中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. O-GlcNAc修饰介导的细胞自噬在上皮性卵巢癌顺铂耐药中的作用及其机制研究

[学位论文] 周福兴空军军医大学 2019年博士导师: 陈必良共96页

摘要 : 研究背景上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)作为妇科常见恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤首位.由于EOC发病位置隐匿,缺乏早期特异性诊断指征,约70%患者发现时已处于晚期.目前,EOC患者的标准治疗方案是外科手术加以铂类为基础的... 展开研究背景上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)作为妇科常见恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤首位.由于EOC发病位置隐匿,缺乏早期特异性诊断指征,约70%患者发现时已处于晚期.目前,EOC患者的标准治疗方案是外科手术加以铂类为基础的化疗,虽然手术和化疗方案不断改进,但是晚期EOC患者仍有80%的复发风险,究其原因主要是由于肿瘤细胞化疗耐药的产生.因此探究EOC化疗耐药产生的相关机制以及分子调控网络,并制定有效的防治措施成为改善EOC患者预后的首要任务. O-GlcNAc修饰是一种蛋白的翻译后修饰方式,参与细胞内多种蛋白的修饰.研究发现O-GlcNAc修饰的异常与多种肿瘤的发生发展以及预后相关,但是O-GlcNAc修饰在EOC化疗耐药中的研究相对较少.自噬作为一种自我保护机制能够帮助细胞抵抗外界恶劣环境,正是这种自我保护能力增加了肿瘤细胞对化疗药物的耐受性,但是化疗耐药过程中自噬增强的相关机制目前尚不清楚.研究发现参与调控自噬溶酶体形成的SNAP-29蛋白能被O-GlcNAc所修饰,SNAP-29主要通过与Stx17和VAMP8结合形成SNARE复合体介导自噬小体和溶酶体的融合过程.但是SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平是否影响卵巢癌细胞的自噬目前尚不清楚. 综合上述背景,我们提出科学假设:EOC化疗耐药形成过程中,SNAP-29的O-GlcNAc修饰减少,促进其与Stx17和VAMP8结合形成SNARE复合体,介导自噬溶酶体的形成,继而增强细胞自噬水平,提高卵巢癌细胞的化疗耐药性. 研究目的通过临床标本分析O-GlcNAc、OGT和OGA在EOC中的表达情况,明确三者表达量与化疗耐药的相关性,探究OGT介导的O-GlcNAc修饰对卵巢癌细胞化疗耐药的影响,阐明自噬在O-GlcNAc修饰介导的EOC化疗耐药中的作用及其相关分子机制. 研究方法 1.检测EOC临床标本中糖基化相关蛋白的表达水平.收集EOC临床标本,按照化疗效果分为耐药组和敏感组,比较两组患者年龄、肿瘤分期和病理类型有无差异;利用免疫组化检测O-GlcNAc、OGT和OGA的表达水平,统计学分析三者在两组标本中表达有无差异. 2.下调OGT对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响.利用shRNA慢病毒下调卵巢癌细胞内OGT表达水平,建立OGT低表达细胞株,通过Westernblot进行验证.首先在体外实验中观察下调OGT对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,然后通过体内体外实验检测下调OGT后卵巢癌细胞对化疗药物敏感性的变化情况. 3.下调OGT对卵巢癌细胞自噬的影响.利用Westernblot检测OGT下调后自噬相关蛋白的表达情况;利用免疫荧光观察OGT下调后LC3的表达和分布情况;利用LC3双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染细胞,观察OGT下调后细胞自噬流的变化情况;通过透射电镜从形态学上观察OGT下调后卵巢癌细胞自噬结构形态和构造的变化情况. 4.下调OGT对细胞自噬溶酶体形成的影响.利用自噬溶酶体抑制剂Baf和自噬小体抑制剂3-MA分别抑制细胞自噬后,观察OGT低表达细胞对顺铂敏感性的变化情况,并比较两组有无差异;通过转染mRFP-LC3质粒,荧光共定位检测mRFP-LC3和溶酶体标志物Lamp1的共定位情况,明确下调OGT对自噬溶酶体形成的影响. 5.OGT通过SNAP-29调控细胞自噬.