中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王根洪西南大学 2008年博士导师: 夏庆友共125页

摘要 : 家蚕基因组框架图已经成功绘制完成，对大量的预测基因的功能鉴定将是未来相当长的时间里的主要工作。RNA干扰是最近十年发展起来的研究基因功能的新的强有力的实验方法，作为功能研究手段，RNA干扰技术利用了dsRNA能够特异的介导靶标基因表达沉默这... 展开家蚕基因组框架图已经成功绘制完成，对大量的预测基因的功能鉴定将是未来相当长的时间里的主要工作。RNA干扰是最近十年发展起来的研究基因功能的新的强有力的实验方法，作为功能研究手段，RNA干扰技术利用了dsRNA能够特异的介导靶标基因表达沉默这一在生物界固有且古老的基因表达调节机制。由于RNA干扰技术的简单、高效、快速及特异性，使其迅速成为基因功能研究的常规手段。RNA干扰效应的产生是生物体内一系列的干扰机制相关基因共同作用的结果，本研究首先利用家蚕的全基因组序列、EST序列库等数据资源，对家蚕干扰机制相关基因进行了生物信息学分析，同时采用克隆、RT-PCR、荧光定量PCR、组织原位杂交等技术对部分基因的结构、转录水平的时空表达以及功能进行了初步的分析和研究，以期初步了解家蚕RNA干扰分子机制的进化特征。然后，选择了胚胎期，幼虫期相关基因作为研究靶标，旨在进行相应基因功能研究的同时，探讨在家蚕中建立适合胚胎期，幼虫期的干扰方法。此外，以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)病毒侵染、复制关键基因IE1和GP64作为靶标，构建干扰表达载体和转基因干扰载体，制作相应的转基因株系，并对转基因株系进行了分子检测及初步的抗性差异检测。获得的主要研究结果如下：1.家蚕干扰相关基因的鉴定及克隆基于序列的相似性及功能域的保守性，在家蚕基因组数据中检索线虫、果蝇、蚊子等物种中参与RNA干扰进程的重要同源基因。成功在家蚕中鉴定出可能的Dicer1，Dicer2，Drosha，Pasha，Loquacious，R2D2，Rsd-3，Sid-1，Argonaute1，Argonaute2，Argonaute3和Piwi等干扰机制关键基因同源体。基因结构及进化分析显示这些基因均非常保守。为了进一步研究的方便，本研究对Dicer2，Loaquacious，Sid-1和Piwi等基因进行了全长及部分cDNA克隆，获得的基因大部分为首次报道。经RT-PCR证实，大部分核心的干扰相关基因在众多的组织器官中均有一定程度的表达，显示RNA干扰信号通路是家蚕的一个必需的也是极为重要的信号通路。信息分析显示，家蚕存在线虫中系统性RNA干扰核心蛋白Sid-1的同源体，而此蛋白在果蝇、蚊子等物种中是不存在的。但表达谱分析表明，家蚕Sid-1类似物仅在卵巢、前中部丝腺、体壁、马氏管等部分组织器官表达量相对较高，一定程度上预示着RNA干扰效应在这些组织器官的干扰系统性传播能力较强。此外，在家蚕中仅能鉴定出4个Argonaute家族成员，这与果蝇，蚊子的Argonaute家族成员个数较为一致，不存在线虫中庞大数量的物种特异的Argonaute蛋白。家蚕干扰机制相关基因的生物信息学分析结果表明，家蚕与果蝇，线虫等其他物种相比，在RNA干扰机制上具有既高度保守，又各不相同的特点。相关研究工作为更好的科学的把RNA干扰技术应用于家蚕的功能基因组研究之中提供了理论基础。2.家蚕Piwi的全长克隆及表达特征Piwi属于Argonaute蛋白家族piwi亚家族成员之一，蛋白分子量一般在100kDa左右，大多参与生殖干细胞自我更新的调控。最近研究发现，Piwi在生殖细胞中与另一类小RNA—piRNA结合，介导了生物体的第三条干扰通路。由Piwi参与的干扰通路在沉默生殖细胞转座子，维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。本研究获得的家蚕Piwi基因长3533bp，含有完整的开放阅读框(136-2835)和3’端poly(A)终止信号。经预测，该基因共编码899个氨基酸，蛋白质分子量为101KDa，与果蝇Piwi基因的相似性为60％，含有保守的PAZ功能域和PIWI功能域。对Piwi的荧光定量PCR组织表达谱分析显示，家蚕Piwi在生殖腺高丰度表达。进一步的RNA组织原位杂交分析表明，Piwi的表达主要定位于精原细胞。家蚕中Piwi序列的高度保守，其在生殖腺特异高量表达及主要定位于精原细胞的表达模式，一定程度上暗示Piwi参与家蚕生殖干细胞维持及piRNA调控通路的可能保守功能。3.Argonaute蛋白对dsRNA和BmNPV的应激反应最近的研究显示，RNA干扰是生物体固有的抗病毒免疫机制。本研究以与家蚕不相关的红色荧光蛋白对应dsRNA模拟病毒，转染家蚕卵巢细胞BmN，检测干扰关键基因的表达变化，以探索RNA干扰是否为家蚕的病毒响应机制。实验结果表明，细胞在受到dsRNA侵袭之后，干扰通路的关键蛋白Argonaute家族成员的表达量均呈现不同程度的上调，显示细胞受病毒攻击之后，加强RNA干扰通路，以便抵御病毒的入侵。此外，在植物中，RNA干扰也被发现参与了生物体对DNA病毒的抵抗。本课题对家蚕DNA型病毒核型多角体病毒感染组织的干扰核心蛋白Argonaute家族成员的表达变化进行了分析。结果发现，家蚕在病毒感染后12小时，Argonaute家族成员均呈现表达上调的趋势，但随后其表达量又降至普通水平。初步说明，干扰通路对DNA病毒浸染存在一定响应。总之，本研究首次揭示RNA干扰是家蚕病毒免疫的响应机制，为通过RNA干扰抑制病毒复制、增殖提供了一定的理论支撑。4.家蚕胚胎期RNAi技术及ABC转运蛋白的功能分析White基因编码的ABC转运蛋白在果蝇中发挥着对色素前体进行转运的作用。Abraham等通过比较基因组学和RT-PCR的方法在家蚕中分离出了3条与果蝇white基因相类似的cDNA序列片段，并将其命名Bmwhl，Bmwh2，Bmwh3。本课题以此三个基因作为研究靶基因，将已广泛应用于其他物种的短的dsRNA(即siRNA)介导的干扰技术对其进行了初步的功能分析。结果显示，Bmwh3的表达的人为调低会引起嵌合体及白卵的表型，说明Bmwh3对于家蚕卵色的形成的至关重要，而Bmwhl，Bmwh2是否与色素转运相关还有待于进一步分析。同时，实验发现siRNA介导的RNAi较之于长链RNAi能更快达到干涉现象；实验结果表明，与长链RNAi相比，siRNA介导的RNAi更适合胚胎期的RNAi研究。5.家蚕幼虫期RNAi技术及组织蛋白酶B的功能分析组织蛋白酶B是木瓜蛋白酶家族中的溶菌型半胱氨酸蛋白酶成员之一，广泛存在于各种植物动物中。组织表达谱分析显示，家蚕组织蛋白酶B在蛋白合成降解中心脂肪体中表达量最高；而发育表达谱表明，家蚕组织蛋白酶B在开始吐丝到吐丝后24小时的变态发育关键时间，表达量呈现明显上调趋势；最后，通过dsRNA介导的RNAi技术，在变态期调低组织蛋白酶B的表达，获得蚕体化蛹过程受阻的干扰表型，直接证明了组织蛋白酶B在家蚕变态发育过程中扮演着降解旧组织器官的功能。同时，实验结果也为蚕业生产上要求的“永久蛹”制作提供了一定的参考。6.以RNAi为主要手段的漆酶基因功能分析漆酶(Laccases)是少有的几种自从19世纪以米就一直持续研究的酶类。漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，普遍存在于真菌、植物、昆虫中，其至原核生物中。本课题首先通过生物信息学分析，鉴定出家蚕可能的漆酶基因Laccase1和Laccase2，通过进化分析、时空表达谱分析，最后以RNAi为主要技术手段，对两基因进行了功能分析。结果显示，在变态期阻碍Laccase1和Laccase2的表达，虫体化蛹后表皮颜色加深受阻，骨质硬化过程受阻。结果表明，Laccase1和Laccase2参与了蚕蛹表皮的鞣化进程，而且二者在这一进程中几乎同等重要。7.针对家蚕核型多角体病毒的RNAi研究核型多角体病毒是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原，对其研究具有重要的科学意义和产业应用价值。本章选择了核型多角体病毒的早期表达基因IEl及病毒浸染宿主相关基因GP64等与病毒复制、增殖紧密相关的基因作为抑制靶标，通过脂质体把体外合成的目标dsRNA转入家蚕卵巢细胞(BmN)，发现目标基因dsRNA对病毒在细胞中的复制、增殖均有一定的抑制作用。同时，结合转基因技术，构建转基因干扰载体，以显微注射的方式成功制作获得具有潜在病毒抗性的IE1PIEl，IE1PGP64和A4PGP64三个转基因系统。BmNPV攻毒后，不论是血液中病毒的增殖情况，还是期间的死亡率调查，均显示在感染的早期，转基因系统与对照相比，对病毒复制、增殖具有更强的抵抗力。实验结果显示，通过转基因技术与RNA干扰技术的结合，制作能稳定表达抑制病毒复制增殖的dsRNA的转基因系统，是培育家蚕抗病毒品系的有效的崭新手段，具有潜在的应用价值。收起

