中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 廖一波华南理工大学 2020年硕士导师: 林影共97页

摘要 : 烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是人体内合成NAD+的重要前体，通过转化为NAD+来发挥其生理功能，与多种疾病紧密相关，其中NMN用于治疗衰老性疾病及延缓衰老是其研究最为热门的领域之一。NMN已逐渐应用于保健食品和医学药物，用于... 展开烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是人体内合成NAD+的重要前体，通过转化为NAD+来发挥其生理功能，与多种疾病紧密相关，其中NMN用于治疗衰老性疾病及延缓衰老是其研究最为热门的领域之一。NMN已逐渐应用于保健食品和医学药物，用于预防与治疗代谢性疾病，心脑血管疾病，衰老性疾病等。但由于合成问题，目前以NMN为主要成分的产品价格仍十分昂贵。合成NMN的方法中，相比于化学法合成NMN，生物法因无有机溶剂残留也不存在手性问题，成为最环保无公害的合成方法。但仍然存在一些限制，例如高效率的酶制剂的缺乏，反应底物带来的高昂成本等问题。本研究旨在通过基于生物信息学的酶分子筛选方法，筛选高效合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase，Nampt，EC 2.4.2.12)，该酶是催化烟酰胺(Nicotinamide，NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl-pyrophosphate，PRPP)直接合成NMN的酶，在此基础上将该酶初步应用于单酶、多酶联用催化合成NMN。具体研究结果如下： (1)基于生物信息学的酶分子筛选方法挖掘Nampt 迄今为止，已被KEGG酶数据库收录的Nampt超过600条，只有来源Homosapiens，Musmusculus和Rattusnorvegicus的Nampt被表征，难以满足合成NMN的需求。本研究以来源Meiothermusruber和Methanobacteriumsp.PtaU1.Bin097的Nampt的氨基酸序列出发，通过NCBI数据库的BLASTP功能筛选Nampt，并将这些来源的Nampt在SWISS-MODEL平台进行同源建模，再使用DiscoveryStudio软件，采用分子对接手段，通过模拟不同来源的Nampt与底物小分子NAM在结合口袋中的结合，选定对接结果中打分系统-CDOCKER_ENERGY值高的Nampt作为候选酶。在分子对接评分结果中，哺乳动物中-CDOCKER_ENERGY值最高的是来源Homosapiens的Nampt(hNampt )，细菌中-CDOCKER_ENERGY值最高的是来源Comamonadaceaebacterium的Nampt(cNampt )和来源Meiothermusruber的Nampt(cNampt )。将这三个来源的Nampt作为候选酶。 (2)烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达与酶学性质分析以上述三个来源的Nampt的基因为研究对象，在大肠杆菌中表达，纯化获得Nampt蛋白。对三个来源的Nampt酶学性质进行分析。以NAM为底物，hNampt的Km为0.12μmol/L，Vmax为0.11μmoL/(min·mg)，kcat为0.051/s。mNampt的Km为0.39μmol/L，Vmax为3.20μmoL/(min·mg)，kcat为1.391/s。cNampt的Km为0.14μmol/L，Vmax为3.10μmoL/(min·mg)，kcat为1.381/s。与已表征的Nampt相比，本文表达的mNampt和cNampt的kcat/Km远高于其他来源的Nampt，更适用于工业酶法合成NMN。其中cNampt的kcat/Km为9.86×1061/s，是目前已表征的Nampt中最高的。将测定的动力学参数与上述酶分子筛选方法中分子对接结果进行探讨，三个来源的Nampt分子对接结果中-CDOCKER_ENERGY大小排序与测定的酶kcat/Km值的大小排序一致，拟合度高。说明本研究前期的酶分子筛选方法在筛选催化性质好的Nampt效果良好，验证了该筛选方法的可用性。 (3)单酶、多酶联用催化合成NMN 将来源Comamonadaceaebacterium的Nampt初步进行单酶催化合成NMN，结果显示，单酶法合成NMN中，通过补加一次底物PRPP，10min时NMN产量34mg/L，转化效率为204mg/(L·h)。通过文献分析酶学性质较好的核糖磷酸焦磷酸激酶(Ribose phosphate pyrophosphokinase，Prs)，来源H.sapiens的Prs(hPrs )Km值远高于其他物种，来源Pyrobaculumcalidifontis的Prs(pPrs )比酶活测定最高，将这两个来源的Prs在大肠杆菌中表达，纯化，作为双酶法合成NMN中与Nampt联用的酶。其中hPrs成功的可溶性形式表达，pPrs未能以可溶性形式表达。将hPrs和cNampt联用催化合成NMN，180min时NMN产量29mg/L，转化效率为9.67mg/(L·h)。通过文献分析酶学性质较好的核糖激酶(Ribokinase，Rbks)，来源Escherichiacoli的Rbks(eRbks )的底物亲和性是原核来源的Rbks中最好的，来源H.sapiens的Rbks(hRbks )的底物亲和性是哺乳动物来源的Rbks中最好的，且kcat/Km值是目前表征的Rbks中最高，将这两个来源的Rbks在大肠杆菌中表达，纯化，作为三酶法合成NMN中与Nampt、Prs联用的酶。将eRbks和hPrs、cNampt联用催化合成NMN，240min时NMN产量24mg/L，转化效率为6mg/(L·h)。将hRbks和hPrs、cNampt联用催化合成NMN，180min时NMN产量24mg/L，转化效率为8mg/(L·h)。从单酶到多酶来合成NMN，随着参与反应的酶个数增加，虽然产量有所降低，双酶法降至单酶法的85%，三酶法降至单酶法的71%。但底物总成本也得到大幅度降低，其中双酶法降至单酶法的1%，三酶法降至单酶法的0.4%。收起