通过siRNA技术下调SKOV3细胞的SNAP-29表达水平,Westernblot进行验证;通过Westernblot检测下调SNAP-29后自噬相关蛋白的表达情况;通过LC3荧光双标检测下调SNAP-29后自噬流的变化情况;转染SNAP-29-GFP和RFP-LC3质粒,检测OGT下调前后SNAP-29与LC3的共定位情况. 6.SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平影响SNARE复合体形成.通过Westernblot检测下调OGT对SNAP-29表达量的影响;通过Co-IP检测下调OGT对SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平的影响.构建SNAP-29的O-GlcNAc修饰位点突变质粒,与对照组质粒分别转染细胞,通过Co-IP检测SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平的变化情况,通过Westernblot检测细胞自噬相关蛋白,通过荧光共定位检测SNAP-29和LC3的共定位情况,通过Co-IP检测SNAP-29与Stx17和VAMP8的结合情况. 研究结果 1.耐药组标本中O-GlcNAc表达降低.对比耐药组和敏感组临床资料,两组年龄、肿瘤分期和病理类型无统计学差异.相对于敏感组,耐药组O-GlcNAc和OGT表达水平明显降低,OGA表达水平两组之间无统计学差异. 2.下调OGT增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性.通过携带OGTshRNA的慢病毒感染卵巢癌细胞(A2780和SKOV3),成功建立OGT低表达细胞株.CCK8检测发现下调OGT对卵巢癌细胞增殖无影响,但给予顺铂处理后下调OGT能够降低顺铂对卵巢癌细胞的增殖抑制作用.流式细胞术检测发现下调OGT对卵巢癌细胞的凋亡无影响;当用顺铂处理细胞后,检测细胞凋亡发现OGT低表达的卵巢癌细胞的凋亡率明显降低.CCK8和流式细胞术检测发现下调OGT后不影响卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性.裸鼠荷瘤实验结果与细胞学实验结果一致,下调OGT不影响肿瘤的生长速度,但是能够增加卵巢癌的顺铂耐药性. 3.下调OGT增强卵巢癌细胞自噬水平.Westernblot检测发现下调OGT后卵巢癌细胞内p62水平明显降低,而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显增高;免疫荧光检测发现下调OGT后LC3荧光颗粒明显增多;LC3荧光双标检测发现下调OGT的卵巢癌细胞中的红色荧光点明显增加;透射电镜检测发现顺铂处理后OGT低表达细胞内自噬泡明显增多. 4.下调OGT促进卵巢癌细胞内自噬溶酶体的形成.Baf和3-MA处理细胞后,CCK8和流式细胞术检测发现下调OGT引起的细胞顺铂耐药被部分逆转,其中Baf作用更加明显;荧光共定位检测mRFP-LC3和Lamp1的共定位情况,发现下调OGT后LC3与Lamp1的共定位增多. 5.OGT通过SNAP-29调控细胞自噬.通过siRNA技术下调SKOV3细胞内SNAP-29表达水平,Westernblot检测发现下调SNAP-29后细胞内p62蛋白表达量增多,LC3-II和I表达量均增多;通过LC3荧光双标检测下调SNAP-29后自噬流的变化情况,发现OGT低表达细胞内GFP+RFP+荧光颗粒明显增多,自噬流受阻;转染SNAP-29-GFP和RFP-LC3质粒,荧光共定位检测发现OGT下调后SNAP-29与LC3的共定位明显增多. 6.SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平影响SNARE复合体形成.Westernblot检测发现下调OGT后不影响SNAP-29的表达量,但是降低了SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平.突变SNAP-29蛋白的O-GlcNAc修饰位点后,SNAP-29与Stx17和VAMP8的结合增多,细胞自噬水平升高. 研究结论 1.O-GlcNAc和OGT表达水平与EOC化疗耐药相关,下调OGT能够增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性. 2.下调OGT通过促进自噬溶酶体的形成诱导细胞自噬,从而增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性. 3.下调OGT引起SNAP-29蛋白的O-GlcNAc修饰水平降低,促进其与Stx17和VAMP8结合形成SNAP-29-Stx17-VAMP8复合体,从而介导自噬小体和溶酶体的融合,促进自噬. 收起