关键词 : 家蚕干扰分子机制

2. 胃癌中lncRNA ASH1L-AS1的表达调控及其促癌分子机制研究

[学位论文] 谢梦雨山东大学 2021年硕士导师: 杨明共65页

摘要 : 研究背景 2020年全球癌症统计数据显示，在世界范围内，胃癌(gastric cancer)发病率位居恶性肿瘤的第五位，死亡率居第四位;在东亚人群中，胃癌发病率最高，占45.7％。早期胃癌患者的5年生存率可超过60％，但发生远处转移的晚期胃癌患者5年生存率... 展开研究背景 2020年全球癌症统计数据显示，在世界范围内，胃癌(gastric cancer)发病率位居恶性肿瘤的第五位，死亡率居第四位;在东亚人群中，胃癌发病率最高，占45.7％。早期胃癌患者的5年生存率可超过60％，但发生远处转移的晚期胃癌患者5年生存率仅约5％。胃癌早期症状隐匿，缺乏检测灵敏度高、特异性强的生物标志物，确诊时有超过60％的患者发生局部或远处转移。 lncRNA(long non-coding RNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，占细胞所有非编码RNA含量的80％-90％,在表观遗传调控中发挥重要作用。研究表明，lncRNA可作为恶性肿瘤早期诊断、预后评估及药物治疗反应的潜在生物标记物。 lncRNAASH1L-AS1位于东亚人群胃癌易感染色质1q22区域，其在胃癌中的生物学功能及分子作用机制尚不清楚。研究目的揭示胃癌细胞中lncRNAASH1L-AS1的生物学功能及分子作用机制，为胃癌的早期诊断以及临床治疗提供新靶标和新思路。研究方法 1.通过qRT-PCR检测lncRNAASH1L-AS1在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平。 2.构建慢病毒载体，获得稳定敲低或过表达lncRNAASH1L-AS1的胃癌细胞系，利用细胞增殖计数实验、平板克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验确定lncRNAASH1L-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响;利用划痕愈合实验和Transwell实验揭示lncRNAASH1L-AS1对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 3.通过qRT-PCR检测ASH1LmRNA在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平，并分析组织样本中ASH1LmRNA水平与lncRNAASH1L-AS1水平的相关性。 4.通过qRT-PCR检测胃癌细胞系中ASH1LmRNA水平是否受lncRNAASH1L-AS1水平影响。 5.通过平板克隆形成实验和Transwell实验探究ASH1L对胃癌细胞恶性表型的影响，在过表达lncRNAASH1L-AS1的基础上敲低ASH1L是否可以逆转胃癌细胞恶性表型。 6.通过RNA-pulldown实验联合蛋白质谱分析，鉴定胃癌细胞内与lncRNAASH1L-AS1物理结合的蛋白，并通过Westernblot实验及RIP实验进一步验证细胞中两者的相互作用。 7.利用Westernblot检测胃癌细胞中NMEl表达水平是否受lncRNAASH1L-AS1影响，利用Westernblot和细胞免疫荧光实验检测胃癌细胞中NMEl核质分布是否受lncRNAASH1L-AS1影响。 8.通过qRT-PCR检测NME1mRNA在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平，并分析组织样本中lncRNAASH1L-AS1和ASH1LmRNA水平与NME1mRNA水平相关性。 9.在胃癌细胞中，通过qRT-PCR检测ASH1L-AS1和ASH1L表达是否受NME1影响。 10.通过ChIP-seq和ChIP-qPCR实验探究ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域NME1结合情况，并通过ChIP-seq实验确定ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域H3K4me3修饰水平是否与NME1富集程度一致。研究结果 1.lncRNAASH1L-AS1在胃癌组织中高表达。细胞表型实验结果显示，敲低lncRNAASH1L-AS1显著抑制胃癌细胞增殖和迁移，过表达lncRNAASH1L-AS1则显著增强胃癌细胞增殖和迁移。动物实验结果显示，过表达lncRNAASH1L-AS1显著促进胃癌细胞异种移植瘤的形成和恶性增殖。 2.lncRNAASH1L-AS1上调邻近编码基因ASH1L表达，在胃癌细胞中敲低ASHIL可显著抑制细胞恶性表型，在过表达lncRNAASH1L-AS1的基础上敲低ASH1L可逆转细胞恶性表型。 3.RNA-pulldown、蛋白质谱以及Westernblot实验，鉴定NMEl为lncRNAASHlL-ASl的结合蛋白。RIP实验显示NME1能显著富集细胞中lncRNAASH1L-AS1。在胃癌细胞中lncRNAASH1L-AS1结合并增加NME1蛋白在细胞核中的水平。与配对的正常胃组织相比，NME1在胃癌组织高表达，并且在组织样本中lncRNAASH1L-AS1和ASH1LmRNA水平均与NME1mRNA水平显著正相关。在胃癌细胞中敲低NME1，lncRNAASH1L-AS1和ASH1L下调;过表达NME1-NLS，lncRNAASH1L-AS1和ASH1L显著上调。ChIP实验表明NME1可结合在ASH1L-ASI和ASH1L基因启动子区域，并且过表达lncRNAASH1L-AS1组细胞与对照组细胞相比，ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域NME1富集以及H3K4me3修饰程度明显更高。结论本研究发现在胃癌组织中lncRNAASH1L-AS1水平显著增高，lncRNAASH1L-AS1与NME1结合上调ASH1L-AS1及邻近编码基因ASH1L转录，促进胃癌恶性进展，靶向lncRNAASH1L-AS1有望成为胃癌临床治疗新策略。收起