关键词 : 烟酰胺单核苷酸同源建模分子对接烟酰胺磷酸核糖转移酶

2. NAD+合成限速酶NRK1及NAMPT在脂肪肝中的作用和机制研究

[学位论文] 范蕊新乡医学院 2019年硕士导师: 千新来;熊熙文共76页

摘要 : 肝脏是脂肪代谢的主要场所之一，脂肪性肝病正严重威胁人类的健康，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，且发病率在不断提高，发病年龄日趋年轻化。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）是氧化还原反应的辅酶也是激活各... 展开肝脏是脂肪代谢的主要场所之一，脂肪性肝病正严重威胁人类的健康，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，且发病率在不断提高，发病年龄日趋年轻化。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）是氧化还原反应的辅酶也是激活各种酶类家族所需要的底物，包括sirtuins蛋白家族和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerases，PARPs）。膳食补充NAD+前体烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）或烟酰胺核苷（nicotinamide riboside，NR）不仅能预防代谢性疾病、神经退行性疾病，还可以预防哺乳动物随年龄增长导致的生理性NAD+水平的下降。烟酰胺核苷激酶1（nicotinamide riboside kinase1，NRK1）不仅在哺乳动物细胞中作为NR代谢的限速酶，而且对于将细胞外NMN转化为能够被细胞吸收及参与NAD+合成的NR也是必不可少的。肝脏作为调节许多NR代谢的效应器官也显示出较高的NRK1水平，然而，NRK1是否真正介导肝脏增加NAD+在体内的储备很大程度上仍是未知的。此外NAD+补救合成途径中，细胞内利用NAD+来执行反应的酶，比如sirtuins、PARPs等，会消耗细胞内的NAD+而产生烟酰胺（nicotinamide，NAM）。而烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamidephosphoribosyltrans ferase，NAMPT）是将NAM转化为中间产物NMN的限速酶，能够循环利用反应产生的NAM而重新合成NAD+。NAMPT通过其合成NAD+的能力，影响sirtuins、PARPs等依赖NAD+活性的酶，从而调节细胞代谢。最近一些研究表明，NAMPT能够调节非酒精性脂肪肝（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）疾病过程中的脂质合成，酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）与NAFLD具有相似的组织病理学和分子生物学特征，但NAMPT在ALD中的作用尚不清。目的：通过构建非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝小鼠模型，及原代肝细胞的分离培养实验，分别研究NRK1及NAMPT在调节非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝中肝脏NAD+生物合成和脂质代谢的作用。方法： 1.研究NRK1在非酒精性脂肪肝中的作用及机制（1）通过细胞培养检测腺病毒NRK1的感染效率及NAD+的表达水平。（2）采用尾静脉注射方式感染小鼠，检测NRK1在体内的感染效率及对小鼠的肝脏脂质代谢产生的影响。采用高脂饮食方式构建肥胖小鼠模型，检测小鼠肝脏NRK1的表达水平。通过给予肥胖小鼠模型尾静脉注射腺病毒，评估小鼠血糖、胰岛素敏感性及肝脏脂质代谢变化，检测NRK1对于饮食造成的脂肪肝的作用。（3）通过给予年老小鼠同样的腺病毒注射分析小鼠肝脏脂质代谢及糖代谢，检测NRK1对衰老产生的影响。 2．NAMPT在酒精性脂肪肝中的作用及机制（1）通过细胞培养方式，检测酒精对于NAMPT表达的影响及NAMPT腺病毒的感染效率。（2）构建酒精性脂肪肝小鼠模型，检测酒精对于体内NAMPT表达的影响，同时检测NAMPT腺病毒的感染效率及过表达NAMPT对于酒精性脂肪肝的影响。（3）研究NAMPT是否是通过影响沉默信息调节因子2相关酶1（Sirtuin1，SIRT1）活性来调节酒精导致的肝脏脂肪变性。结果： 1．NRK1在非酒精性脂肪肝中的作用及机制（1）NRK1在原代肝细胞中的表达效率与内源性NRK1相比在mRNA水平提高了将近10倍。过表达NRK1能明显促进以NR为前体物质的NAD+补救合成途径的表达（p＜0.05）。（2）过表达NRK1能升高肝脏中NAD+的水平（p＜0.05），降低小鼠肝脏甘油三酯含量（p＜0.05），干扰NRK1则刚好相反，而血中的甘油三酯含量未受影响。高脂饮食导致小鼠肝脏NRK1表达明显降低（p＜0.05），而过表达NRK1，则将增加NAD+的表达，降低小鼠肝脏中脂合成基因的表达，升高脂肪酸β氧化基因的表达，同时改善肥胖小鼠血糖水平及胰岛素敏感性，降低血液中及肝脏中甘油三酯的含量（p＜0.05）。（3）衰老同样导致小鼠肝脏中NRK1表达降低（p＜0.05），过表达NRK1，将改善衰老引起的肝脏NAD+含量的降低及甘油三酯含量的增加，同时降低血糖水平，增强胰岛素敏感性（p＜0.05）。 2．NAMPT在酒精性脂肪肝中的作用及机制（1）酒精能够上调原代肝细胞中甘油三酯的含量，下调NAD+及NAMPT的表达（p＜0.05），而过表达NAMPT细胞状态将得到改善（p＜0.05）。（2）小鼠酒精肝模型表明：酒精能诱导小鼠肝脏甘油三酯及总胆固醇脂含量升高，损害肝功能，降低NAMPT的表达及NAD+的含量（p＜0.05），而过表达NAMPT将改善酒精引起的肝功能损害及肝脏脂肪变性等现象（p＜0.05）。（3）酒精喂养也能导致沉默信息调节因子2相关酶1（Sirtuin1，SIRT1）及沉默信息调节因子2相关酶6（Sirtuin6，SIRT6）在小鼠肝脏中表达降低（p＜0.05），而在酒精性脂肪肝小鼠模型中过表达NAMPT不仅可以改善酒精诱导的小鼠肝脏脂肪变，而且还增强了SIRT1的活性及NAD+的含量，而干扰SIRT1能阻断NAMPT对于酒精诱导的肝脏脂肪变性的改善作用（p＜0.05）。结论： 1.过表达NRK1能够改善由于饮食及衰老造成的脂肪性肝疾病及胰岛素抵抗。 2.过表达NAMPT能够上调SIRT1通路的活性，减轻由于过量饮酒造成的脂肪肝疾病。收起

关键词 : 脂肪肝烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺核苷激酶1 烟酰胺磷酸核糖转移酶调控机制