关键词 : 卵巢癌顺铂耐药 O-GlcNAc修饰细胞自噬

2. sOGT蛋白O-GlcNAc修饰位点定位及其对sOGT功能影响

[学位论文] 孙红南开大学 2012年硕士导师: 张连文共60页

摘要 : O-GlcNAc是广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰。研究表明，O-GlcNAc修饰与神经退行性疾病、糖尿病、癌症等许多疾病密切相关。O-GlcNAc修饰过程由Ⅳ_乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)共同调节完... 展开

关键词 : N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 sOGT蛋白 O-GlcNAc修饰 O-GlcNAc修饰位点定位功能影响

3. O-GlcNAc修饰在乳腺癌转移过程中的作用及其机制研究

[学位论文] 顾玉超中国海洋大学 2008年博士导师: 于文功共116页

摘要 : O-GIcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰；与经典的糖基化修饰不同，它主要分布在细胞浆和细胞核中。O-GlcNAc修饰基团的添加和移除分别是由糖基转移酶(O-GIeNActransferase，OGT)和糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA... 展开 O-GIcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰；与经典的糖基化修饰不同，它主要分布在细胞浆和细胞核中。O-GlcNAc修饰基团的添加和移除分别是由糖基转移酶(O-GIeNActransferase，OGT)和糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)完成的。O-GlcNAe不仅参与了生物体绝大多数正常生理功能的调控，还可能在多种疾病的发病过程中发挥重要的作用，近年来的一些研究已经证明O-GlcNAc的异常与神经退行性疾病、糖尿病和心血管疾病等相关。然而，在O-GlcNAc与肿瘤的研究方面，虽然目前已发现多种与肿瘤相关的蛋白可以被0-GlcNAc修饰(例如p53、c-Mye等)，但是O-GlcNAc与肿瘤的确切关系或者说O-GlcNAc是否参与了肿瘤发生和发展过程还未见报道。因此，本论文对O-GlcNAc与乳腺癌的发生和发展进行了系统的研究，并探讨了O-GlcNAc调节小鼠乳腺癌肺转移的分子机制。首先，利用慢病毒shRNA表达载体构建了小鼠OGT基因沉默载体，并对小鼠乳腺癌细胞4T1中的OGT表达进行稳定、高效的沉默，从而建立了O-GlcNAc修饰抑制的乳腺癌细胞模型；其次，利用糖苷酶OGN的特异性抑制剂O-(2-acetamido-2-deoxy-d-glucopyranosylidene)amino-N-phenylcarbamate(PUGNAe)处理4T1细胞，从而使细胞中总体O-GlcNAc修饰水平升高。MTT法和细胞计数实验表明，O-GlcNAc不能影响4T1细胞的体外增殖能力；软琼脂克隆形成实验表明，O-GlcNAc对4T1细胞的锚定非依赖性生长能力也没有显著影响；Transwell小室法检测O-GlcNAc对4T1细胞迁移能力的影响，结果表明，OGT的沉默能显著抑制细胞的迁移能力而PUGNAc处理能显著促进细胞的迁移能力。在体外实验的基础上，利用小鼠乳腺癌模型检测了OGT沉默对4T1细胞肿瘤形成能力和转移能力的影响，结果表明，OGT沉默不能影响肿瘤的形成但能显著抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。上述实验结果表明，O-GlcNAc在乳腺癌肺转移过程中发挥重要作用，因此，我们对其作用机制进行了进一步的研究。WB和激光共聚焦实验表明，OGT沉默可以促进E-cadherin的表达和膜分布而PUGNAc处理能抑制E-cadherin的表达和膜分布。免疫沉淀和激光共聚焦实验表明，O-GlcNAc可以抑制E-cadherin和β-catenin、p120的相互作用，这可能是O-GlcNAc抑制E-cadherin的表达和膜分布的分子机制。由于E-eadherin在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，所以我们推测O-GlcNAe很可能通过调节E-cadherin的表达和膜分布影响乳腺癌细胞的迁移和转移。利用RNAi技术构建了E-cadherin基因沉默细胞模型和OGT/E-cadherin双基因沉默细胞模型。细胞迁移实验表明，E-cadherin的表达水平与乳腺癌细胞的迁移能力负相关,PUGNAc处理能显著促进对照细胞的迁移而对E-cadherin基因沉默细胞的迁移没有显著影响；E-cadherin的沉默可以回复OGT基因沉默对4T1细胞的迁移抑制作用。这些结果表明，O-GlcNAc可以通过E-cadherin调节乳腺癌细胞的迁移。 ERK1/2信号在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，实验中我们发现O-GlcNAc可以促进乳腺癌细胞的ERK1/2活性。进一步的实验显示，MAPK通路抑制剂PD98059可以抑制ERK1/2活性和乳腺癌细胞的迁移，这表明O-GlcNAc可能会通过调节ERK1/2活性影响乳腺癌细胞的迁移。综上所述，本文利用分子生物学和细胞生物学的方法，首次证明了O-GlcNAc在小鼠乳腺癌肺转移过程中的作用，并阐明了促进乳腺癌细胞迁移的分子生物学机制。本文的研究不仅对于阐明乳腺癌转移及其分子机制具有重要的理论意义，而且为乳腺癌的诊断及治疗提供了新的靶点和研究思路。收起