关键词 : 胃癌分子机制 lncRNA ASH1L-AS1 NME1 促癌分子机制

3. 菊花CmERF1调控开花与花发育的分子机制研究

[学位论文] 张皖皖南京农业大学 2020年博士导师: 陈素梅共127页

摘要 : 菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值高。花期和花型是菊花的重要观赏性状。大多数菊花品种属于典型的短日照植物，花期直接影响菊花的周年供应和效益;菊花花序是由舌状花和管状花聚集而成的... 展开菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值高。花期和花型是菊花的重要观赏性状。大多数菊花品种属于典型的短日照植物，花期直接影响菊花的周年供应和效益;菊花花序是由舌状花和管状花聚集而成的头状花序，舌状花和管状花的形态直接决定着菊花的观赏性。菊花花期和花型形成的分子机制一直是研究的热点和难点。已知光周期路径、年龄开花路径在调控菊花花期中发挥着重要作用，CYCLOIDEA2分支基因与菊科植物舌状花发育有关。但菊花开花、花型形成的复杂分子机制尚有待进一步研究。已知AP2/ERF家族转录因子参与调控植物叶片和花的生长发育。本课题组通过对长日照和短日照条件下菊花转录组分析发现CmERF1在短日照条件下表达量显著升高，但其在菊花开花等过程中的作用并不清楚。为此，本研究从菊花‘神马’中克隆了CmERF1转录因子，对其调控开花与花发育的功能及调控机制进行了初步探讨，主要内容及结论如下: 1.从菊花‘神马’中克隆CmERF1基因，开放阅读框(ORF)长582bp,编码193个氨基酸，具有保守的AP2/ERF结构域。基于氨基酸序列的系统进化树显示，CmERF1与青蒿AaERF3序列同源性最高，与拟南芥AtERF1序列相似性较高。CmERF1表达受乙烯诱导，在舌状花花冠中表达量最低，在管状花雄蕊中表达量最高，雌蕊中的表达量次之，发现CmERF1在长日照和短日照条件下存在节律表达特性，长日照条件下在进入光照8h表达量达到峰值，短日照条件下在0h表达量最高。CmERFl无转录激活活性，定位在细胞核上。 2.构建了CmERF1超表达载体pMDC43-CmERF1和干扰载体pMDC32-amiRNA-CmERF1，并进行了菊花遗传转化。CmERF1转基因株系和野生型表型观察发现CmERF1超表达导致菊花花期提前7-10天，干扰株系花期与野生型相比没有明显变化。以CmERF1为诱饵蛋白，筛选菊花‘神马’开花酵母文库，获得了与CmERF1互作的候选蛋白CmTCP2。从菊花‘神马’中克隆了CmTCP2，该基因ORF长1，326bp，编码441个氨基酸，含有一个TCP结构域，进化树分析发现CmTCP2和拟南芥AtTCP2亲缘关系最近。CmTCP2无转录激活活性，定位在细胞核中，在叶片和舌状花花冠中表达量较高，表达量响应昼夜节律变化。通过酵母双杂交、烟草双分子荧光互补(BiFC)实验、体外GSTpull-down实验，在体内和体外验证了CmERF1与CmTCP2存在直接互作作用。CmERF1转基因株系转录组分析发现，与野生型相比，光周期路径的开花抑制基因CmCDF2和CmCDF3在超表达株系中显著下调，编码菊花成花素的基因CmFTL3在超表达株系中显著上调，与开花相关的节律基因CmCCA1和CmELF3在超表达株系中显著下调。推测，CmERF1可能通过调控光周期路径基因调控菊花开花。 3.与野生型相比，CmERF1超表达株系的最外轮舌状花形成背瓣融合的管状结构，扫描电镜观察结果显示，在5mm花蕾大小时，超表达株系的最外轮舌状花背瓣出现明显的融合，而干扰株系的融合度较野生型低。CmERF1超表达株系E12和E13舌状花背瓣融合度分别为54.92％和68.97％，显著高于野生型的舌状花背瓣融合度14.60％，干扰株系R4和R12舌状花背瓣融合度分别为11.80％和11.11％。CmERF1超表达株系最外轮舌状花花瓣长度变短，缩短了约23mm，干扰株系的舌状花长度与野生型相比长度伸长约2-5mm。原位杂交结果表明，CmERF1主要在管状花的雄蕊和雌蕊中表达，推测其可能调控菊花管状花发育。对CmERF1转基因株系和野生型花蕾的舌状花取样进行基因表达分析，发现与野生型相比，CmERF1超表达株系最外轮舌状花中CmCYC2c和CmCYC2e表达量下调，而干扰株系中其表达量上升。继而克隆了CmCYC2c和CmCYC2e的启动子序列，元件分析发现CmCYC2e的启动子区存在ERF1结合的DRE/CRT顺式作用元件。通过ChIP-qPCR初步证实了CmERF1可直接结合CmCYC2e启动子区DRE/CRT顺式作用元件，并不直接结合CmCYC2c。推测，在最外轮舌状花中，CmERF1可能通过直接结合CmCYC2e基因的DRE/CRT顺式作用元件从而抑制其表达，间接抑制CmCYC2c的表达。CmERF1异位超表达可能改变了舌状花中CmCYC2e、CmCYC2c等的表达量，从而使得最外轮舌状花背瓣延伸生长，融合度增加，而腹瓣生长受抑，从而呈现管状花形态。收起

