.001）。然而，在胃癌患者组，Hp阳性与Hp阴性者胃黏膜菌群的Chao指数和Shannon指数均无显著差异。（2）β多样性分析：基于不同距离算法的PCoA分析，发现胃炎胃黏膜组和肠化胃黏膜组的样本不能有效区分开，而胃癌胃黏膜组和其他两组样本有明显分离的趋势（ANOSIM，Bray-curtisP=0.001，weightedUniFracP=0.001）。胃癌组织胃黏膜样本于癌旁样本呈分离的趋势（ANOSIM，Bray-curtisP=0.07，weightedUniFracP=0.02）。癌旁和胃炎患者胃黏膜菌群结构存在显著差异（ANOSIM，Bray-curtisP=0.01，weightedUniFracP=0.03）。Hp阳性组与Hp阴性的胃黏膜样本成明显分离的状态（Adonis，EuclideanP=0.001;ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）。其中胃炎组（Adonis，EuclideanP=0.001;ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）和肠化组（ANOSIM，Bray-curtisP=0.001，weightedUniFracP=0.001）里Hp阴性和阳性样本分离效果很好，而胃癌组次之（ANOSIM，Bray-curtisP=0.057，weightedUniFracP=0.002）。（3）LEFSe分析：胃炎组中Bacillus显著高于其他肠化组和胃癌组，而在胃癌阶段，Lactobacillus，Prevotella，Veillonella，Haemophilus，Fusobacterium，Neisseria等菌属相对丰度显著升高。胃癌组织中Clostridia，Prevotella_7，Prevotella，Johnsonella，Solobacterium等相对丰度显著高于癌旁组织。胃炎胃黏膜组中Bacillus相对丰度显著高于癌旁组，而癌旁胃黏膜菌群中包括Lactobacillus，Prevotella_7，Veillonella，Fusobacterium，Neisseria等相对丰度升高。Hp阳性胃黏组中仅Helicobacter相对丰度显著高于Hp阴性胃黏膜组，而Bacillus，Lactobacillus，Rothia，Streptococcus，Fusobacterium等菌属相对丰度显著降低。在胃炎、肠化和胃癌三个阶段，Hp阴性亚组中Helicobacter相对丰度均显著低于Hp阳性亚组，而Hp阴性胃炎胃黏膜组中Lactococcus，Bacillus，Pseudomonas，Streptococcus，Neisseria等菌属相对丰度显著高于Hp阳性亚组。Hp阴性肠化胃黏膜组中Lactococcus，Bacillus，Acinetobacter，Streptococcus，Ralstonia等菌属相对丰度显著高于Hp阳性肠化胃黏膜组。相比于Hp阳性胃癌胃黏膜组，Hp阴性胃癌胃黏膜组中Streptococcus，Brevibacterium，Ochrobactrum，Ralstonia，和Rothia等菌属相对丰度显著升高。 2.胃癌发生过程中胃液菌群的变化（1）α多样性分析：胃炎胃液组的Shannon指数与肠化胃液组无显著差异，肠化胃液组的Shannon指数与胃癌胃液组无显著差异，而胃癌胃液组的Shannon指数显著低于胃炎胃液组（P＜0.01）。Hp阴性和阳性的患者胃液菌群Chao指数和Shannon指数均无显著差异。Hp阳性胃炎胃液组的Chao指数和Shannon指数与Hp阴性胃炎胃液组均无显著差异；Hp阳性的肠化胃液组的Chao指数和Shannon指数与Hp阴性肠化胃液组均无显著差异，然而Simpson指数显著低于Hp阴性肠化胃液组（P＜0.05）。（2）β多样性分析：基于非加权的UniFrac距离的PCoA显示胃炎和肠化组胃液样本比较接近，而胃癌组呈分离的趋势（ANOSIM，unweightedUniFracP=0.001），而基于加权UniFrac距离的PCoA分析中三组样本非常接近，难以有效区分开（ANOSIM，weightedUniFracP=0.17）。基于非加权的UniFrac距离的PCoA中Hp阳性和Hp阴性的样本距离非常接近（ANOSIM，weightedUniFracP=0.399），而基于加权UniFrac距离的PCoA分析显示Hp阳性和阴性胃液菌群具有显著差异（ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）。基于Euclidean距离和weightedUniFrac距离的PCoA分析发现Hp阳性和阴性的胃炎胃液组样本分布具有显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.02，weightedUniFracP=0.018）。同样，基于Euclidean距离和weightedUniFrac距离对肠化和胃癌胃液的样本进行PCoA分析，结果显示：Hp阳性和Hp阴性的肠化胃液样本的分布具有显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.001，weightedUniFracP=0.001），而Hp阳性和Hp阴性的胃癌胃液样本分布无显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.06，weightedUniFracP=0.17）。（3）LEFSe分析：胃炎阶段Pseudomonas，methylobacterium，Treponema_2，Pelomonas，Acidovorax等菌属相对丰度显著高于肠化和胃癌阶段，而在肠化阶段Ochrobactrum，Campylobacter，Acinetobacter，Paracoccus和Staphylococcus等菌属相对收起