关键词 : O-GlcNAc修饰乳腺癌转移过程

4. 蛋白翻译起始核心复合物的O-GlcNAc糖基化修饰调控蛋白合成机制

[学位论文] 朱强浙江大学 2020年博士导师: 易文共126页

摘要 : 蛋白合成在细胞的生长、繁殖和生存过程中起着至关重要的作用。细胞内的蛋白合成过程受到严格的调控。蛋白翻译失调被认为是肿瘤的特征之一。蛋白翻译起始是整个蛋白合成的限速步骤，而eIF4F复合物参与的43S复合物的装配是蛋白翻译起始的限速步骤，所... 展开蛋白合成在细胞的生长、繁殖和生存过程中起着至关重要的作用。细胞内的蛋白合成过程受到严格的调控。蛋白翻译失调被认为是肿瘤的特征之一。蛋白翻译起始是整个蛋白合成的限速步骤，而eIF4F复合物参与的43S复合物的装配是蛋白翻译起始的限速步骤，所以eIF4F复合物的调控对于整个蛋白翻译的效率的调节起着重要的作用，因此eIF4F复合物通常被作为肿瘤治疗的药物靶点。eIF4F复合物主要由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成，其中eIF4E的调控机制及药物靶点研究较为成熟，而eIF4A和eIF4G的调控机制有待进一步被阐明。 O-GlcNAc糖基化修饰是通过β-D-N-乙酰葡糖胺共价连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸羟基上的一种细胞内蛋白翻译后修饰。目前已发现鉴定1000多种具有O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白，越来越多的证据表明，O-GlcNAc糖基化修饰调节各种重要的生物学过程，包括转录、干细胞分化、信号转导、细胞周期进程和代谢重编程等。O-GlcNAc糖基化紊乱能够导致II型糖尿病、神经退化性疾病、阿尔兹海默氏病、肿瘤等多种重大疾病的发生。过去几年的研究表明O-GlcNAc糖基化修饰能够直接或间接调控不同类型肿瘤的几大特征，因此O-GlcNAc糖基化修饰可作为肿瘤治疗的靶点。我们的研究发现O-GlcNAc糖基化修饰通过直接修饰蛋白翻译核心起始因子eIF4AI和eIF4GI来调控蛋白翻译起始。具体的调控机制是eIF4AI丝氨酸322和323位上位点特异的糖基化修饰通过抑制其与eIF4GI的相互作用从而干扰了翻译起始复合物的形成。另外，糖基化修饰抑制了eIF4AI的解螺旋酶活性，最终导致卵巢癌细胞的蛋白合成受阻，细胞增殖和移植瘤形成能力下降。相反地，eIF4GI的丝氨酸61位位点特异的糖基化修饰促进了eIF4GI与Poly(A)结合蛋白PABP和Poly(A)mRNA的相互作用。去除eIF4GI的糖基化修饰抑制了乳腺癌细胞的蛋白合成、细胞增殖和软琼脂单克隆的形成，同时也抑制了小鼠体内的移植瘤形成能力。此外，我们在临床肿瘤组织中也发现了肿瘤特异上调eIF4GI的糖基化水平，下调eIF4AI的糖基化水平，这也赋予了我们的结果临床意义。最后，我们发现这种差异性糖基化调控方式在细胞周期进程中得到体现。蛋白合成复合物很好地调控了eIF4AI和eIF4GI糖基化修饰功能上的差异性，从而精确地调节细胞内的蛋白合成，促进了细胞周期的顺利进行，这也赋予了我们的结果重要的生物学意义。我们的研究扩展了目前对蛋白质合成的理解，并揭示了细胞蛋白质翻译调控的另一个复杂性维度，尤其在癌细胞蛋白质合成中尤其突出。因此我们期望能为肿瘤的靶向治疗提供新的药物靶点。收起