关键词 : 菊花分子机制花发育

4. 雌激素参与痒觉调控分子机制的研究

[学位论文] 金锦花北京协和医学院 2022年博士导师: 薛富善共115页

摘要 : 瘙痒治疗的经典方法是抗组胺治疗，但绝大多数慢性瘙痒对抗组胺治疗无效，缺乏特异敏感的有效药物，是临床治疗的难点之一。慢性瘙痒虽然不对生命造成严重危害，但在普通人群中发病率高，极大地影响了人们的正常生活和休息。瘙痒的机制研究可以为开发... 展开瘙痒治疗的经典方法是抗组胺治疗，但绝大多数慢性瘙痒对抗组胺治疗无效，缺乏特异敏感的有效药物，是临床治疗的难点之一。慢性瘙痒虽然不对生命造成严重危害，但在普通人群中发病率高，极大地影响了人们的正常生活和休息。瘙痒的机制研究可以为开发安全有效治疗慢性瘙痒的药物提供实验基础，具有重要的科学意义。随着痒感觉研究的不断深入，临床研究、动物实验和细胞研究均发现了雌激素在瘙痒调节中作用，在瘙痒传导的各个器官，包括从皮肤感受器、脊髓背根神经节、脊髓背角浅层、到下丘脑整合中枢，都发现了雌激素受体的表达，提示着雌激素可能在多器官、多位点对瘙痒发挥调节作用。但由于瘙痒感觉的研究起步较晚，又由于雌激素参与感觉调节的复杂性，雌激素在瘙痒感觉中的调节方式没有统一的结论。本研究的主要内容为雌激素在瘙痒调节中的作用，全部研究分为四个部分，第一部分建立小鼠急性瘙痒模型，确立研究雌激素对急性瘙痒模型作用所用的致痒剂剂量;第二部分建立小鼠慢性干皮症瘙痒模型;第三部分实验研究雌激素对急性瘙痒模型的影响;第四部分实验研究雌激素对慢性瘙痒模型的影响，并通过分子生物学实验初步探讨雌激素调节慢性瘙痒的分子机制，为缓解慢性瘙痒的治疗提供可能的治疗靶点。本实验方案均得到了中国医学科学院整形外科医院动物实验伦理委员会审核批准（伦理批准号:ZX201898，日期2018年12月）。第一部分实验:小鼠急性瘙痒模型的建立本部分实验旨在通过皮内注射不同浓度的致痒剂建立急性瘙痒模型，建立时间-搔抓曲线，计数小鼠总的搔抓次数，对比不同剂量药物引起小鼠瘙痒的情况，选择每组中抓挠次数在100～200次/30min的剂量做为第三部分实验中用到的致痒剂剂量将20只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成4组（每组5只）:低剂量组(L组)、中剂量组（M组）、高剂量组（H组）、对照组（C组）。选择急性瘙痒模型制备用到的5种致痒剂:组胺（Histamine）、氯喹(Chloroquine，CQ)、复合物48/80(Compound48/80)、蛋白酶激活受体-2（PAR-2）和5-羟色胺(5-HT)，根据以往的文献和预实验结果设计三种药物浓度，低剂量、中剂量和高剂量。观察皮内注射致痒剂引起的动物搔抓动作，确定动物的瘙痒程度。为使药物代谢完全，两种致痒物注射之间间隔3天。具体方法为:小鼠清醒状态下皮内注射致痒剂后立刻将小鼠放回适应过的观察笼内，在安静、无人打扰的环境下持续拍摄小鼠活动40min，由另2位不知情分组情况的研究人员计数，记录小鼠的抓挠次数。计数方法为小鼠抬起后腿朝向颈部注射部位，抓挠一次或者连续抓挠多次，然后将该腿放下，这一系列的动作计为一次抓挠，抓挠其他部位不计数。结果显示通过皮内注射致痒剂，可以有效的建立小鼠急性瘙痒模型，抓挠次数与药物剂量呈正相关，随着药物浓度增加，搔抓次数逐渐增加。氯喹100ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(153.4±10.9);组胺200ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(123.4±13.9);PAR-2100nmol皮内注射小鼠的抓挠次数为(118.0±13.3);compound48/8050ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(150.2±11.2);5-HT50nmol皮内注射小鼠的抓挠次数为(152.6±17.0)。设定此剂量为研究雌激素对急性瘙痒模型的致痒剂剂量。第二部分实验:小鼠慢性瘙痒模型的建立本部分实验旨在通过丙酮-乙醚-水(AEW)惯序涂抹方式制造小鼠干燥症瘙痒模型，评价雌性C57BL/6J小鼠慢性瘙痒模型的成功率，为探索雌激素在慢性瘙痒模型中的作用选择合适的慢性瘙痒模型。将14只C57BL/6J9周龄雌性小鼠随机分为实验组（T组，n=7）和对照组(C组，n=7)。全部于每天上午9时和下午5时涂抹溶液。T组涂抹方式:用浸泡AE溶液（丙酮和乙醚等体积混合）的棉片在剃毛处涂抹15s，再用浸泡蒸馏水的棉片于同一部位涂抹30s，连续7d;C组涂抹方式:用棉片浸润蒸馏水涂抹同样的时间。由2位不知情分组情况的研究人员分别计数小鼠1h内的抓挠次数，计数方法同第一部分实验。判断建模的成功标准为小鼠自发性抓挠超过150次/h，表皮增厚、干燥、剥脱，瘙痒相关因子表达增加。结果显示，随着造模时间的延长，T组小鼠组内比较各时间点的抓挠次数明显增多(P＜0.05);C组在不同的造模时间点对比，小鼠的抓挠次数比较差异无显著统计学意义(P＞0.05)。组间对比，第一天小鼠的抓挠次数两组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05);在造模第3、5、7天，T组小鼠抓挠次数明显多于C组(P＜0.05)。造模第7天，T组小鼠病损处皮肤出现表皮干燥、剥脱、鳞屑，C组只有轻微的干燥;HE染色显示与C组相比，T组小鼠表皮明显增厚(P＜0.05);肥大细胞的数量在T组和与C组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05);与C组相比，T组皮肤和相应的脊神经节内，MrgprA3和TRPA1mRNA的表达明显增加(P＜0.05)。造模成功率为100％，可以选择丙酮-乙醚-水(AEW)惯序涂抹制造的干皮症瘙痒模型作为慢性瘙痒模型。第三部分实验:雌激素对小鼠急性瘙痒的影响本部分实验旨在研究雌激素对小鼠急性瘙痒模型的影响。将28只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成高剂量雌激素组(E组，n=14)和低剂量雌激素组（P组，n=14）。E组小鼠卵巢切除后埋置雌激素缓释片，P组小鼠卵巢切除后埋置安慰剂，然后用不同雌激素水平的小鼠制备急性瘙痒模型。对比卵巢切除手术前、后小鼠的体质量，确定小鼠的健康状态;在瘙痒模型制备前，通过滚轴试验（Rotarod）对比E组、P组小鼠运动能力。在埋置药片10天后，进行皮下注射致痒物，比较E组、P组的急性瘙痒行为。为了使研究结果更加可靠，28只小鼠分成2部分进行实验，一部分完成氯喹、组胺、PAR-2的测试，一部分完成compound48/80和5-HT测试，为使药物完全代谢，不产生相互影响，每个行为学实验间隔3天。结果显示，组间比较，手术前、后P组、E组体质量对比，差异均无显著统计学意义(P＞0.05);组内比较，P组、E组，手术后均比术前体质量略增加(P＜0.05);滚轴试验（Rotarod）测试小鼠的运动能力，两组小鼠的活动能力正常，组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05)。与P组比较，皮内注射组胺200ug、氯喹100ug、5-HT50nmol、PAR-2100nmol compound48/8050ug引起的瘙痒在E组明显减少(P＜0.05)。第四部分实验:雌激素在小鼠慢性瘙痒中作用的实验研究本部分实验旨在研究雌激素对小鼠慢性瘙痒模型的影响及分子机制探讨。将40只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组（C组，n=12），高剂量雌激素组（E组，n=16）和低剂量雌激素组（P组，n=12）。E组和P组处理方式同第三部分实验。 P组和E组小鼠按照第二部分实验方法建立小鼠干皮症瘙痒模型，C组只切除卵巢，不进行造模处理。通过大体标本观察各组变化，通过HE染色对比各组皮肤增厚情况。在慢性干皮症瘙痒模型成功建立后提取DRG神经节中RNA，利用高通量测序筛选可能参与的瘙痒相关基因，用RT-PCR验证筛选的基因。提取各组颈背部皮肤以及血清，通过多因子测序实验(MSD)检测皮肤和血液中的炎症因子。最后用放免法检测各组血清中雌激素浓度。在细胞层面，通过钙离子成像技术观察雌激素对组胺刺激神经元细胞引起的钙内流变化，探讨雌激素对瘙痒的影响。实验结果表明，在慢性瘙痒实验中，造模第一天，各组小鼠的搔抓次数组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05);与C组比较，P组小鼠的的抓挠次数在造模第3、5、7天明显增加(P＜0.05);与C组比较，E组小鼠的抓挠次数在造模第3、5、7天也明显增加(P＜0.05);但与P组比较，E组的抓挠次数明显减少(P＜0.05)。大体标本观察，P组小鼠明显的表皮干燥、剥脱、呈现鳞屑，E组皮肤只表现为轻微干燥，表皮剥脱和鳞屑不明显;HE染色显示与C组比较，P组表皮明显增厚(P＜0.05);与P组比较，E组皮肤增厚程度明显减轻(P＜0.05);与C组比较，E组表皮明显增厚(P＜0.05)。结论: 通过本研究四部分实验，改论文能够得到以下结论: 1.皮内注射致痒物可以引起小鼠的瘙痒感受，随着致痒剂剂量增加，代表瘙痒程度的抓挠次数也增多。 2.乙醚-丙酮-水惯序涂抹可以制造小鼠干燥症瘙痒模型，造模成功率100％。 3.高浓度雌激素水平可以抑制小鼠急性瘙痒。 4.高浓度雌激素水平可以抑制慢性干皮症引起的瘙痒。 4.高浓度雌激素抑制瘙痒感觉，与DRG中GPR、MrgprA3表达减少高度相关。 5.高浓度雌激素抑制瘙痒感觉，与炎症因子IL-6表达降低相关。 6.高浓度雌激素抑制组胺刺激背根神经节神经元细胞引起的钙离子内流，抑制了神经元细胞的激活作用。收起