3. 基于NAMPT的新型靶向蛋白降解剂的设计、合成与生物活性研究

[学位论文] 程俊飞海军军医大学 2023年博士导师: 盛春泉共275页

摘要 : 以蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimera,PROTAC)为代表的靶向蛋白降解(Targeted protein degradation,TPD)技术为人们提供了一种全新的治疗手段,它不再是仅对靶蛋白产生抑制作用，而是将其完全消除，其技术优势在于用量小，理论上催化剂... 展开以蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimera,PROTAC)为代表的靶向蛋白降解(Targeted protein degradation,TPD)技术为人们提供了一种全新的治疗手段,它不再是仅对靶蛋白产生抑制作用，而是将其完全消除，其技术优势在于用量小，理论上催化剂量即可循环降解靶蛋白，在难成药靶点和耐药突变靶点等领域有广阔的应用前景。近几年来PROTAC技术飞速发展，研究者已经针对70多个靶标进行了PROTAC的合理设计，但是PROTAC同样具有其局限性，比如对肿瘤细胞的选择性差，存在E3连接酶导致的耐药，靶标范围有限等，对此研究者开发出了一系列靶向蛋白降解的新技术，包括光控PROTAC、多靶点PROTAC、基于PROTAC的偶联物等，以及基于溶酶体的降解技术，这一些新型靶向蛋白降解技术很好地弥补了传统PROTAC的不足。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)生物合成的限速酶，在细胞能量代谢途径中起着不可或缺的作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞生长和增殖更快，导致能量代谢更高，对NAD+的需求增加。因此，NAMPT被认为是一个有吸引力的癌症治疗靶点。课题组前期针对NAMPT设计合成了具有优秀体内外抗肿瘤活性的NAMPTPROTAC,研究过程中发现目前对降解过程的检测手段单一复杂，此外我们还希望进一步提升PROTAC降解的精度和效率，并探索多途径降解NAMPT的可能性。对此，本论文提出了多维度降解NAMPT的新策略，实现可视化降解，选择性降解以及多途径的自噬降解。一.靶向NAMPT蛋白的诊疗一体化PROTAC分子设计、合成及抗肿瘤活性研究为了解决无法实时监测降解过程的问题，本课题在荧光NAMPT小分子抑制剂Ⅱ-A1的基础上通过合理设计，合成目标化合物11个。大部分PROTAC分子保留了原型化合物优秀的NAMPT体外抑酶活性，其中化合物Ⅱ-B4的活性最优(NAMPT IC50=41.9nM),并且它还表现出优秀的NAMPT降解活性和体外抗肿瘤活性(A2780 DC50=8.4 nM,A2780 IC50=12.1 nM),且具有更强的细胞内NAD+水平下调能力。与原型化合物相比，化合物Ⅱ-B4的荧光强度提高五倍，同时表现出更为显著的环境敏感性，在与NAMPT蛋白结合后荧光强度显著提升，而随着NAMPT蛋白降解，化合物的荧光强度降低,这一结果证实化合物Ⅱ-B4可以同时检测并降解A2780细胞中的NAMPT蛋白，能够作为一种实时追踪降解过程的工具分子。在体内药效学实验中,化合物Ⅱ-A1组小鼠在给药第九天后由于药物毒性而全部死亡，而化合物Ⅱ-B4组小鼠未出现死亡，证明其毒性较低。化合物Ⅱ-B4在A2780裸鼠移植瘤模型中表现出优秀的抑瘤活性(TGI=73％),表明化合物Ⅱ-B4表现出比抑制剂更低的毒性以及更好的体内抗肿瘤药效。本项工作设计了第一类诊疗一体化的NAMPT荧光PROTAC,实现了降解过程的可视化，为后续降解机制研究和靶点成药性探索提供了一种高效的诊疗一体化小分子探针，同时也给PROTAC的药物开发拓展了新的研究方向。二.正负调控NAD+的光控PROTAC分子设计、合成及生物活性研究针对现有光控转换型 PROTAC(Photo-switchable PROTAC,PS-PROTAC)无法避免对正常细胞产生抑制毒性的问题，本课题基于NAMPT激动剂Ⅲ-3以及高活性NAMPT降解剂Ⅲ-2设计得到目标化合物22个。首先证明了基于NAMPT激动剂的PROTAC同样具有降解活性，随后引入光控元件二甲基吡唑偶氮苯设计了一系列PS-PROTAC。其中化合物Ⅲ-D1具有最强的降解活性以及体外抗肿瘤活性(A2780DC50=3nM,A2780 IC50=7.6 nM),并且相较于化合物Ⅲ-2表现出更快的降解速度，更广的可降解浓度范围以及显著提升的PK性质，在A2780裸鼠移植瘤模型中表现出优秀的抑瘤活性(TGI=75.1％)。而化合物Ⅲ-B3同样表现出优秀的降解活性以及体外抗肿瘤活性(A2780DC50=217nM,A2780IC50=122 nM),并且化合物Ⅲ-B3 作为PS-PROTAC具有较高的构型转换率和较长的热弛豫半衰期，在不同波长的光照下能够实现对细胞内NAMPT蛋白以及NAD+表达水平的正负调控。此外，化合物Ⅲ-B3具有优秀的PK性质，在5 mg/kg的剂量下能够显著抑制肿瘤生长(TGI=80.8％,Ⅳ,QD),并且通过光照可以表现出不同程度的体内抗肿瘤活性，更重要的是该化合物不会表现出NAMPT抑制剂结构的毒性，能够实现更精准的高时空分辨率调控。本项工作设计了第一类基于NAMPT激动剂的PS-PROTAC,首次实现了对NAMPT蛋白以及NAD+的可逆调控，能够作为工具分子促进对NAMPT蛋白以及NAD+的研究，同时为PS-PROTAC的设计提供了新的策略。此外化合物优秀的PK性质、体内抗肿瘤活性以及较低的毒性为靶向NAMPT的新药研发提供了新的思路。三.基于自噬-溶酶体途径的新型降解剂的设计和作用机制验证本课题通过对自噬降解剂Ⅳ-1的活性验证证明了化合物Ⅳ-1能够有效地降解 NAMPT并产生优秀的细胞抗肿瘤活性。降解机制研究证实，化合物Ⅳ-1能够在细胞内同时与自噬相关蛋白LC3以及NAMPT蛋白结合，并通过自噬-溶酶体途径诱导NAMPT蛋白降解，虽然其活性相较于此前设计的NAMPTPROTAC没有优势，但是本工作证明了 NAMPT也可以通过自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosomal pathway,ALP)有效降解，为靶向NAMPT的降解提供了一种替代策略，同时证明了化合物41是一个有效的LC3蛋白结合配体，为自噬小体绑定化合物(Autophagosome-tethering compound,ATTEC)的设计提供了新的工具分子以及实例。但是，由于化合物41是一种高活性的纺锤体驱动蛋白(Kinesin spindle protein,KSP)抑制剂，需要进一步优化以提高它对LC3蛋白的结合力和选择性。目前正在应用化合物41尝试降解更多的药物靶标，并对其进行结构优化。此外，本章还进行了靶向BET的自噬靶向嵌合体(Autophagy-targeting chimera,AUTOTAC)的探索，虽然最终的降解活性不理想，但是初步证明了该策略的可行性，后续还在进一步探索其他p62配体。本章为基于自噬-溶酶体途径的新型靶向蛋白降解提供了设计思路和实例。收起