关键词 : 幽门螺杆菌胃肠菌群转录组学根除治疗益生菌

6. 低糖环境下糖异生关键酶PCK1缺失促进肝癌细胞增殖的机制研究

[学位论文] 向进 2022年博士导师: 唐霓共233页

摘要 : 背景：原发性肝癌目前在恶性肿瘤中发病率居第六位，死亡率排名第三位。原发性肝癌包括肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌，以及其他罕见类型[1]。HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）或丙... 展开背景：原发性肝癌目前在恶性肿瘤中发病率居第六位，死亡率排名第三位。原发性肝癌包括肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌，以及其他罕见类型[1]。HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）或丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染、摄入黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、超重、2型糖尿病和吸烟等[1]。由于早期HCC往往无症状，HCC患者通常在中期或晚期才被确诊，往往会错过治愈性治疗（肝切除或肝移植）的机会。对于晚期HCC患者，治疗选择包括局部消融、放疗、化疗和分子靶向治疗[2]。其中，多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是最早用于治疗晚期HCC的一线药物。但是激酶抑制剂等分子靶标药物疗效有限，易产生耐药，仅少部分患者获益，索拉非尼仅将患者的总生存期延长2.8个月[3]。由于目前化疗药物的疗效非常有限，因此深入了解肿瘤发生机制和开发新靶点小分子化疗药物迫切需要。众所周知，持续增殖是肿瘤最重要的特征之一[4]。在实体瘤内，无限增殖的肿瘤细胞过度消耗营养物质，肿瘤内部血管形成畸形等因素导致了周围环境营养限制（例如葡萄糖缺乏）[5,6]。因此，为了维持细胞增殖和存活，肿瘤细胞发生代谢重塑以供应能量需求和生物分子合成[7,8]。1920年，德国生物化学家OttoWarburg首次提出，肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也倾向于将葡萄糖转化为乳酸。这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应[9]，其特征是葡萄糖摄取和乳酸产生增强，尽管产生ATP的效率较低，这个过程中产生的代谢中间物可用于合成肿瘤生长所需的生物大分子[9]。作为糖酵解的逆向反应，糖异生是非糖的前体物质（如丙酮酸、乳酸和甘油等）合成葡萄糖或糖原的过程，主要发生在肝脏，对肿瘤生长和代谢重编程也起着重要调控作用[10,11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（Phosphoenolpyruvatecarboxykinase1，PCK1）是糖异生的第一步限速酶，催化草酰乙酸（OAA，Oxaloacetate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，Phosphoenolpyruvate）。已有报道发现，PCK1与肿瘤发生发展密切相关，但是在不同组织来源的肿瘤中发挥着不同的作用。肝癌细胞中PCK1呈现低表达，使用糖皮质激素上调PCK1表达可以抑制HCC细胞增殖[12]。我们课题组前期研究也发现，在低糖条件下，过表达PCK1能够激活AMPK/p27信号通路，阻滞细胞周期G1向S期转换和抑制HCC增殖[13]。然而，在黑色素瘤细胞中过表达PCK1反而促进了糖代谢的逆向流动，增加更多的中间代谢物合成以满足其旺盛的生长需求[14]。PCK1在结肠癌中高表达，能够促进结肠癌的生长[15,16]。上述研究提示，PCK1在糖异生器官（肝脏和肾脏）中表现出抗肿瘤作用，但在非糖异生器官来源的肿瘤中却具有促肿瘤作用。然而，PCK1在不同组织来源肿瘤中的差异表达、生物学功能以及潜在的调控机制尚不明确。氧连接N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，调控蛋白质的稳定性、酶活性、蛋白间相互作用和亚细胞定位等，从而调节各种生物学效应[17]。与磷酸化修饰不同的是，O-GlcNAc糖基化修饰由唯一的O连接N-乙酰葡糖胺转移酶（O-GlcNActransferase，OGT）或O-连接N-乙酰葡糖胺去除酶（O-GlcNAcase，OGA）将N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）连接到（或去除）靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸的羟基上[18]。