关键词 : 瘙痒雌激素分子机制

5. ERFVⅡ调控黄瓜耐涝性的分子机制解析

[学位论文] 王凯旋扬州大学 2021年硕士导师: 陈学好共96页

摘要 : 黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科甜瓜属一年生攀缘性草本植物，为我国主要栽培蔬菜之一。随着全球环境恶化，温室效应导致全球气候变暖，致使雨涝灾害现象频频发生。19年在我国江南和华南地区，年雨涝频率超过30％，涝害已成为危害作物生长的重要制... 展开黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科甜瓜属一年生攀缘性草本植物，为我国主要栽培蔬菜之一。随着全球环境恶化，温室效应导致全球气候变暖，致使雨涝灾害现象频频发生。19年在我国江南和华南地区，年雨涝频率超过30％，涝害已成为危害作物生长的重要制约因子。黄瓜由于其根系入土浅、通气组织不发达、吸收能力弱、再生能力差极易受涝胁迫危害。受涝后的黄瓜幼苗出现子叶褪绿变黄，真叶皱缩弯曲停止生长，下胚轴变脆开裂且易折断。成株期受涝则会影响其果实产量及品质。涝胁迫后下胚轴产生的不定根数是黄瓜耐涝性强弱的特征性表型。前期通过对黄瓜种质资源苗期耐涝性鉴定，筛选出耐涝品系Zaoer-N，对耐涝品系Zaoer-N进行连续多年淹涝观察均发现其下胚轴形成不定根能力强。下胚轴上产生的不定根可迅速取代因缺氧而逐渐凋亡的初生根，从环境中快速吸收氧气和营养物质，以缓解涝胁迫危害。乙烯响应因子(Ethylene response factor，ERF)第七亚家族(ERFVII)基因参与淹涝和低氧适应性反应。本研究采取形态解剖学、生理学及分子生物学等多种手段相结合，旨在探索ERFVII在涝胁迫诱导不定根形成中的作用，解析不定根发生的机制。主要研究结果如下: 1、淹涝结合乙烯合成前体ACC处理显著促进涝胁迫条件下不定根的形成，而淹涝结合乙烯合成抑制剂AOA处理，则极显著抑制不定根的形成。高效液相色谱测定结果表明:淹涝处理后，ACC的含量随着涝胁迫时间的延长在逐步提升，尤其在6h和48h这两个时间点出现显著提升;进一步对乙烯释放量测定的结果显示:淹涝48h后Zaoer-N下胚轴乙烯释放量显著高于未淹涝对照。以上研究结果表明，乙烯参与涝胁迫下黄瓜下胚轴不定根的形成过程。 2、黄瓜基因组中共鉴定到5个ERFVII家族基因，分别为CsERF7-1、CsERF7-2、CsERF7-3、CsERF7-4、CsERF7-5。qRT-PCR结果表明:涝胁迫处理后，CsERF7-1、CsERF7-2、CsERF7-5表达无显著规律性，而CsERF7-3与CsERF7-4在整个淹涝过程中表达量与未淹涝对照间存在显著差异，且CsERF7-4是CsERF7-3表达量的5倍以上。 3、为验证CsERF7-4基因在植物细胞中的作用部位，构建了融合表达载体pCAMBIA1301-CsERF7-4-GFP，通过农杆菌瞬时转化烟草表皮细胞中观察荧光信号所在位置的方法，验证了CsERF7-4的亚细胞定位。结果表明:CsERF7-4蛋白定位于细胞核中。 4、为了进一步明确CsERF7-4调控黄瓜不定根形成的功能，构建了干扰载体35S∷iCsERF7-4，通过农杆菌介导转化黄瓜Zaoer-N，共得到抗性苗4株。通过对转基因株系CsERF7-4基因的表达分析，发现CsERF7-4基因的表达量显著下调，仅有野生型的50％左右。进一步对转基因株系进行淹涝处理发现:RNAi植株下胚轴无不定根形成，而野生型植株下胚轴有大量不定根形成，表明CsERF7-4参与涝胁迫条件下黄瓜不定根的形成。 5、对RNAi株系与野生型的下胚轴淹涝后的转录组测序及生物信息学分析发现:与糖代谢相关、细胞壁相关、激素相关、抗氧化相关、转录因子相关的基因表达受到调控。进一步通过qRT-PCR验证了CsaV3_3G007750，CsaV3_2G034700，CsaV3_4G014880差异表达基因参与黄瓜涝肋迫应答反应。 6、使用凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)研究了CsERF7-4与下游基因启动子区域ATCTA的结合能力结果显示:含有ATCTA元件的wt探针能够与CsERF7-4蛋白结合形成迁移条带，而不含ATCTA元件的突变型探针(GCTCG)则不能与CsERF7-4蛋白结合形成迁移条带。该结果表明:CsERF7-4能够通过结合下游基因启动子区域的ATCTA元件以调控CsARN6.1表达。收起

关键词 : 黄瓜耐涝性 ERFVⅡ 分子机制

6. 虾青素对线虫寿命的影响及其分子机制研究

[学位论文] 丁锋哈尔滨工业大学 2020年硕士导师: 赵燕共68页

摘要 : 寿命是生命体从出生经过生长发育、成熟、老化最后死亡，所有生存时间的总和。基因和环境因素通过调节衰老速率影响生物体寿命的长短。虾青素是一种天然抗氧化活性剂，能够有效降低机体内活性氧水平，对于癌症、糖尿病、胃肠道疾病、肝脏疾病、神经退... 展开寿命是生命体从出生经过生长发育、成熟、老化最后死亡，所有生存时间的总和。基因和环境因素通过调节衰老速率影响生物体寿命的长短。虾青素是一种天然抗氧化活性剂，能够有效降低机体内活性氧水平，对于癌症、糖尿病、胃肠道疾病、肝脏疾病、神经退行性疾病、皮肤病等多种疾病均有潜在的预防作用。本研究以N2野生型秀丽隐杆线虫为模型，研究虾青素对线虫寿命的影响及其主要机制。研究发现，用虾青素（0.5μg/mL-20μg/mL）处理线虫，随着虾青素浓度的提高，线虫寿命有一定程度的延长，当虾青素浓度为10μg/mL及20μg/mL时，线虫平均寿命分别延长了14.29%和19.84%。对线虫生理状态观察的结果显示，虾青素处理对线虫的体积及有效产卵量没有影响，但当虾青素浓度为1μg/mL-20μg/mL时，线虫的弯曲频率及移动力显著升高。检测线虫体内的活性氧水平发现，虾青素处理有效降低了线虫体内的活性氧水平，其中，在虾青素为20μg/mL时，线虫体内的活性氧含量下降了51.22%，抗氧化应激实验结果显示，虾青素浓度为5μg/mL、10μg/mL及20μg/mL时，虾青素处理能够有效降低氧化损伤导致的线虫体内活性氧水平的上升，并增加线虫在氧化应激条件下的存活率。实时荧光定量PCR结果显示，在10μg/mL及20μg/mL虾青素处理条件下，sod-1、sod-2、sod-3、ctl-1、ctl-2、ctl-3及skn-1基因的表达水平均呈现下降趋势，其中ctl-3基因的表达水平在10μg/mL及20μg/mL虾青素处理时分别下降了25.95%和38.07%，与对照相比具有显著性差异。对胰岛素/IGF-1信号通路关键基因的研究发现，daf-2、akt-1、akt-2及daf-16基因的表达水平在虾青素处理条件下没有显著的变化；而age-1基因的表达水平呈显著下降趋势，在20μg/mL虾青素处理时age-1基因表达水平下降了26.35%。在10μg/mL及20μg/mL虾青素处理条件下，mTOR信号通路关键基因ifg-1和rsks-1的表达水平没有显著的变化，而let-363基因的表达水平在10μg/mL和20μg/mL虾青素处理下分别下降了55.98%和58.72%。另外，在20μg/mL虾青素处理条件下，pha-4基因的表达水平上升了45.99%。age-1和let-363基因下调或敲除可以显著延长线虫的寿命，而过量表达pha-4基因增加线虫的抗应激能力并延长线虫寿命。因此，虾青素延长线虫寿命可能与其影响这些基因的表达相关。本论文结果发现，虾青素处理能够有效延长线虫寿命，其分子机制可能与其降低线虫体内的活性氧水平和调控胰岛素/IGF-1及mTOR信号通路相关基因的表达有关。这一研究有助于深入了解虾青素的抗衰老机制，为后续虾青素在抗衰老中的应用提供实验依据。收起