关键词 : 靶向蛋白降解剂合成工艺烟酰胺磷酸核糖转移酶生物活性

4. 氧化应激条件下NAMPT对肺癌H460细胞活力的影响及机制研究

[学位论文] 王艳辉天津医科大学 2021年硕士导师: 任丽共92页

摘要 : 目的癌症是全球范围内死亡的主要原因，肺癌依然是发生率和死亡率最高的肿瘤。肿瘤缺氧-复氧、炎症的微环境以及肿瘤本身基因的突变和代谢的重编程导致肿瘤细胞处于氧化应激的环境中，已经确定氧化应激在肿瘤发生发展及治疗中都具有重要作用。NAD+（烟... 展开目的癌症是全球范围内死亡的主要原因，肺癌依然是发生率和死亡率最高的肿瘤。肿瘤缺氧-复氧、炎症的微环境以及肿瘤本身基因的突变和代谢的重编程导致肿瘤细胞处于氧化应激的环境中，已经确定氧化应激在肿瘤发生发展及治疗中都具有重要作用。NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）是体内各种代谢酶的辅酶，参与多种氧化还原反应。NAMPT（烟酰胺磷酸核糖转移酶）是合成NAD+的限速酶，在多种肿瘤中高表达且在肿瘤细胞的增殖，转移中都发挥一定的功能。NAD+/NAMPT在氧化应激中的作用已经有研究报道，但是在肺癌中，NAMPT在氧化应激时所发挥的功能及机制尚不清楚。在本研究中，我们探讨了在H460细胞中，NAMPT在氧化应激条件下对细胞活力的影响及机制。方法在第一部分中，通过CCLE(CancerCellLineEncyclopedia)网站预测各种肿瘤细胞中NAMPT的表达情况。用Westernblot（WB）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测常用癌细胞系NAMPT的表达量。慢病毒的方法构建敲低NAMPT的H460细胞系H460scramble、H460shNAMPT-1和H460shNAMPT-2。CCK-8法检测细胞活力，平板克隆实验检测细胞克隆形成能力。在第二部分中，通过DCFH-DA荧光探针，JC-1荧光探针，RT-qPCR法分别检测不同组细胞的ROS，线粒体膜电位（?Ψm）及线粒体DNA（mtDNA）拷贝数。在第三部分中，通过WB检测凋亡蛋白caspase3、clevead-caspase3、caspase9、bax、bcl-2的蛋白表达情况，流式细胞术检测各组凋亡细胞的比例。在第四部分中，分别通过NAD+/NADH检测试剂盒、DCFH-DA荧光探针、JC-1荧光探针，RT-qPCR、CCK-8法，检测补充NMN对细胞NAD+含量、ROS含量及细胞活力的影响。结果（1）NAMPT在非小细胞肺癌中高表达。成功构建敲低NAMPT的H460细胞系，H460scramble、shNAMPT-1和shNAMPT-2。在100μMH2O2处理的条件下，与scramble组相比，shNAMPT组细胞活力显著降低，克隆形成能力明显下降。（2）在100μMH2O2处理的条件下，与scramble组相比，shNAMPT组细胞ROS显著增多，?Ψm显著降低，线粒体DNA拷贝数显著降低。con组与FK866组比较，FK866组显示出相同的趋势。（3）在100μMH2O2处理的条件下，与scramble组相比，shNAMPT组细胞凋亡蛋白caspase-9、caspase-3、clevead-caspase3、bax的蛋白表达量增加，抗凋亡蛋白bcl-2的蛋白表达量下降，细胞凋亡比例增加。con组与FK866组比较，FK866组显示出相同的趋势。（4）在100μMH2O2处理的条件下，补充NMN可以显著恢复shNAMPT组细胞NAD+含量、ROS水平及细胞活力。con组与FK866组比较，FK866组显示出相同的趋势。结论（1）氧化应激条件下，NAMPT对维持H460细胞活力更重要。（2）氧化应激条件下，NAMPT调节细胞ROS水平，线粒体膜电位(?Ψm)、mtDNA。（3）氧化应激条件下，NAMPT介导H460细胞的凋亡。（4）氧化应激条件下，NAMPT通过影响NAD+的生成进而调控H460细胞的活力。收起

关键词 : 肺癌氧化应激烟酰胺磷酸核糖转移酶活性氧线粒体 H460细胞

5. STEAP4介导NAMPT对肥胖型非酒精性脂肪肝引起的氧化应激的调节机制

[学位论文] 王祎华中农业大学 2022年硕士导师: 陈小冬共88页

摘要 : 肥胖是诱发非酒精性脂肪肝的关键因素。近年来，随着世界上肥胖人群的迅速扩大，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）在全球大多数国家已发展为最普遍的肝脏代谢疾病。然而关于NAFLD的发病机制与治疗靶点虽然经过多年的大量研究，... 展开肥胖是诱发非酒精性脂肪肝的关键因素。近年来，随着世界上肥胖人群的迅速扩大，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）在全球大多数国家已发展为最普遍的肝脏代谢疾病。然而关于NAFLD的发病机制与治疗靶点虽然经过多年的大量研究，但仍未被研究透彻。于是，代谢疾病相关的基因与蛋白一直以来都是重点的研究对象。对于这些基因与蛋白之间相互关系与调控机制的研究，对彻底挖掘NAFLD发病机制具有重要意义。烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamidephosphateribosetransferase，NAMPT）是NAD合成限速酶。一直以来，NAMPT的功能都与代谢和氧化应激联系在一起，尤其是在一些代谢疾病中发挥着重要的作用。但是它在NAFLD发病过程中涉及到的调节机制并未被完全解释。前列腺6次跨膜上皮抗原4（Sixtransmembraneantigensfortheprostateepithelium4，STEAP4）作为一个与炎症和代谢都密切相关的关键蛋白，同样对调节代谢疾病具有重要的作用。本研究通过饲喂高脂饮食诱导小鼠肥胖建立NAFLD模型，在活体水平探究NAMPT以及其下游蛋白SIRT1在NAFLD发展过程中所起的作用。同时在细胞水平通过超表达，抑制剂以及游离脂肪酸刺激探究NAMPT与STEAP4之间的调控关系以及在NAFLD发展过程中的调控机制。获得的主要研究结果如下： 1.利用高脂饲料饲喂小鼠的同时对小鼠腹腔注射FK866抑制小鼠体内NAMPT表达，发现抑制NAMPT促进了小鼠的肥胖与肝脏脂质积累。并且肥胖与FK866也使抗氧化相关转录因子NRF2及其下游靶蛋白的表达量下降，同时导致肝脏MDA含量上升以及SOD酶活性下降。这表明抑制NAMPT促进了肥胖小鼠NAFLD的发展。 2.肥胖小鼠肝脏中STEAP4表达量下降，抑制NAMPT表达也会使小鼠肝脏中STEAP4的表达量明显下降。这说明在肝脏中NAMPT与STEAP4具有一定的调控关系。 3.通过高脂饲喂诱导Sirt1+/-小鼠从而建立NAFLD模型，发现Sirt1敲减极大程度促进了小鼠肥胖与胰岛素抵抗，同时也促进了肝损伤与肝脂肪变性；而且Sirt1敲减也明显导致组成细胞抗氧化防御系统的蛋白例如NRF2的表达量的下降。而且，SOD酶活性也有明显的下降。这说明Sirt1敲减加重了肥胖小鼠的肝脏氧化应激。总之，Sirt1敲减促进了肥胖小鼠NAFLD的发展。 4.与抑制NAMPT得出的结果类似，Sirt1敲减也明显降低了小鼠肝脏STEAP4的表达。这说明，在肝脏中SIRT1与STEAP4也具有调控关系。 5.在NAMPT过表达的小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞中可以发现，SIRT1与STEAP4表达量上升。但是在NAMPT过表达的同时抑制SIRT1的活性，STEAP4的表达量不会随着NAMPT过表达而上升。并且，抑制SIRT1的活性使调控STEAP4转录的转录因子C/EBPβ的表达量下降，SIRT1与C/EBPβ具有相互作用，检测C/EBPβ乙酰化水平发现SIRT1可以去乙酰化修饰C/EBPβ。总之，NAMPT通过SIRT1去乙酰化C/EBPβ调控STEAP4的表达与功能。 6.使用PA刺激STEAP4过表达的Hepa1-6细胞可以发现，STEAP4过表达可以抵抗PA诱导的细胞内脂质积累，ROS大量产生和线粒体膜电位下降。但是，抑制NAMPT之后，STEAP4过表达无法缓解PA导致的细胞损伤。PA可以促使NRF2向细胞核积累，但是会导致NRF2总表达量下降，损害细胞抗氧化体系。STEAP4过表达会提高NRF2的总量和细胞核中的聚集量，恢复细胞正常的抗氧化能力。但是，在抑制NAMPT之后，STEAP4不再具有对NRF的调控能力。总之，本研究发现，NAMPT通过调控NAD合成调控SIRT1的活性，SIRT1去乙酰化修饰C/EBPβ促进STEAP4转录，进而使NRF2表达量上升并向细胞核中聚集，调控下游抗氧化酶的转录，从而保持细胞抗氧化系统的运作，使细胞在氧化应激中存活。收起