二磷酸尿苷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）是蛋白质O-GlcNAc修饰的供体底物，来源于己糖胺生物合成途径（Hexosaminebiosyntheticpathway，HBP），由葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰辅酶A和核苷酸合成[19]。O-GlcNAc修饰水平主要决于细胞UDP-GlcNAc的浓度，因此被视作为一种重要的细胞营养感受器[17]。谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰基转移酶（Glutamine-Fructose-6-PhosphateAmidotransferase1,GFAT1）是HBP通路的第一个限速酶和关键调控节点，可将果糖-6-磷酸（F6P）和谷氨酰胺（Glutamine）催化为6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸。据报道，激活AMPK可以磷酸化GFAT1蛋白243位丝氨酸，从而抑制GFAT1酶活性，降低HBP流量和蛋白O-GlcNAc修饰水平[20]。O-GlcNAc修饰在多种类型的肿瘤中增加，并与肿瘤的发生发展密切相关，被视作是肿瘤细胞新的重要特征之一[21]。越来越多癌症相关的蛋白，例如c-Myc、β-Catenin、snail1，被证明存在O-GlcNAc修饰，通过多种机制调控肿瘤的致瘤信号通路，包括：细胞增殖、能量合成、血管生成、组织侵袭和转移、细胞死亡、氧化和代谢应激等[22]。细胞O-GlcNAc修饰的深入研究有助于认识蛋白质翻译后修饰在肿瘤发生发展中的作用，解释肿瘤细胞如何感受营养状态并协调基因表达，进一步加深我们对肿瘤发生机制的理解，为寻找肿瘤诊断和预后相关标志物提供新的线索，并有助于开发新的防治策略。因此，我们提出以下科学问题：葡萄糖缺乏条件下糖异生关键酶PCK1是否通过调控细胞HBP和蛋白O-GlcNAc修饰，进而调控肝癌细胞的增殖？实验方法： 1.观察低糖环境下，干预PCK1表达对肝癌细胞蛋白O-GlcNAc修饰水平的影响。首先在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞系敲除或过表达PCK1，并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12小时，观察不同糖条件下PCK1敲除或过表达后对O-GlcNAc修饰水平和细胞增殖的影响。同时，构建Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。通过荧光定量PCR和WesternBlot实验观察PCK1对HBP代谢和O-GlcNAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的mRNA和蛋白表达水平的影响。另外，在肝癌细胞中过表达PCK1酶失活突变体G309R观察O-GlcNAc修饰水平变化，明确PCK1的代谢酶活性是否在调节O-GlcNAc修饰水平中起着关键作用。 2.检测PCK1敲除细胞内OAA和UDP-GlcNAc水平。采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析技术检测低糖条件下PCK1对TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-GlcNAc和UTP从头合成途径代谢物水平的调控。外源添加OAA、天门冬氨酸（Asp），观察是否影响肝癌细胞UDP-GlcNAc合成、O-GlcNAc修饰水平及细胞增殖。GOT2是催化OAA生成Asp的重要代谢酶，GOT2抑制剂AOA处理PCK1敲除细胞，进一步明确观察是否能阻断此过程，确定PCK1敲除后通过OAA累积促进Asp及UDP-GlcNAc生物合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺，检测m+4OAA和m+3UDP-GlcNAc等代谢物水平变化。 3.观察过表达PCK1能否激活p-AMPK/p-GFAT信号轴。通过WesternBlot实验观察敲除或过表达PCK1对p-AMPK/p-GFAT1信号轴及O-GlcNAc修饰水平变化。AMPK激活剂或敲低基因技术干预p-AMPK/p-GFAT1信号轴确定PCK1抑制GFAT1活性、O-GlcNAc修饰和肝癌细胞增殖是否依赖于p-AMPK。