关键词 : 虾青素寿命分子机制

7. 生物钟基因DEC2调控睡眠的分子机制的研究

[学位论文] 冯旭征华中科技大学 2017年硕士导师: 张珞颖共68页

摘要 : 睡眠作为一项重要的生命过程，占了人生约1/3的时间，与人类的生理及心理健康密切相关。随着现代社会压力的增大，越来越多人出现睡眠障碍。因此，睡眠问题受到越来越多人的关注，对睡眠调控机制做深入研究迫切需要。已报道文章发现生物钟基因DEC2的3... 展开睡眠作为一项重要的生命过程，占了人生约1/3的时间，与人类的生理及心理健康密切相关。随着现代社会压力的增大，越来越多人出现睡眠障碍。因此，睡眠问题受到越来越多人的关注，对睡眠调控机制做深入研究迫切需要。已报道文章发现生物钟基因DEC2的384位点发生突变（P384R）后会引起人类睡眠减少约2h，并且发现携带人类hDEC2-P384R与携带hDEC2-WT的小鼠相比表现出活动增加、睡眠减少的表型，进一步研究发现在果蝇脑内调控睡眠的核心脑区蘑菇体表达小鼠mDEC2-P384R会导致该突变型果蝇睡眠减少。本课题组前期研究发现一系列与睡眠相关的基因在hDEC2-P384R小鼠中表达发生改变，并发现于果蝇蘑菇体表达hDEC2-P384R的雄蝇在持续黑暗（DD）条件下有睡眠显著减少的表型。为了深入探索生物钟基因DEC2调控睡眠的分子机制，本研究以果蝇为研究对象。基于前期研究发现一系列与睡眠相关的基因在hDEC2-P384R小鼠中表达发生改变，本研究在果蝇中利用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测这些基因的同源基因是否受到DEC2-P384R突变的影响，结果发现有10个基因的mRNA水平发生显著改变，其中Clock、se、VGlut、ND-20、AP1γ、5-HT7基因的变化方向与小鼠中相同，CG32164、Gsts1、Erk7、Tbh基因变化方向相反。随后利用se1突变体，AP1γ5H2064突变体，TbhNP0208突变体以及Tbh RNAi，VGlut RNAi品系的果蝇并检测它们是否与DEC2-P384R互作影响睡眠，结果发现:（1）se、AP1γ、VGlut、Tbh均有可能与DEC2-P384R互作影响睡眠；（2）se1突变影响睡眠；（3）AP1γ5H2064突变增加睡眠。综上所述，本研究发现了se、AP1γ、VGlut、Tbh共4个可能与DEC2-P384R互作的基因，重要的是在果蝇中发现了se和AP1γ为2个影响睡眠的新基因，为DEC2调控睡眠的机制研究打开了新方向，同时也揭示了睡眠调节的新机理。收起

关键词 : 睡眠分子机制 DEC2基因

8. 双氯芬酸通过热化疗抑制胃癌增殖的分子机制

[学位论文] 欧阳鹏广州医科大学 2017年硕士导师: 崔书中共65页

摘要 : 目的： 1、初步探讨体外双氯芬酸（DCF）单药以及联合DDP在37℃、43℃对胃癌细胞增殖、侵袭、转移的影响，分析可能的作用机制； 2、初步探讨DCF通过热化疗作为药物抗胃癌的可行性。方法：本研究通过体外模拟DC F通过热化疗治疗... 展开