关键词 : 非酒精性脂肪肝氧化应激烟酰胺磷酸核糖转移酶

6. 烟酰胺磷酸核糖转移酶在创伤性脑损伤中的作用及机制研究

[学位论文] 黄曦雯南方医科大学 2023年硕士导师: 王汉东共72页

摘要 : 研究背景:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI）是世界各地人群死亡和残疾的主要原因，目前尚无针对TBI有效的治疗方法和策略，因此，深入研究TBI的致病机制，对寻找新的治疗策略、改善TBI患者神经功能具有重大意义。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Niac... 展开研究背景:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI）是世界各地人群死亡和残疾的主要原因，目前尚无针对TBI有效的治疗方法和策略，因此，深入研究TBI的致病机制，对寻找新的治疗策略、改善TBI患者神经功能具有重大意义。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Niacinamide phosphoribose transferase,Nampt)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸循环生物合成途径中的关键酶。研究表明Nampt特异性激动剂P7C3-A20具有抗凋亡活性，对成年小鼠海马中新生神经前体细胞及神经元具有强大的神经保护特性。但Nampt在TBI后的作用及其可能的机制尚不明确。神经元自噬和凋亡是TBI后继发性脑损伤的重要发病机制。因此,本研究的目的是探索Nampt激活能否在TBI后通过神经元自噬，减少神经元凋亡发挥神经保护作用，并阐明其具体机制。方法:为探究Nampt在TBI后变化情况，我们首先在体内及体外TBI模型中检测伤后不同时间点Nampt的表达情况。我们将成年雄性ICR小鼠，随机分组，小鼠根据不同时间点分为创伤后6h、12h、24h、3d、5d、7d组，运用自由落体法建立TBI模型。体外实验采用细胞划痕模型，根据时间点不同分为以下几组:Sham,3h,6h,12h及24h。通过Western blot技术检测TBI后不同时间点小鼠伤灶附近脑组织及体外细胞模型中Nampt表达水平的变化。然后我们进行Namp的干预实验:将实验动物随机分为假手术组(Sham),TBI组,TBI+安慰剂组(TBI+V),TBI+A20组。在伤后24h对各组小鼠进行神经功能评分和测量脑组织水肿情况。体外实验将永久化小鼠海马神经元细胞系(HT22)随机分为对照组(Sham)，划痕组(scratch),划痕+安慰剂组(scratch+V),划痕+给药组(scratch+A20),用Kit-8(CCK-8)和LDH活性试剂盒检测细胞活性。为了验证激活Nampt的神经保护作用是否与细胞自噬有关，我们将小鼠及HT22细胞随机分组同上4组。采用免疫荧光、Western blot、Nissl染色、电镜和TUNEL染色等方法检测自噬及凋亡相关指标。通过Western blot检验自噬相关蛋白(p-mTOR、mTOR、p-S6K1、S6K1、TSC2、p-TSC2、Sirt-1),探究Nampt激活通过调控TSC2/mTOR/S6K1通路诱导自噬增强的分子机制。结果:Nampt在TBI后的大脑皮层和经划痕处理的HT22神经元中表达量呈先下降再缓慢升高的趋势。体内试验中，与Sham组相比，Nampt蛋白表达在伤后24h达到最低值。体外试验中，与Sham组相比，Nampt蛋白表达在划痕损伤6h达到最低值。免疫组化和免疫荧光染色显示，Nampt在神经元的细胞质和细胞核中表达，主要集中在细胞核中。激活Nampt可缓解TBI引起的神经功能损伤、颅内水肿和神经元变性。Western blot检验及TUNEL染色等结果提示,激活Nampt可缓解TBI体内及体外模型的细胞凋亡。在TBI体内体外模型中，与TBI组相比，TBI+A20组自噬相关蛋白明显升高，同时p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1的比率相对于Sham组明显提高，TBI+A20组则降低，p-TSC2、Sirt-1的蛋白表达降低，给药处理后其表达显著增高，提示Nampt的激活可通过调控TSC2/mTOR/S6K1通路活化自噬来保护神经元。结论:TBI后激活Nampt可能通过增强自噬来减少TBI后的神经元凋亡,产生神经保护作用，该作用或许与调控TSC2/mTOR/S6K1通路有关。收起

关键词 : 创伤性脑损伤烟酰胺磷酸核糖转移酶神经元自噬神经保护

7. Nampt基因多态性对2型糖尿病患者瑞格列奈疗效的影响及其机制研究

[学位论文] 盛飞凤中南大学 2010年硕士导师: 刘昭前共51页

摘要 : 目的：烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase，Nampt)能够调节胰岛β细胞分泌胰岛素的过程，在糖尿病的发生发展中可能发挥重要的直接或间接作用。本课题旨在分析Nampt基因-948G>T和-3186C>T突变在中国湖南地区汉族T2DM人群中... 展开目的：烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase，Nampt)能够调节胰岛β细胞分泌胰岛素的过程，在糖尿病的发生发展中可能发挥重要的直接或间接作用。本课题旨在分析Nampt基因-948G>T和-3186C>T突变在中国湖南地区汉族T2DM人群中的分布频率及其与T2DM发生的关系；探讨这些突变对瑞格列奈治疗T2DM的疗效的影响；在细胞水平研究Nampt对胰岛素分泌的调节作用及其对与胰岛素分泌相关的重要转录因子PDX-1、FoxO1基因表达的影响。方法：采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)对154名2型糖尿病患者和142名健康对照者进行Nampt-948G>T基因型分析，对170名2型糖尿病患者和129名健康对照者进行Nampt-3186C>T基因型分析，随机选择部分样品应用直接测序法验证PCR-RFLP结果；选取-3186C>T不同基因型的40名糖尿病患者进行OATP1B1521T>C基因分型；选择35名OATPlB1521TT基因型相同的个体，每天口服3mg瑞格列奈，持续8周，服药前和服药后第8周末收集血标本5ml;采用酶氧化法测定血糖、放射免疫法测定胰岛素、高效液相色谱法测定HbAlc等反映疗效的指标。用大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测RIN-m5f细胞胰岛素分泌水平。用Real-timePCR的方法检测RIN-m5f细胞PDX-1和FoxO1的mRNA表达水平。用western-blotting的方法检测RIN-m5f细胞PDX-1蛋白表达水平。结果：Nampt基因-948位点在糖尿病患者和健康对照中均未检测到突变。Nampt-3186C>T各基因型及等位基因频率在中国汉族T2DM患者和健康对照人群中的分布差异无统计学意义(P=0.763，P=-0.987)。瑞格列奈治疗后CT基因型患者PINS的升高值明显低于CC基因型与TT基因型(P=0.022)，CT基因型患者CHO的改变与CC基因型及TT基因型比较差异也有统计学意义(P=0.033)。用瑞格列奈10nM+NMN100μM处理RIN-m5f细胞48h，与空白对照及DMSO对照组相比，胰岛素分泌量均显著增高(P=0.023，P=0.029)，与NMN50μM组比较胰岛素分泌量的增高也有统计学意义(P=0.049)。lOμM，50μM和100μM的NMN作用RIN-m5f细胞36h，PDX-1的mRNA表达量均上调(P值分别为0.049，0.006，0.000)，lOOμM剂量组与10μM和50μM剂量组比较差异也有统计学意义（P值均为0.000)。50μM，100μM和200μM的NMN作用RIN-m5f细胞36h或48h，PDX-1的蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义。结论：Nampt基因-948G>T和-3186C>T的基因多态性与中国2型糖尿病发病无明显相关性，但-3186C>T对瑞格列奈的疗效存在一定的影响。NMN可以调控RIN-m5f细胞中胰岛素的分泌及PDX-1的mRNA表达水平。收起