关键词 : 蛋白翻译 O-GlcNAc糖基化修饰调控机制

5. 基于ELISA的OGT体外活性检测体系的建立

[学位论文] 齐洁琼中国海洋大学 2016年硕士导师: 顾玉超共89页

摘要 : O-连接的N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAc修饰）是一种动态、可逆的翻译后修饰，它广泛存在于细胞核、细胞质蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上，通过影响蛋白质的稳定性、细胞定位、催化活性及蛋白质间的相互作用，来调控多种细胞过程。包括磷酸激酶、磷酸酶、... 展开 O-连接的N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAc修饰）是一种动态、可逆的翻译后修饰，它广泛存在于细胞核、细胞质蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上，通过影响蛋白质的稳定性、细胞定位、催化活性及蛋白质间的相互作用，来调控多种细胞过程。包括磷酸激酶、磷酸酶、转录因子、组蛋白等在内的许多重要的蛋白质都存在O-GlcNAc修饰，这一修饰的异常与糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。 O-GlcNAc循环由两种酶催化，O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）负责将糖基供体底物UDP-GlcNAc选择性的添加到蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基上，而糖苷酶（OGA）则负责去除这一修饰。由于在生理病理过程中的重要作用，O-GlcNAc修饰受到越来越多的重视，因此，获得特异性OGT抑制剂不仅可以作为基础研究的有力工具，也具有成为新型药物的巨大潜力。然而，到目前为止，尚未建立一种快速、高通量、低成本检测OGT活性的方法，阻碍了OGT抑制剂筛选工作的进行。在本文中，我们将蛋白质体外O-GlcNAc修饰与ELISA这种高通量检测技术相结合，建立了一种新的OGT活性检测方法，可以用于OGT抑制剂的高通量筛选。首先，使用表达载体pGEX-2T-OGT在E.coliBL21(DE3)菌株中诱导表达重组GST-OGT蛋白，对其表达条件进行优化，并使用Glutathione琼脂糖凝胶柱对重组GST-OGT蛋白进行亲和纯化。结果显示，在诱导剂IPTG浓度为0.1mM、诱导温度为25℃、诱导时间为18h的条件下，重组菌株可以高效表达可溶性的GST-OGT蛋白，进一步亲合层析纯化，得到了高纯度的重组OGT蛋白。然后，使用表达载体pET30a-CKII在E.coliBL21(DE3)菌株中诱导表达OGT的底物蛋白CKII，并使用Ni+琼脂糖凝胶柱对其进行亲和纯化。结果显示，重组菌株可以高效表达CKII蛋白，通过亲合层析纯化，得到了高纯度的重组CKII蛋白。最后，我们选择CKII作为本研究中OGT的底物蛋白，将其包被在ELISA板上，重组OGT将糖基供体底物UDP-GlcNAc添加到靶蛋白CKII上，即完成体外O-GlcNAc修饰，然后用O-GlcNAc特异性抗体识别CKII上的O-GlcNAc，再通过偶联有HRP的二抗与O-GlcNAc抗体特异性结合，最后进行TMB显色反应，显色结果可以反映出OGT的活性。我们优化了这一体系中的各条件：O-GlcNAc特异性抗体、CKII的蛋白量、OGT的浓度和UDP-GlcNAc的浓度，并且使用OGT的抑制剂ST045849对该系统进行了验证。最终确定该反应体系的主要条件为：RL2作为该体系中的O-GlcNAc特异性抗体，CKII的蛋白量为0.1μg，OGT的浓度为5μg/ml，UDP-GlcNAc的浓度为0.05mM。并且发现，使用该体系测定OGT抑制剂ST045849的IC50值为14μM，与文献中给出的该化合物的IC50值基本一致，证明该OGT体外活性检测体系的有效性。综上所述，我们将蛋白质的体外O-GlcNAc修饰和ELISA检测技术有机结合，建立了一种新的OGT活性检测方法，并证明该方法可以用于OGT抑制剂的简便、快速、高通量、低成本筛选，为后续OGT抑制剂的筛选工作奠定了基础。收起