关键词 : 胃癌双氯芬酸药理活性分子机制

9. 基于减重降脂探析“一味丹参,功同四物”的分子机制

[学位论文] 艾梓黎江西中医药大学 2023年博士导师: 左铮云共175页

摘要 : 目的：基于减重降脂探析“一味丹参，功同四物”新的功同。本研究利用网络药理学预测丹参和四物汤的有效成分及其通路，通过微生物多样性、代谢组学及转录组学等方法明确丹参和四物汤减重降脂的机制异同，为“一味丹参，功同四物”的研究提供实... 展开目的：基于减重降脂探析“一味丹参，功同四物”新的功同。本研究利用网络药理学预测丹参和四物汤的有效成分及其通路，通过微生物多样性、代谢组学及转录组学等方法明确丹参和四物汤减重降脂的机制异同，为“一味丹参，功同四物”的研究提供实验依据。方法： 1.基于中医学说和文献研究阐明“一味丹参，功同四物”的理论。通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）等数据库及相关文献，以“OB≥30%、DL≥0.18”为筛选标准，建立丹参、四物汤成分数据库；通过靶标识别服务平台分析、预测活性化合物潜在作用靶点；通过DAVID平台对丹参、四物汤作用靶点进行疾病富集分析预测丹参和四物汤功同作用的潜在疾病。 2.利用广泛靶向代谢组学对丹参和四物汤进行成分鉴定。将12只体重160±20g雄性SD大鼠分为空白对照组（Ctrl）、丹参给药组（Sal）和四物汤给药组（SWD），每组6只。Sal组和SWD组分别灌胃给药2.7g/kg和3.24g/kg，空白组予以等体积生理盐水以对照，连续灌胃14天以明确两者的有效成分。通过血清非靶向代谢组学分析丹参和四物汤的入血成分。 3.用高脂肪饮食（HFD）构建肥胖大鼠模型，将40只大鼠分为5组：正常组（Control）、高脂模型组（HFD）、高脂模型加丹参组（HFD+2.7g·kg-1Sal）、高脂模型加四物汤组（HFD+3.24g·kg-1SWD）和高脂模型加奥利司他组（HFD+0.03g·kg-1Orlistat），每组8只。每周定时观察大鼠体质量、食物摄入量及活动状态等一般情况；连续给药8周后称重麻醉处死大鼠，腹主动脉取血检测血脂水平；取腹部、附睾及肾周脂肪组织计算脂体比（BFI）；取脂肪组织和肝脏进行Hamp;E染色；ELISA试验检测肝脏和脂肪组织中的环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）和激素敏感性甘油三酯脂肪酶（HSL）的水平；收集大鼠粪便进行微生物多样性和脂质组学（LC-MS）检测；收集肝脏组织进行转录组学检测；荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路上相关mRNA的表达；蛋白免疫印迹法（WB）检测肝脏组织中PPAR和MAPK信号通路的表达情况。结果： 1.网络药理学预测丹参和四物汤功同之一可能是减肥降脂通过Uniprot网站构建丹参和四物汤的靶点，两者对应靶点分别为635、707个，同时含有453个相同靶点，占到总靶点的51%。以疾病对靶点进行富集分析，结果显示，“肥胖”与丹参、四物汤均有很高的关联度。“靶点-信号通路”网络图显示丹参、四物汤潜在的“减重降脂”的作用可能与MAPK信号通路有关。 2.丹参和四物汤的有效成分是减重降脂的物质基础通过广泛靶向代谢组学，利用液相色谱串联质谱技术对丹参和四物汤进行成分鉴定。丹参共筛选出788个代谢物，包括酚酸类、有机酸、脂质等，其中酚酸类和脂质占主要地位。物质相对含量排名靠前的包括丹酚酸A、丹参素、隐丹参酮、丹参环庚三烯酚酮、次甲丹参醌等。四物汤筛选出931个代谢物，包括有机酸、酚酸类、游离脂肪酸等。与丹参相同，酚酸类和脂质占主要地位。物质相对含量排名靠前的包括柠檬酸、没食子酸、洋川芎内酯A、芍药内酯苷、L-哌啶酸等。这些有效成分绝大部分均具有调节脂肪代谢的作用，表明丹参和四物汤的主要有效成分是减重降脂的物质基础。 3.非靶向代谢组学表明丹参和四物汤的入血成分与脂质代谢密切相关血清非靶向代谢组学研究显示，丹参和四物汤给药后大鼠体内部分代谢物如5-O-p-Coumaroylquinicacid、Phenylalanine、12-Hydroxyoctadecanoicacid、PS(18:1(9Z)/0:0)出现了显著差异。相较于未经药物干预的正常大鼠，丹参干预后25个差异代谢物发生了变化，包括增加了9个代谢物的表达，降低了14个代谢物的表达（Plt;0.01）；四物汤干预后改变了大鼠30个差异代谢物的表达，其中12种代谢物有明显的升高（Plt;0.01），18种有明显的降低。差异代谢物KEGG分类显示代谢物在代谢通路如氨基酸和生物合成、苯丙氨酸代谢物、2-氧羧酸代谢上有较多表达。 4.丹参和四物汤均可有效减重降脂正常组大鼠精神状态良好，毛发浓密，未见明显脱落；模型组大鼠精神欠佳，毛发稀疏脱落，活动力减少。经丹参、四物汤和阳性对照药奥利司他治疗8周后，大鼠精神状态改善，体重增速减缓，脂体比、腰围、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、葡萄糖（GLU）和游离脂肪酸（FFA）的水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）的水平升高（Plt;0.01）。正常组镜下观察肝组织显示肝小叶结构完整有序且紧密，高脂肪饮食诱导的大鼠肝脏中有明显的脂滴堆积，凹陷性坏死浸润伴球囊样改变。显微镜下观察脂肪组织，模型组脂肪细胞轮廓和体积增大。丹参、四物汤和奥利司他的干预有效减轻高脂肪饮食诱导的肥胖大鼠的肝脏脂质积累、脂肪变性和脂肪细胞增生。ELISA检测脂质因子表达显示模型组大鼠肝脏及脂肪组织中的cAMP、PKA和HSL的表达较正常组明显降低，而治疗组则与之相反，且有显著性差异（Plt;0.05，Plt;0.01），提示丹参和四物汤发挥减重降脂的作用与调节脂质因子表达有关。 5.丹参和四物汤对肥胖大鼠的减重降脂与调节肠道菌群有关利用16SrDNA测定肠道菌群结构，结果显示各组间样本完全分离，组间差异显著。丹参显著回调肥胖大鼠肠道菌群的多样性，四物汤对肠道菌群多样性的影响无显著差异。在门水平和属水平上两者均提高了有益菌如Proteobacteria、Actinobacteriota的相对丰度（Plt;0.05），降低了有害菌Firmicutes、Patescibacteria的相对丰度（Plt;0.05）。环境因子关联分析显示，BFI、体重、GLU、FFA与Blautia、Quinella、Ruminococcus呈正相关、TG、TC、LDL-C与Turicibacter、Desulfovibrio、Lactobacillus呈正相关，与NK4A214_group、Facklamia、Jeotgalicoccus呈负相关，HDL-C则表现出相反结果。cAMP、PKA和HSL与模型组呈负相关，与正常组、Sal组、SWD组和奥利司他组呈正相关。 6.丹参和四物汤对肥胖大鼠的减重降脂作用与调节脂质代谢产物有关对粪便代谢物进行非靶向代谢组学检测，结果显示丹参和四物汤可改变肥胖大鼠代谢物表达水平，如丹参改善了TG、DG、CL、Hex1Cer和Cer等代谢物的水平（Plt;0.05）；四物汤则改善了TG、DG、OAHFA、PC和Cer等代谢物的水平（Plt;0.05）；丹参和四物汤均改善了DG(22:6/22:6)、TG(4:0/14:1/18:3)、TG(15:0/18:2/22:6)、TG(18:2/18:2/20:4)、Cer(d16:0/21:0)的水平且差异有统计学意义（Plt;0.05）。差异代谢物KEGG富集分析显示丹参和四物汤主要通过调节甘油酯代谢、脂肪的消化与吸收等通路发挥减重降脂的作用。 7.丹参和四物汤对肥胖大鼠的减重降脂作用与调节肝脏转录组基因表达有关对肝脏组织进行转录组学研究，结果表明丹参改变了肥胖大鼠587个差异基因的表达水平，其中256个基因显著上调，331个基因显著下调（Plt;0.05）；四物汤改变了肥胖大鼠699个差异基因的表达水平（Plt;0.05），其中291个基因显著上调（Plt;0.05），408个基因显著下调（Plt;0.05）；奥利司他改变了肥胖大鼠1099个差异基因的表达水平，其中481个基因显著上调（Plt;0.05），618个基因显著下调（Plt;0.05）。差异基因KEGG富集分析显示丹参和四物汤主要通过脂质代谢如甘油酯代谢、脂肪酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成等通路参与减重降脂作用的发挥。 8.丹参和四物汤有效减重降脂作用可能与其调控PPAR和MAPK信号通路有关整合各组别的差异表达基因及代谢产物寻找可能的作用靶点，通过对差异代谢产物与差异基因综合分析找到关键基因PLC-γ1、LPL和Cyp7a1，结合差异代谢集和差异基因集富集到通路结果和网络药理学的结果，选取PPAR和MAPK信号通路进行基因和蛋白的验证。RT-PCR结果显示：Sal、SWD和奥利司他显著上调Raf、ERK1/2、PPARα、Adiponectin、CPT1、LPL、Cyp7a1的表达（Plt;0.05，Plt;0.01），降低了p38MAPK、PPARγ、CEBPα、FAS、SREBP-1c、aP2、PLC-γ1的mRNA表达（Plt;0.05，Plt;0.01）。Sal增加了Ras、MEK的mRNA表达而SWD则表现出了相反作用。WB结果显示：Sal组、SWD组和奥利司他组肝脏组织中p38MAPK、P-p38MAPK、ERK1/2、PPARγ、CEBPα、PLC-γ1的蛋白表达水平显著下降（Plt;0.05，Plt;0.01），PPARα、Adiponectin则上升（Plt;0.05，Plt;0.01）。总之，Sal和SWD减重降脂的作用可能与抑制MAPK及CEBP信号通路活化，进而干预PPAR信号通路，减少脂质生成有关。 9.丹参和四物汤通过不同机制实现相同功效丹参和四物汤各有其特有的成分，这些化学成分通过相同或不同的机制发挥减重降脂作用；同时，丹参和四物汤对不同菌群结构、脂质代谢物和转录基因影响不同，故而可能通过介导不同通路发挥相关作用。在本研究中，丹参和四物汤对MAPK和PPAR信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达也表现出了不同的影响，包括丹参促进了ERK1/2磷酸化，而四物汤则表现出抑制趋势；丹参提高了Ras/Raf/MEK/ERK通路mRNA的表达，四物汤则降低了Ras、MEKmRNA的表达，提高了Raf和ERKmRNA的表达。结论：丹参和四物汤可能通过干预并调节高脂肪饮食诱导的肥胖大鼠体内的脂质因子、肠道菌群及代谢物、肝脏转录基因及PPAR和MAPK信号通路上的相关基因和蛋白发挥等效减重降脂的作用。然其不同之处在于两者的成分不同，且对部分菌群结构、脂质代谢物和转录基因影响不同，故而可能通过不同机制发挥相同或不同的作用。研究表明，丹参和四物汤在减重降脂方面具有相同作用，揭示了“一味丹参，功同四物”的现代科学内涵。收起