关键词 : 烟酰胺磷酸核糖转移酶基因多态性 2型糖尿病瑞格列奈

8. NAD+代谢关键酶CD38及NAMPT在肥胖中的作用及机制研究

[学位论文] 汪玲芳南昌大学 2016年博士导师: 辛洪波共130页

摘要 : 研究背景及研究目的：随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖及糖尿病等代谢综合征已经成为严重危害人们健康的常见疾病。近年来，NAD+及其代谢通路在能量和物质代谢中的作用及其机制已成为生物医学领域的研究热点。NAMPT及CD38分别是... 展开研究背景及研究目的：随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖及糖尿病等代谢综合征已经成为严重危害人们健康的常见疾病。近年来，NAD+及其代谢通路在能量和物质代谢中的作用及其机制已成为生物医学领域的研究热点。NAMPT及CD38分别是NAD+合成与降解的关键酶，它们在调节细胞内的NAD+水平中发挥重要作用。本研究旨在观察NAMPT及CD38对高脂饮食诱导小鼠肥胖的影响，深入探讨NAMPT抑制及CD38缺失在高脂饮食诱导小鼠脂肪组织代谢异常的作用及其机制，从而为肥胖等代谢性疾病的预防和治疗提供重要靶点和实验依据。实验方法： 1.人脂肪组织的meta分析：我们首先对脂肪组织进行文献查找及全基因组表达数据库（GEO）筛查，发现24个涉及人类脂肪组织的全基因组表达谱，再通过人工阅读文献，最终确定了5个包含肥胖人群及正常对照的表达谱集合，共涉及338个临床样本（151例正常对照，187例肥胖个体），并对其表达谱进行meta分析，确定有差异表达的基因及对应的信号通路。 2.高脂饮食诱导肥胖模型的建立：给小鼠喂养高脂饮食，建立肥胖模型，通过NAMPT抑制剂FK866及CD38基因缺失小鼠，观察小鼠体重的改变，从组织形态学、血脂变化及胰岛素抵抗等表型研究NAMPT及CD38对肥胖的影响。 3.机制分析： 1）对HFD喂养的CD38缺失及野生型小鼠的白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肝脏及肌肉进行了代谢组学分析，并对两组小鼠的WAT、BAT及肝脏利用基因芯片进行了差异基因的表达谱分析。 2）利用荧光定量PCR及Western blotting技术验证基因芯片中的脂质代谢关键差异基因在CD38缺失小鼠中的变化，同时也检测FK866给药小鼠相应组织中关键差异基因的改变。 3）在前脂肪细胞3T3-L1诱导的成熟脂肪细胞中给予FK866或NAM，并联合给予NAD+，通过油红染色及对脂质合成基因表达的检测，研究NAD+代谢途径在体外对脂肪细胞脂质代谢的影响。 4）利用CD38缺失的MEF细胞、3T3-L1及C3H10T1/2细胞系检测诱导后的脂滴大小、分化相关基因的表达，同时通过Q-PCR及Western blotting检测HFD的CD38缺失及WT小鼠WAT中分化基因的表达情况。实验结果： 1.从5个包含肥胖人群及正常对照的表达谱集合中338个临床样本（151例正常对照，187例肥胖个体）的人脂肪组织Meta分析发现，肥胖人群脂肪组织中有45个基因较之正常人群呈现差异表达，其中，NAMPT的表达明显低于正常人群。 2.在高脂饮食诱导的野生型肥胖小鼠的脂肪组织中，CD38的表达明显升高。 3.NAMPT抑制剂加重高脂饮食诱导的肥胖，增加高脂饮食诱导的血浆TC及LDL含量，促进脂肪细胞的肥大并且加重多种组织的胰岛素抵抗；而CD38缺失则显著抑制高脂饮食诱导的肥胖，降低血脂水平，减轻脂肪细胞肥大及改善多种组织的胰岛素抵抗。 4.CD38缺失的各组织中NAD+/NAM比例明显升高，但WAT的代谢与其他组织明显不同，有差异的化合物占比最高，游离脂肪酸含量明显升高。 5.基因芯片、Q-PCR及Western blotting发现，CD38缺失的WAT中与脂质合成有关基因FASN，ELOVL5及MGAT2的表达显著下降，这些基因主要受转录因子SREBP1调控，而在FK866处理的HFD喂养小鼠WAT中这些基因则显著上调。 6.FK866及NAM处理的诱导成熟的脂肪细胞可明显增加细胞的脂质合成以及显著上调与脂质合成有关的基因表达，但NAD+能明显矫正FK866及NAM的上述作用。 7.在对不同细胞系进行脂肪细胞诱导分化过程中，发现CD38的表达随脂肪细胞的诱导过程而逐渐升高，CD38缺失的MEF及高脂喂养后的WAT中脂肪细胞分化相关基因如PPARγ、CEBPα及aP2的表达显著下降。在给予Sirt1特异性抑制剂 EX527及非特异抑制剂NAM后PPARγ表达增加，但CD38缺失MEFs的增加幅度小于WT组。结论： 1.NAD+代谢通路与肥胖的发生密切相关，NAMPT在肥胖人群及高脂饮食喂养小鼠的WAT中表达下降，而CD38在高脂饮食诱导的肥胖小鼠WAT中表达上调。 2.NAMPT抑制剂（FK866）可明显促进WAT脂质合成，进而加重高脂饮食诱导的肥胖，相反，CD38基因缺失可显著抑制WAT脂质合成，进而抑制高脂饮食诱导的肥胖。 3.CD38缺失可明显抑制脂肪细胞分化及脂质合成过程，进而抑制肥胖，其机制可能与其调节脂肪细胞NAD+/Sirt1/PPARγ信号通路活性有关。收起

关键词 : 肥胖 cd38蛋白烟酰胺磷酸核糖转移酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脂肪组织代谢