关键词 : 糖基转移酶活性检测 O-GlcNAc修饰 ELISA技术

6. 胰岛β细胞OGA特异性敲除对糖代谢的影响

[学位论文] 潘亚楠西北大学 2020年硕士导师: 聂勇战共80页

摘要 : 背景和目的：糖尿病是一种复杂的代谢失调疾病，但临床上关于糖尿病的总体疗效仍不理想，糖尿病致残率和致死率依然很高，因而寻找有效的药物意义深远，中药含有多种有效成分可以高效保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢和信号通路，降低血糖，改善胰岛素抵... 展开背景和目的：糖尿病是一种复杂的代谢失调疾病，但临床上关于糖尿病的总体疗效仍不理想，糖尿病致残率和致死率依然很高，因而寻找有效的药物意义深远，中药含有多种有效成分可以高效保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢和信号通路，降低血糖，改善胰岛素抵抗，对糖尿病及其并发症有显著的疗效。新近研究发现O-GlcNAc糖基化修饰异常与糖脂代谢紊乱密切相关。本课题构建了胰岛β细胞O-GlcNAcase(OGA)特异性敲除小鼠模型，分别在常规饲养条件下和高糖饮水条件下观察小鼠胰岛β细胞OGA敲除(Knockout, KO)小鼠对糖代谢的影响，为深入研究中药的降糖作用和开发降糖新药提供合适的动物模型，对以后评价中药以及中药单体对于糖尿病的疗效作出更加准确的研究基础。方法： 1.运用Cre-LoxP重组酶系统构建胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠模型，并运用琼脂糖凝胶电泳和免疫组织化学染色法验证基因敲除效果。 2.分别在常规饮食条件下和高糖饮水条件下，通过空腹血糖和体重监测，以及腹腔注射葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)、腹腔注射胰岛素耐量实验(Intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT)观察胰岛β细胞OGA缺失对葡萄糖代谢稳态及胰岛素敏感性的影响。 3.通过血清多因子检测试剂盒检测胰岛素、胰高血糖素等多项代谢相关内分泌调节激素水平。 4.代谢笼监测小鼠代谢特征改变，包括呼吸交换率、活动量、进食量、饮水量等指标。 5.通过16SrDNA测序观察小鼠肠道微生态的改变。结果： 1.琼脂糖凝胶电泳和免疫组化结果显示，与野生(Wild type, WT)对照小鼠相比，KO组小鼠胰岛β细胞OGA基因敲除，OGA蛋白表达水平显著降低，O-GlcNAc糖基化表达水平升高；TUNEL染色发现KO组胰岛内凋亡细胞比例增加。 2.常规饲养小鼠血糖及体重监测显示，年轻小鼠KO组血糖与WT组差异不明显，老龄时KO组血糖则显著高于WT组血糖(P＜0.05)；年轻小鼠KO组与WT组相比体重偏低，并于老龄时体重显著大于WT组(P＜0.05)；KO组糖耐量曲线下面积显著大于WT组(P=0.012)，IPGTT显示KO组糖耐量受损，但IPITT两组间差异不显著；小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测，KO组胰岛素均值为1899.8ng/mL，WT组胰岛素均值为4274.0ng/mL，KO组较WT组显著减低(P=0.017)；KO组瘦素均值为1014.7ng/mL，WT组小鼠瘦素均值为375.5ng/mL，KO组瘦素较WT组显著升高(P=0.045)，而两组间胰高血糖素、抵抗素等其他6项代谢相关内分泌调节激素未见显著性差异(P＞0.05)；进一步代谢笼监测结果显示，KO组小鼠消耗量、二氧化碳生成量、产热、进食量和饮水量较WT组均显著增加(P＜0.05)。 3.高糖饮水小鼠血糖和体重变化趋势与常规饲养小鼠趋势相一致，KO组血糖和体重上升更加迅速；高糖饮水24周后，KO组胰岛素耐量曲线下面积显著大于WT组(P=0.005)，IPITT实验结果显示，KO组胰岛素敏感性显著降低；高糖饮水小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测发现，高糖饮水4周后，KO组胰岛素均值为3158.5ng/mL，WT组胰岛素均值为6956.5ng/mL，KO组胰岛素较WT组显著减低(P=0.040)，KO组瘦素均值为1119.0ng/mL，WT组瘦素均值为534.9ng/mL，KO组小鼠瘦素较WT组显著升高(P=0.018)，此外，KO组小鼠血清胰高血糖素较WT组小鼠显著减低(P=0.0148)，抵抗素较WT组小鼠显著升高(P=0.041)。对高糖饮水4周小鼠进行代谢笼监测发现，KO组小鼠摄食、饮水量较WT组均显著增加(P＜0.05)。 4.16SrDNA测序结果WT组小鼠比KO组小鼠菌群分布较均匀，与常规饲养小鼠相比高糖饮水后小鼠菌群群落变得更加复杂。同时在分类分析情况中门水平上KO组小鼠Bacteroidetes/Firmicutes(F/B)高，Bacteroidetes减少，Firmicutes增多。结论： 1.胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠O-GlcNAc糖基化水平升高，胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌减低，糖耐量异常。 2.高糖饮水诱导条件下，胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠糖代谢紊乱更加显著。 3.高糖饮水后胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠加重了糖代谢紊乱从而使菌群群落变得更加复杂，出现某些与代谢紊乱相关菌群表达丰度改变，提示小鼠肠道菌群失调可能与胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠糖代谢紊乱密切相关。收起