关键词 : 丹参四物汤减重降脂分子机制

10. TRIM27调控细胞自噬的分子机制研究

[学位论文] 杨义中国科学技术大学 2021年博士导师: 管俊林；吴缅共171页

摘要 : 大自噬/自噬是真核生物的一种保守的降解途径。通过自噬，细胞质中异常聚集或错误折叠的蛋白及受损的细胞器等物质被一种称为自噬体的双层膜结构吞噬后呈递给溶酶体（多细胞动物中）或液泡（酵母及植物中），并在相关水解酶的作用下降解。自噬在正常生... 展开大自噬/自噬是真核生物的一种保守的降解途径。通过自噬，细胞质中异常聚集或错误折叠的蛋白及受损的细胞器等物质被一种称为自噬体的双层膜结构吞噬后呈递给溶酶体（多细胞动物中）或液泡（酵母及植物中），并在相关水解酶的作用下降解。自噬在正常生理条件下水平较低，被称为基础自噬，基础自噬保证生物大分子的循环回收利用并维持细胞稳态。而在饥饿、生长因子缺乏及低氧等一些因素的诱导下，自噬水平显著上调以维持细胞在相应压力下的生命活动及存活。细胞自噬的功能失调已被证实可促进包括神经退行性疾病及肿瘤在内的多种人类疾病的发展。自噬是一个受到多个自噬相关蛋白调控的多步骤连续过程。在这些自噬相关蛋白中，丝氨酸/苏氨酸激酶ULK1通过与ATG13、FIP200和ATG101形成复合体在调控自噬启动的过程中发挥关键作用。在酵母中，Tor1（哺乳动物mTOR的同源蛋白）复合体以营养依赖的方式动态调节Atg1（哺乳动物ULK1的同源蛋白）复合体的形成，从而诱导或抑制自噬。在饥饿条件下，Atg1复合体的形成促进了自噬的发生。然而，在哺乳动物中，ULK1复合体在饥饿诱导自噬之前已经形成，说明复合体本身的存在并不足以启动自噬。ULK1复合体成员间这种非营养依赖式的稳定结合表明存在其他因子参与了对饥饿诱导的自噬起始的调控。此外，最近的报道表明，ULK1在饥饿条件下迅速降解，提示自噬水平必须受到严格调控。然而，仅有相对较少的研究对细胞如何抑制自噬的精确机制进行了揭示，并且ULK1复合体如何被调控很大程度上仍未知。在本研究中，我们首先通过蛋白组学分析鉴定出泛素连接酶TRIM27是FIP200-ATG13-ULK1复合体的一个新结合蛋白。我们发现在正常营养条件下TRIM27与ULK1直接结合，而饥饿条件使该结合亲和力增强。进一步的生化实验分析表明TRIM27催化ULK1的K568及K571位点发生K48连接的泛素化修饰，该修饰促使ULK1通过蛋白酶体途径降解，并进一步下调细胞自噬水平。与通过体外实验揭示的调控模式一致，我们发现Trim27-/-小鼠主要器官中的基础自噬水平升高，进一步证实TRIM27是一个自噬的负调控因子。接下来，从饥饿条件下与TRIM27结合的蛋白中，我们鉴定出丝氨酸/苏氨酸激酶STK38L是调控饥饿诱导自噬时TRIM27与ULK1结合亲和力增强的关键因子。我们发现，在饥饿条件下，TRIM27促进STK38L的K181/K215/K224/K432/K434位点发生K6及K11连接的非促进降解型泛素化修饰以激活STK38L。被激活后的STK38L催化ULK1的S495位点发生磷酸化修饰，该修饰使ULK1更容易被TRIM27介导泛素化修饰与降解。通过上述机制，TRIM27与STK38L协同调控了ULK1在饥饿条件下的快速降解，该调控限制了饥饿诱导下自噬的激活程度，防止细胞处于过度自噬的状态。我们研究的第二个关键方面在于评估TRIM27-ULK1信号轴在乳腺肿瘤中的意义。借助生物信息学手段结合对临床样本的分析，我们发现TRIM27在乳腺癌中的mRNA及蛋白水平显著上调，且TRIM27和ULK1之间的蛋白水平呈负相关，提示TRIM27-ULK1信号轴促进肿瘤发生。我们进一步利用MMTV-PyMT模型评估TRIM27-ULK1信号轴对小鼠乳腺肿瘤发生发展的影响。该模型小鼠可自发形成乳腺肿瘤且其病变过程在分子及组织学层面同人类乳腺癌高度相似。通过在该模型中的研究，我们发现Trim27敲除对MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤的发生起到显著的抑制作用。但当肿瘤形成后，Trim27敲除的乳腺肿瘤表现出肺转移的增加。最后，鉴于TRIM27的促癌作用可能通过其他潜在靶点引起，而非通过自噬途径。我们通过体外三维培养系统评估Trim27敲除对PyMT肿瘤细胞生长的影响。利用ULK1的小分子抑制剂处理及敲除自噬核心蛋白ATG5和ATG7，我们发现Trim27基因敲除通过提高自噬水平显著促进来自PyMT小鼠的肿瘤在三维培养下的生长。此外，在通过小鼠乳腺肿瘤细胞4T1构建的小鼠模型中，乳腺肿瘤的肺转移被靶向ULK1的小分子化合物抑制剂显著抑制，进一步证明了自噬对于促进肿瘤转移的重要性。综上所述，我们的研究鉴定出泛素连接酶TRIM27和激酶STK38L是自噬起始复合体中ULK1的两个新的结合蛋白。在正常营养条件下，TRIM27通过泛素化修饰ULK1促进其降解从而抑制基础自噬;在饥饿条件下，TRIM27通过泛素化修饰激活STK38L，促进后者对ULK1的磷酸化修饰作用，从而使ULK1更易于被TRIM27介导降解。TRIM27与STK38L对ULK1的协同调控限制了饥饿条件下的自噬水平。来自小鼠模型的证据进一步表明，Trim27基因敲除后小鼠的基础自噬水平升高，并且TRIM27促进MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤发生，而在乳腺癌晚期通过抑制自噬通路实现抑制乳腺肿瘤的肺转移。我们的研究揭示了STK38L-TRIM27-ULK1信号轴在调控自噬中的关键作用，并在乳腺肿瘤模型中建立了自噬与肿瘤发生发展的相关性，为开发以自噬为靶点的干预癌症的治疗策略提供了新思路。收起

关键词 : 细胞自噬 TRIM27调控分子机制