9. 多发性骨髓瘤硼替佐米耐药和预后相关基因NAMPT的鉴定及机制探讨

[学位论文] 王亚茹第二临床医学院 2022年博士导师: 马艳萍共140页

摘要 : 目的：多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)是一种常见的浆细胞肿瘤，导致恶性浆细胞的增殖和单克隆免疫球蛋白的过量产生。以硼替佐米(Bortezomib，BTZ)为代表的蛋白酶体抑制剂(ProteasomeInhibitor，PI)一直是MM的主要治疗药物，但是，大多数骨... 展开目的：多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)是一种常见的浆细胞肿瘤，导致恶性浆细胞的增殖和单克隆免疫球蛋白的过量产生。以硼替佐米(Bortezomib，BTZ)为代表的蛋白酶体抑制剂(ProteasomeInhibitor，PI)一直是MM的主要治疗药物，但是，大多数骨髓瘤患者最终会出现耐药，导致疾病复发。探讨MM硼替佐米耐药的分子机制，寻找硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤患者的可能治愈方案，对提高MM患者硼替佐米治疗敏感性和生存率有着重要的意义。为了找到BTZ耐药的预测性生物标志物，有必要使用原始MM样本和高通量测序数据进行进一步研究。因此，本研究利用生物信息学的方法，挖掘MM中潜在的耐药分子靶点，并利用基因表达综合(GeneExpressionOmnibus，GEO)数据库数据及临床样本数据验证其可行性，然后初步探讨靶基因在MM细胞增殖、凋亡和硼替佐米耐药中的作用机制，进而为临床治疗多发性骨髓瘤提供新的思路。方法： 1.从GEO数据库下载微阵列数据集GSE9782，应用GEO2R在线分析工具筛选硼替佐米敏感与耐药MM患者的差异表达基因(DifferentiallyExpressedGenes，DEGs)。应用DAVID数据库对DEGs进行GO功能，KEGG途径和REACTOME通路富集分析。应用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-ProteinInteraction，PPI)网络，在CytoHubba中通过Betweenness、Bottleneck、Stress三种方法进一步筛选Hub基因。通过Kaplan-Meierplotter对Hub基因进行生存分析以及结合文献复习筛选并鉴定目标基因NAMPT。并从GEO数据库下载3个微阵列数据集GSE6477、GSE31162、GSE24080的基因表达数据及临床数据，初步验证所选目标基因NAMPT在MM中的表达及与临床特征、预后的相关性。使用另一个独立的MM微阵列数据集GSE19784进行基因集富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA)，探讨NAMPT参与MM细胞功能的可能机制。 2.采集2018年12月-2020年10月在山西医科大学第二医院血液科住院的85例MM患者及15例健康造血干细胞移植供者的骨髓样本以及详细的临床资料。采用qRT-PCR和Westernblot方法检测MM患者与健康供体的骨髓单个核细胞NAMPTmRNA和蛋白的表达情况，探讨NAMPT基因表达与临床病理特征、疗效的相关性，采用Kaplan-Meier方法分析NAMPT对无进展生存(ProgressionFreeSurvival，PFS)和总生存(OverallSurvival，OS)的影响，并进行单因素和多因素生存分析。 3.以正常骨髓单个核细胞为对照，采用qRT-PCR和Westernblot方法检测多发性骨髓瘤细胞系MM1R、MM1S、U266、RPMI-8226中NAMPTmRNA和蛋白表达水平，选择NAMPT表达水平最高的U266细胞系作为研究对象。将SiRNA-NAMPT和阴性对照SiRNA分别转染到U266细胞中，在U266细胞中稳定敲除NAMPT，采用pMaxGFP载体评估U266细胞的转染成功率，采用Westernblot方法检测稳定敲除NAMPT的U266细胞中NAMPT蛋白水平，验证基因敲除效果。采用CCK8法检测转染后U266细胞的增殖情况，流式细胞术检测NAMPT稳定敲除和未敲除情况下的细胞凋亡率。将Flag-NAMPT重组质粒及空载体Flag分别转染到U266细胞中，在U266细胞中稳定过表达NAMPT，Westernblot法分析其过表达效果。采用CCK8法检测过表达NAMPT后U266细胞的增殖情况，流式细胞术检测NAMPT稳定过表达和未过表达情况下的细胞凋亡率。从正反两个方面证实NAMPT对MM细胞增殖、凋亡的影响。 4.利用JASPAR数据库对NAMPT上游基因组序列进行检测，在NAMPT启动子中发现一个潜在保守的XBP1结合区。通过染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)实验证实XBP1基因和NAMPT启动子基因片段存在特异性结合。在U266细胞中分别敲除和过表达XBP1基因，Westernblot法分析XBP1基因敲除和过表达效果，采用qRT-PCR法检测XBP1基因敲除和过表达前后NAMPTmRNA水平，从而探讨NAMPT的异常表达在转录水平的受调控机制。 5.分别将XBP1-SiRNA、NAMPT-SiRNA及阴性对照SiRNA转染到U266细胞中培养24h，再用硼替佐米处理24h，采用CCK8法测定各组细胞增殖情况。另外，以二甲基亚砜(DimethylSulfoxide，DMSO)为阴性对照组，使用IRE1α抑制剂MKC3946预处理U266细胞4h，再用硼替佐米处理24h，采用CCK8法测定细胞增殖情况。采用RT-PCR和Westernblot法检测凋亡相关基因BCL2和BAXmRNA和蛋白表达量，采用Caspase-3/7分析试剂盒对各组进行Caspase-3/7活性分析。结果： 1.应用GEO2R在线工具筛选出GSE9782数据集中硼替佐米敏感与耐药MM患者之间的DEGs,包括112个上调基因和89个下调基因。对DEGs进行GO功能、KEGG和REACTOME通路富集分析。GO功能包括生物过程(BiologicalProcess，BP)、细胞成分(CellularComponent，CC)、分子功能(MolecularFunction，MF)3个部分。BP分析提示DEGs在翻译起始，mRNA降解代谢过程，靶向细胞膜的SRP依赖的共翻译蛋白中显著富集。CC主要富集到胞质核糖体，核糖体亚基和胞质部分。主要参与的MF包括核糖体结构成分，翻译起始因子活性，翻译因子活性，RNA结合，细胞粘附等。KEGG途径发现DEGs在核糖体生成，氧化磷酸化，RNA转运，NF-kB信号通路，TNF信号通路和细胞凋亡中显著富集。REACTOME通路富集分析提示表达上调的DEGs在MM耐药中发挥了重要作用。应用STRING数据库构建了由201个节点和960条边组成的PPI网络，进一步利用Betweenness,BottleneckandStress方法确定了7个Hub基因，包括RPS27A、RPS16、COX7C、LCK、NAMPT、PTEN、CXCL8。Hub基因生存分析显示，高表达NAMPT为MM患者OS的不良预后因素。结合PPI分析、生存分析及文献复习，最终鉴定NAMPT为本研究的目标基因。通过综合微阵列数据集GSE6477、GSE31162、GSE24080的大数据分析，结果显示，相对于正常浆细胞，新诊断MM细胞中NAMPT的表达显著升高(Plt;0.001)。NAMPT在复发MM细胞中的表达明显高于新诊断MM细胞(Plt;0.001)。NAMPT的表达与β2-微球蛋白(P=0.046)、血清乳酸脱氢酶(P=0.012)和磁共振成像确定的局灶性病变数量(P=0.008)显著相关。与NAMPT高表达组患者相比，NAMPT低表达组患者的无事件生存率(P=0.037)和总生存率(P=0.009)更高，并且NAMPT表达是MM患者PFS和OS的独立预后因素(分别P=0.006，P=0.020)。GSEA结果显示，NAMPT可能通过mTORC1信号通路影响MM细胞的增殖。 2.新诊断和复发MM患者骨髓NAMPTmRNA表达水平均明显高于健康供体(Plt;0.001)。复发MM患者NAMPTmRNA表达明显高于新诊断MM患者的表达量(Plt;0.001)，与NAMPT蛋白表达结果一致。ISSIII期、乳酸脱氢酶和C反应蛋白水平升高、P53缺失和骨髓瘤细胞比例较高等不良临床病理特征的患者NAMPT表达明显上调(Plt;0.001)。相对于CR组，PR、进展和复发组患者中NAMPTmRNA表达均明显上调(Plt;0.001)。NAMPT高表达患者的中位PFS(14.9个月)明显短于NAMPT低表达组(27个月，Plt;0.001)。NAMPT高表达组患者的中位OS(27.3个月)显著短于NAMPT低表达组(39.1个月，P=0.048)。单因素和多因素分析显示NAMPT高表达患者PFS和OS均明显低于低表达组。 3.多发性骨髓瘤细胞系MM1R、MM1S、U266、RPMI-8226中NAMPTmRNA和蛋白水平较正常骨髓细胞均显著升高(Plt;0.001)，且在U266细胞中表达量最高。基因敲除效果显示超过80%的U266细胞在转染后24h表达绿色荧光信号，表明转染成功。与Si-NC组相比，Si-NAMPT组细胞中NAMPT蛋白表达水平显著降低(0.89±0.06vs0.22±0.06，t=-24.42，Plt;0.001)。与Si-NC组比较，Si-NAMPT组转染24、48、72h时显著抑制U266细胞增殖(24h：1.03±0.11vs0.62±0.08；48h：1.62±0.11vs0.78±0.06；72h：2.37±0.18vs1.23±0.14)，差异有统计学意义(分别P=0.006，Plt;0.001，P=0.001)。与Si-NC组相比，Si-NAMPT组在转染48h时U266细胞凋亡率明显升高[(35.43±1.67)%vs(53.42±0.25)%]，差异有统计学意义(t=4.41，Plt;0.001)。提示，稳定敲除NAMPT可抑制U266细胞的增殖，诱导细胞凋亡。与Flag-NC组比较，Flag-NAMPT组U266细胞中NAMPT蛋白表达水平明显升高(0.12±0.08vs1.18±0.07，t=16.42，Plt;0.001)。随着作用时间的延长，与Flag-NC组相比，Flag-NAMPT组细胞增殖明显升高(24h：1.13±0.05vs1.52±0.09；48h：1.60±0.24vs2.67±0.07；72h：2.38±0.07vs4.93±0.24)，差异具有统计学意义(分别P=0.003，P=0.002，Plt;0.001)。与对照组细胞凋亡率相比，Flag-NAMPT组细胞凋亡率明显减少[(32.77±1.39)%vs(21.92±1.56)%]，差异有统计学意义(t=-8.99，P=0.001)。结果表明，与敲除NAMPT基因结果相反，过表达NAMPT可促进U266细胞增殖，抑制细胞凋亡。 4．XBP1在转录水平调控NAMPT的表达。利用JASPAR数据库对NAMPT的基因组上游序列进行分析，在NAMPT的启动子区域1913bp~1926bp处发现一个潜在保守的XBP1结合位点。ChIP实验结果显示，在U266细胞中内源的XBP1能和NAMPT基因上游XBP1结合位点特异性结合。与Flag-NC组比较，Flag-XBP1组U266细胞中XBP1蛋白表达水平显著升高，Flag-XBP1能够明显上调NAMPTmRNA水平(1.00±0.00vs6.13±0.41，t=21.368，Plt;0.001)。XBP1的稳定敲除导致U266细胞中NAMPTmRNA水平明显下调(1.00±0.00vs0.32±0.05，t=-20.52，Plt;0.001)。结果提示，在U266细胞中NAMPT的表达在转录水平受到XBP1的调控。 5.抑制IRE1α-XBP1-NAMPT轴增加U266细胞对硼替佐米的敏感性。用硼替佐米处理XBP1或NAMPT稳定敲除的U266细胞后细胞增殖率均明显下降，分别为(62.73±3.62)%和(52.70±4.08)%。细胞内BCL2/BAX的比例对决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用。Caspase-3/7的活化也可视为U266细胞对硼替佐米治疗敏感性的效应。与Si-NC组相收起