采用靶标代谢物质谱技术检测DON干预p-GFAT1关键酶后PCK1敲除细胞UDP-GlcNAc水平变化。 4.观察PCK1敲除后对CHK2O-GlcNAc修饰水平的影响。为了进一步寻找在PCK1敲除的细胞中哪些重要蛋白发生O-GlcNAc修饰促进肝癌细胞的增殖，我们首先构建了OGT融合Flag标签重组质粒。低糖处理PCK1敲除肝癌细胞，并过表达OGT融合Flag标签蛋白，采用免疫沉淀联合质谱检测靶标结合蛋白。IP-MS富集并筛选出重要的调控周期蛋白Checkpointkinase2（CHK2）。采用Co-IP及IP实验验证CHK2是否与OGT发生相互作用，是否发生O-GlcNAc修饰。采用质谱技术初步鉴定、IP实验确证CHK2O-GlcNAc修饰的重要位点。构建CHK2修饰位点突变质粒验证CHK2发生O-GlcNAc修饰的关键位点。 5.明确CHK2发生O-GlcNAc修饰后其生物学功能的改变。采用泛素化IP实验观察过表达PCK1对CHK2泛素化修饰的影响。蛋白合成抑制剂CHX处理观察发生CHK2O-GlcNAc修饰对其蛋白稳定性的影响。通过Co-IP实验、寡聚体交联和分子动力学模拟实验观察发生CHK2O-GlcNAc修饰对二聚体形成情况的影响。敲除或过表达PCK1、O-GlcNAc修饰调控或外源添加PEP或OAA，进一步观察对CHK2及下游p-CDK2/p-Rb通路激活和肝癌增殖影响情况。进而在PCK1/CHK2双敲除肝癌细胞中恢复野生型CHK2或位点突变CHK2观察下游信号轴和细胞增殖情况。同时，构建裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。 6.在临床肝癌组织样本中分析PCK1与肿瘤大小、O-GlcNAc修饰和p-Rb表达的相关性。临床数据和40对临床原发性肝癌与癌旁组织样本中，我们采用Westernblot蛋白定量分析PCK1表达、O-GlcNAc修饰、CHK2O-GlcNAc修饰。同时分析PCK1表达与肿瘤大小、O-GlcNAc修饰和p-Rb表达的相关性。 7.在DEN/CCl4诱导Pck1肝脏敲除小鼠肿瘤模型中观察干预HBP后肿瘤增殖情况。繁殖筛选出Pck1肝脏特定敲除纯合子小鼠，采用DEN联合CCl4诱导肝癌形成。诱导8个月后观察小鼠DEN诱导肿瘤结节数，通过质谱分析、WesternBlot、sWGA等技术检测UDP-GlcNAc、蛋白O-GlcNAc修饰和CHK2O-GlcNAc修饰水平。观察给予HBP相关抑制剂DON及谷草转氨酶2抑制剂AOA治疗对小鼠肝肿瘤生长的影响。结果： 1.低糖环境下肝癌细胞PCK1敲除后促进蛋白O-GlcNAc修饰水平：在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞中分别敲除或过表达PCK1，并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12h，发现5mM葡萄糖条件下PCK1敲除促进O-GlcNAc修饰和细胞增殖，过表达PCK1结果相反。在Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证了相同结论。进一步发现，PCK1并不能影响HBP和O-GlcNAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的mRNA水平和蛋白表达；有趣的是，过表达PCK1酶失活突变体G309R并不能改变O-GlcNAc修饰，说明PCK1的酶活性可能在调节O-GlcNAc修饰水平中起着关键作用。 2.PCK1敲除后通过增加OAA累积促进UDP-GlcNAc合成：采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析发现低糖条件下PCK1下调TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-GlcNAc以及UTP合成相关代谢。OAA和Asp增加UDP-GlcNAc合成和O-GlcNAc修饰水平及促进肝癌细胞增殖，PCK1敲除细胞给予GOT2（GOT2，催化OAA生成Asp）抑制剂AOA能阻断此过程，说明PCK1敲除后通过OAA累积增加Asp和UDP-GlcNAc合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺分析发现过表达PCK1减少肝癌细胞中OAAm+4、Orotatem+4和UDP-GlcNAcm+3，此验证了上述结论。 3.过表达PCK1通过激活p-AMPK/p-GFAT1信号轴减少UDP-GlcNAc合成和O-GlcNAc修饰水平：过表达PCK1增收起

关键词 : 肝细胞肝癌己糖胺生物合成 O-GlcNAc修饰检查点激酶2

7. 四川攀枝花自然封闭人群血脂水平与踝臂指数的调查研究

[学位论文] 李宪凯同济大学 2007年硕士导师: 胡大一共233页

摘要 : 目的：调查四川省攀枝花自然封闭人群的血脂水平和踝臂指数，研究当地人群的血脂状况，为临床降脂提供证据，观察当地人群的PAD患病率。方法：选取四川渔门镇、渔门二坪、红宝苗族、团结乡、洼落乡和岩口彝族六地区居民1194名，年龄为18.59～86.14岁... 展开目的：调查四川省攀枝花自然封闭人群的血脂水平和踝臂指数，研究当地人群的血脂状况，为临床降脂提供证据，观察当地人群的PAD患病率。方法：选取四川渔门镇、渔门二坪、红宝苗族、团结乡、洼落乡和岩口彝族六地区居民1194名，年龄为18.59～86.14岁，空腹抽血测定血脂水平，并测量其ABI，然后对有效数据进行统计学分析。结果：入选居民总体TC为4.14±0.94mmol/L、LDL-C为2.03±0.63mmol/L、TG为1.80±1.68mmol/L、HDL-C为1.47±0.41mmol/L，其中LDL-C水平属于1997年我国的《血脂异常防治指南》建议的“合适范围”，并且明显低于NCEP-ATPIII建议的冠心病或冠心病等危症的LDL-C治疗目标值2.6mmol/L。其中渔门二坪和岩口彝族的LDL-C水平最低为1.86mm01/L，几乎接近ATPIII中极高危组的降脂指标1.82mmol/L；红宝苗族的HDL-C最高为1.70±0.46mmol/L，明显高于1.40mmol/L。生活水平相对较高的渔门镇的LDL-C水平明显高于其他任何地区(P值均<0.01)。渔门镇的TC、LDL-C和TG明显高于其它五乡(P<0.001)，但HDL-C却相反(P=0.003)。Logistic回归校正相关因素后，血脂四项在渔门镇和其它五乡之间有显著的统计学意义(P值均<0.001)。入选居民的总体ABI范围为0.09～1.50(mean±SD：1.04±0.12)，按美国PAD治疗指南的标准分级后，0.00～0.40占0.1%、0.41～0.90占10.1%、0.91～0.99占20.3%、1.00～1.29占66.7%、>1.3占2.4%，即绝大部分为J下常值范围，在18.59～86.14岁的人群中PAD的患病率为10.2%，低于国外大量调查显示的12%。各地区的ABI均值均在1.03以上。渔门镇的ABI均值明显低于其它五乡(1.03±0.12vs1.06±0.11，P<0.001)，其PAD所占比例也明显高于其它五乡(13.1%vs6.5%，K0.001)。年龄、性别、血脂四项和高血压史、冠心病史、糖尿病史、脑卒中史和吸烟史在PAD和非PAD组中未显出统计学差异(P>0.05)。结论：自然封闭人群的LDL-C水平很低，且居民处于健康状态，这个LDL-C水平可作为临床降脂的证据；自然封闭人群的ABI均值绝大部分属于正常值范围，其PAD患病率较低。收起