关键词 : 多发性骨髓瘤烟酰胺磷酸核糖转移酶硼替佐米耐蚀性预后

10. NAMPT通过NAD+-PARP1调控肝脏缺血再灌注损伤的机制研究

[学位论文] 卢佼 2022年硕士导师: 刘作金共58页

摘要 : 目的：肝脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury,IRI）是肝移植术后移植物功能障碍、原发性移植肝功能障碍的主要原因之一。烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamidephosphoribosyltransferase,NAMPT）是维持细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotin... 展开目的：肝脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury,IRI）是肝移植术后移植物功能障碍、原发性移植肝功能障碍的主要原因之一。烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamidephosphoribosyltransferase,NAMPT）是维持细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+）水平所必需的，是NAD+补救合成途径中的限速酶。NAMPT在炎症过程中明显上调，但NAMPT在肝脏缺血再灌注损伤中的作用尚不明确，我们旨在探究NAMPT在肝脏IRI中的作用。方法：我们研究了小鼠肝脏IRI模型中NAMPT的表达情况，通过使用NAMPT酶的抑制剂，观察分析肝组织和血清以评估肝损伤和炎症。为了研究其机制，Kupffer细胞和RAW264.7细胞经过缺氧复氧处理以模拟缺血再灌注损伤。在缺氧复氧处理时给予或不给予NAMPT抑制剂处理，通过western印迹、流式细胞术和ELISA评估Kupffer细胞和RAW264.7细胞的炎症反应及极化情况。结果：组织荧光显示小鼠IRI可以增加NAMPT的表达量（shamvsIRI43.56±4.417vs74.73±7.585,Plt;0.05）,WB检测肝细胞和Kupffer细胞的NAMPT表达情况，发现NAMPT在肝细胞(shamvsIRI1.116±0.116vs2.639±0.2464,Plt;0.05)和Kupffer(shamvsIRI1.290±0.2897vs4.220±0.4763,Plt;0.05)均表达上调。NAMPT在巨噬细胞缺氧复氧处理中表达上调，NAMPT抑制剂FK866改善了小鼠的肝脏IRI并抑制了炎症。FK866能有效抑制NAMPT活性，表现为肝脏NAD+(IRI+FK866vsIRI0.1367±0.005860vs0.1925±0.006562,Plt;0.01)和细胞内NAD+减少(H3R6+FK866vsH3R60.3030±0.01008vs0.5482±0.03384,Plt;0.01)，导致NAD+依赖性酶聚ADP核糖聚合酶1（PolyADP-ribosepolymerase1,PARP1）的丰度和活性降低。FK866处理缺氧复氧的巨噬细胞可以降低CD86、iNOS、TNF-α和白细胞介素（IL）-1β的表达，但对CD163、ARG-1没有影响。我们发现抑制NAMPT主要是通过NAD+/PARP1途径降低炎症反应的。结论：NAMPT在肝脏缺血再灌注损伤中表达上调，参与肝脏炎症反应。抑制NAMPT可能通过降低PARP1活性来抑制免疫反应并抑制肝脏IRI中巨噬细胞的炎症。我们认为，阻断NAMPT的活性是减轻肝脏IRI的一种方法，值得进一步研究。收起

关键词 : 肝缺血再灌注损伤枯否细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