关键词 : 四川攀枝花封闭人群血脂水平踝臂指数

8. α-微管蛋白1C链(TUBA1C)在胰腺癌中的表达和作用及其机制研究

[学位论文] Mugahed Abdullah Hasan Albahde 浙江大学 2020年硕士导师: 王伟林共224页

摘要 : 背景：胰腺癌的恶性程度很高，是致死率最高的恶性实体肿瘤之一。2016年，美国新增约5.3万例胰腺癌患者，其中4.2万人死亡。超过85%的患者确诊时已经处于肿瘤晚期，失去了进行根治性手术的机会，只能选择其他姑息治疗方式，如化疗。当前，针对胰... 展开背景：胰腺癌的恶性程度很高，是致死率最高的恶性实体肿瘤之一。2016年，美国新增约5.3万例胰腺癌患者，其中4.2万人死亡。超过85%的患者确诊时已经处于肿瘤晚期，失去了进行根治性手术的机会，只能选择其他姑息治疗方式，如化疗。当前，针对胰腺癌治疗的药物并非靶向治疗胰腺肿瘤，特异性很低，临床使用效果差。因此，深入研究胰腺癌发生发展的内在的分子机制，确定精准治疗的药物靶点是目前胰腺癌研究的紧迫目标。微管蛋白是一种多功能的细胞骨架蛋白，其具有多种类型，TUBA1C是α-微管蛋白的一种亚型，与微管结构的组织有关。最新研究表明，TUBA1C与体内多种肿瘤的细胞增殖和细胞周期存在密切关系。同时，多项研究提示TUBA1C在多种肿瘤中表达增高且发挥促癌作用，如TUBA1C在肝细胞肝癌中表达上调并导致患者预后较差。当前，有关TUBA1C在胰腺癌发生发展中的生物学功能和临床意义的研究尚处空白。本课题以TUBA1C为主要研究切入点，围绕TUBA1C在胰腺癌中的表达、在胰腺癌发生中的作用以及其分子机制等多个层面进行研究，从而评估TUBA1C作为胰腺癌分子诊断标记物和治疗靶点的潜在应用价值。另外，通过体内和体外实验探索针对微管的靶向抗肿瘤药物在抑制胰腺癌细胞增殖和细胞周期的发生发展中的作用，探究胰腺癌药物治疗的新靶点，为临床实践治疗胰腺癌提供参考。目的：研究胰腺癌组织和癌旁组织中TUBA1C基因的差异表达，通过体内、体外实验探讨TUBA1C在胰腺癌进展中的生物学机制及其在胰腺癌作为分子标记物的可能性。通过体内、体外实验探索BNC105对胰腺癌细胞的作用机制。方法：通过公开数据集(TCGA)和基因表达谱数据动态分析(GEPIA)，检测TUBA1C在胰腺癌中的mRNA水平及其与患者总生存率(OS)的关系。釆用免疫组织化学染色(IHC)检测配对组织中TUBA1C在蛋白水平上存在的表达差异。通过免疫蛋白印迹(western blot，WB)验证PDAC细胞系中TUBA1C的表达情况。通过edgeR软件包筛选TUBA1C高/低基因群中DEGs的生物信息学数据。通过KEGG探索TUBA1C相关通路的调控作用和相关基因。采用siRNA针对胰腺癌AsPC-1和BxPC-3细胞系，构建TUBA1C敲低的细胞模型。同时，在PANC-1细胞株中构建TUBA1C过表达的细胞模型。运用CCK-8、EDU、克隆形成实验、凋亡实验、周期实验、迁移和侵袭等实验，研究TUBA1C在体外水平对胰腺癌细胞周期、增殖、凋亡所产生的影响。通过WB探讨TUBA1C影响胰腺癌细胞内各种功能蛋白的变化。利用BxPC-3构建BALB/c裸鼠异种移植模型，研究TUBA1C敲低后对肿瘤生长产生的影响。体外实验中，细胞株AsPC-1和BxPC-3分别加入BNC105作为实验组和对照组。通过CCK8实验进行细胞IC50及活力检测。流式细胞仪和WB等实验方法检测BNC105对PDAC细胞周期和凋亡的影响。利用之前构建的动物模型观察BNC105对肿瘤生长的作用。通过HE染色观察胰腺癌细胞形态，并且对Ki-67进行IHC染色来确定BNC105抑制胰腺癌细胞增殖的作用。结果：利用TCGA和GEPIA进行生物信息分析，结果显示TUBA1C在胰腺癌组织的mRNA和蛋白质水平上均高于癌旁组织。本研究中，IHC染色显示TUBA1C蛋白的表达在胰腺癌组织中高于癌旁组织，并且TUBA1C高表达与p53基因的表达显著相关(P=0.008)，单因素分析显示患者OS与肿瘤分级(P=0.007)，N期(P=0.007)和TNM期(P=0.011)密切相关。 KEGG分析表明TUBA1C过表达主要与细胞周期信号通路密切相。TUBA1C通过细胞周期信号途径促进胰腺癌细胞体外增殖并抑制细胞凋亡。体外实验，在敲低TUBA1C表达的细胞系中胰腺癌细胞增殖受到抑制。同时，动物实验中TUBA1C低表达抑制了异种移植的裸鼠胰腺癌模型肿瘤细胞的生长增殖能力。 CCK8体外实验显示BNC105显著抑制胰腺癌细胞增殖，流式细胞术与WB结果显示BNC105可诱导AsPC-1和BxPC-3细胞株G2/M期阻滞，并能调节G2/M周期相关蛋白Cdc2/CyclinB1，Cdc7的表达。BNC105可诱导胰腺癌细胞调亡，并能提高PARP，caspase-3，caspase-7的表达水平。此外，BNC105体内实验显示其对胰腺癌有抑制作用。裸鼠肿瘤标本的Ki-67和HE结果显示BNC105显著促进胰腺癌细胞凋亡。结论： TUBA1C在胰腺癌组织中高表达，且这种高表达与胰腺癌患者的不良预后相关。TUBA1C是潜在的促胰腺癌基因，通过细胞周期信号通路，促进胰腺癌细胞的增殖，抑制胰腺癌细胞的凋亡。体内外实验证实BNC105对胰腺癌存在抑制作用，其作用机制为通过细胞周期G2/M期阻滞以及诱导细胞发生调亡。收起

关键词 : 胰腺癌 &alpha -微管蛋白1C链细胞周期细胞增殖

9. 北京市120症状监测系统的设计研究

[学位论文] 任赟静北京协和医学院(中国医学科学院) 2004年博士导师: 黄建始共223页

摘要 : 背景:实现早期预警是当前公共卫生监测的紧要任务之一,是有效防控严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)、其它急性传染病以及生物恐怖事件暴发的前提.传统的公共卫生监测由于依靠病例的临床或实验室确诊,在提高及时性方面受到... 展开

关键词 : 症状监测症状监测系统北京急救中心急救信息系统 120来电记录

10. NAMPT-AS调控三阴性乳腺癌进展转移的分子机制研究

[学位论文] 张瀚文山东大学 2020年博士导师: 杨其峰共219页

摘要 : 背景: 在世界范围内，乳腺癌是公认的女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年攀升，严重威胁全球女性的身心健康。乳腺癌是一种形态学和遗传学高度异质性的疾病，异质性一方面已成为评估和治疗乳腺癌的主要阻碍，另一方面也推动了基于分... 展开背景: 在世界范围内，乳腺癌是公认的女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年攀升，严重威胁全球女性的身心健康。乳腺癌是一种形态学和遗传学高度异质性的疾病，异质性一方面已成为评估和治疗乳腺癌的主要阻碍，另一方面也推动了基于分子分型的乳腺癌个体化治疗。结合基因表达谱分析，乳腺癌目前主要可以分为3种亚型:激素受体阳性/ERBB2阴性（约70％），ERBB2阳性（约15％～20％）和三阴性（Triple Negative Breast Cancer，TNBC;激素受体及ERBB2均阴性;约15％）。TNBC患者具有发病年龄轻、恶性程度高、复发转移早、临床预后差的特点，而且由于TNBC患者缺少上述受体的表达，相对于其他患者而言，不能从针对激素受体阳性患者的内分泌治疗及抗ERBB2的靶向治疗中获益。目前化疗是TNBC的主要辅助治疗手段，但仅有20％的TNBC患者对标准化疗方案具有敏感性，且相当一部分患者会出现化疗耐药:化疗耐药后更易发生远处转移而表现为预后不良。TNBC的进展转移是乳腺肿瘤学界持续关注的焦点，阐明其分子机制将对提升治疗效果、改善临床预后具有非常重要的意义。 TNBC的进展转移是一个多基因参与、受到表观遗传学调控的多维度的生物学过程。大量研究结果显示，非编码RNA(non-coding RNA)的异常表达在恶性肿瘤的表观遗传学调控方面起到了至关重要的作用。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)作为非编码RNA中的重要组成部分，已经成为癌症研究的前沿研究领域。LncRNA是一类长度大于200个核苷酸(nucleotide，nt)，不具有蛋白质编码功能的RNA转录本的总称;其在转录组中占据了极大的比例，包含了增强子RNA，snoRNA宿主，基因间转录本和与其他基因重叠的转录本，正义或反义转录本等。从细胞定位的角度看，定位在细胞质中的LncRNA主要起内源性microRNA海绵的作用，以竞争性结合靶基因;而定位在细胞核中的LncRNA则充当蛋白-蛋白相互作用的支架，蛋白-DNA相互作用和染色质修饰的脚手架。从LncRNA与其靶基因在基因组位置的角度来看，LncRNA可能在邻近基因通过顺式（in cis）作用，而在远距基因中通过反式（in trans）作用进行表达调控。不到十年前，strand-specific高通量测序的出现证明了某些LncRNA是蛋白质编码基因的自然反义转录产物。近一半的蛋白编码基因具有特异的反义LncRNA(antisense LncRNA，asLncRNA)，因此经常观察到asLncRNA通过顺式或反式作用调控正义编码基因。因此，沉默asLncRNAs可能是干预致癌驱动基因的潜在切入点。为了寻找与TNBC进展转移密切相关的LncRNAs，对人类基因组数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、基因表达综合库(Gene Expression Omnibus，GEO)进行深入挖掘，选取了在TNBC中高表达的NAMPT-AS(NAMPT-antisense，NAMPT-AS)作为目标LncRNA。结合对ENCODE数据库(Encyclopedia of DNA Elements database,ENCODE),FANTOM5(Function Annotation Of The Mammalian Genome，FATOM)项目所得结果的生物信息学分析，通过体内和体外实验，临床标本对NAMPT-AS的功能和作用机制进行了深入的研究。方法及结果: 在本课题中，拟进一步深入研究NAMPT-AS在TNBC的进展转移的过程中的作用，具体内容包括以下四个部分: 第一部分乳腺癌中NAMPT-AS的表达分析研究方法: 1.与TNBC进展转移相关LncRNA的筛选 1.1 通过TCGA数据库，GEO数据库，齐鲁医院乳腺癌样本库分析TNBC及非TNBC中LncRNA的表达谱; 1.2 利用GEO数据库分析TNBC及正常样本中NAMPT-AS的表达量，利用qPCR技术检测各类乳腺癌及正常乳腺细胞系中NAMPT-AS的表达量; 结果: 1.筛选得到TNBC中高表达的NAMPT-AS 1.1 基于TCGA数据库、GEO数据库、齐鲁医院乳腺癌样本库的分析结果显示，NAMPT-AS在TNBC中的表达量明显高于非TNBC及正常乳腺组织; 1.2 qPCR定量显示在TNBC细胞系中NAMPT-AS的表达量明显高于其他亚型的乳腺癌及正常乳腺细胞系。第二部分 NAMPT-AS调控NAMPT的分子机制的研究方法: 1.生物信息学分析NAMPT-AS参与调控的信号通路 1.1 利用二代RNA-Seq方法对干扰了NAMPT-AS的MDA-MB-468细胞系进行测序分析; 1.2 利用单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine，MDC)荧光染色及免疫荧光染色的方法对LC3的表达量进行检测;利用电镜观察细胞内自噬囊泡;利用Western Blot检测mTOR信号通路相关分子的变化。 2.NAMPT-AS在细胞内的定位 2.1 利用生物学信息学预测、核质分离及RNA-FISH的方法对NAMPT-AS定位; 结果: 1.NAMPT-AS通过mTOR信号通路影响自噬表型 RNA-Seq显示NAMPT-AS与mTOR信号通路相关，并通过Western Blot、MDC、免疫荧光LC3染色及电镜观察均显示NAMPT-AS与自噬表型密切相关; 2.NAMPT-AS招募转录因子POU2F2至启动子区调控NAMPT的转录 2.1 根据LncAtlas的生物信息学预测、核质分离及RNA-FISH实验均证明NAMPT-AS在细胞质和细胞核均有分布; 2.2 NAMPT-AS通过招募转录因子POU2F2促进NAMPT-AS和NAMPT的转录第三部分 NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT的功能研究方法: 1.NAMPT-AS的体外功能分析 1.1 利用MTT、流式细胞术、克隆形成及Transwell实验分析分别干扰和过表达NAMPT-AS后，细胞的增殖、凋亡及浸润转移情况; 1.2 利用Western Blot实验分析细胞增殖、凋亡有关蛋白的表达情况; 2.利用数据库分析目标miR-548b-3p与患者OS的关系结果: 1.NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT功能的体外实验 1.1 NAMPT-AS高表达促进增殖和浸润转移、抑制凋亡 1.2 miR-548b-3p的生物学功能分析 2.NAMPT-AS//NAMPT功能的体内实验 2.1 体内实验证明NAMPT-AS促进肿瘤的增殖和转移 2.2 体内皮下荷瘤实验证明NAMPT过表达组肿瘤的体积和质量明显大于对照组。第四部分 NAMPT-AS/NAMPT的临床预后价值方法: 1.NAMPT-AS与TNBC进展转移的关系 1.1 通过TCGA数据库、齐鲁医院标本库收集的乳腺癌样本及对应患者的临床预后信息确立NAMPT-AS的表达量与总体生存(Overall survival，OS)及无复发生存(Relapse-free survival，RFS)的关系; 1.2 通过TCGA数据库，分析在TNBC患者中NAMPT-AS的表达量与预后的关系; 2.临床样本验证NAMPT对于TNBC患者预后的影响通过组织芯片的免疫组化染色对NAMPT的表达水平进行定量，并分析在临床样本中NAMPT表达水平与OS及乳腺癌特异性生存(Breast cancer specific survival，BCSS)的关系; 结果: 1.基于TCGA公共数据库分析NAMPT-AS的临床预后价值 1.1 通过对TCGA数据库的生存分析及齐鲁医院收集的乳腺癌样本的RNA表达量的检测显示，在包含各亚型的乳腺癌患者总体中，NAMPT-AS的高表达与OS、RFS不良密切相关; 1.2 TCGA数据库分析显示，在TNBC患者中，NAMPT-AS的高表达也与不良OS及RFS密切相关; 2.基于组织芯片分析NAMPT的临床预后价值临床样本染色分析证明NAMPT高表达与整体乳腺癌及TNBC患者的OS及BCSS预后不良密切相关。结论: 1.LncRNA NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT的表达水平与TNBC的进展转移密切相关; 2.NAMPT-AS/NAMPT高表达与整体乳腺癌及TNBC患者的预后不良密切相关，有望作为乳腺癌患者临床预后预测的重要因子; 3.体内外实验均证明NAMPT-AS/NAMPT通过影响mTOR信号通路影响自噬进而调控TNBC的进展转移; 4.体外实验证明NAMPT-AS从转录及转录后两个层面调控NAMPT的表达，一是招募转录因子POU2F2促进NAMPT的转录，二是竞争性结合miR-548b-3p减少NAMPT的降解从而促进NAMPT表达水平的升高。收起

关键词 : 三阴性乳腺癌肿瘤进展转移烟酰胺磷酸核糖转移酶核苷酸分子机制