关键词 : O-GlcNAc糖基化修饰糖尿病胰岛&beta 细胞

7. O-GlcNAc修饰对子宫内膜癌细胞干性样潜能和恶性行为影响的研究

[学位论文] 李真大连医科大学 2021年硕士导师: 孔英共55页

摘要 : 一、目的子宫内膜癌是指起源于子宫上皮的一组恶性肿瘤，在我国发病率和死亡率呈逐年增高趋势。在北美和欧洲其发生率仅次于乳腺癌、肺癌和结直肠癌，高居女性生殖系统癌症的首位。近几年发病年龄越来越年轻化，与人们的生活方式改变导致肥胖、... 展开一、目的子宫内膜癌是指起源于子宫上皮的一组恶性肿瘤，在我国发病率和死亡率呈逐年增高趋势。在北美和欧洲其发生率仅次于乳腺癌、肺癌和结直肠癌，高居女性生殖系统癌症的首位。近几年发病年龄越来越年轻化，与人们的生活方式改变导致肥胖、糖尿病等疾病相关。临床上主要治疗方法是手术辅以放疗、化疗，尽管治疗方法取得了进展，但晚期、复发性或转移性子宫内膜癌的预后很差，5年生存率较低。 O-连接的β-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修饰是一种普遍发生在蛋白质丝氨酸、苏氨酸羟基末端连接乙酰氨基葡萄糖上的翻译后修饰。O-GlcNAc的合成通过己糖胺生物合成途径（HBP）进行，利用葡萄糖、乙酰辅酶A、谷氨酰胺产生UDP-GlcNAc，作为O-GlcNAc合成的供体，在O-GlcNAc糖基转移酶OGT和O-GlcNAc水解酶OGA催化下与蛋白质丝氨酸、苏氨酸羟基末端连接和移除，共同参与O-GlcNAc合成的动态调节。O-GlcNAc修饰调节多种细胞过程，例如营养感应、转录、翻译、信号转导和蛋白质降解等。侵袭是肿瘤转移的重要初始步骤，转移是肿瘤导致死亡的主要原因，耐药与复发与肿瘤细胞干性相关，SOX2和OCT4作为干细胞多能性标记的转录因子，负责调控肿瘤的干性和分化，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。本研究旨在探究O-GlcNAc修饰影响干性标志因子SOX2和OCT4对子宫内膜癌细胞干性及恶性生物学行为的影响机制，为寻求治疗子宫内膜癌的新方法奠定基础。二、方法 1.免疫组化方法检测人子宫内膜癌组织及癌旁组织O-GlcNAc修饰水平的差异；2．不同葡萄糖浓度（5.5mM、15mM、25mM）培养基培养子宫内膜癌细胞Ishikawa和RL95-2细胞48h，WesternBlot实验检测不同葡萄糖浓度对O-GlcNAc修饰水平及干性标志因子OCT4和SOX2表达的影响，CCK-8实验、Transwell小室实验检测不同葡萄糖浓度对细胞增殖、迁移能力的影响； 3．通过转染OGA-siRNA和OGT-siRNA调控子宫内膜癌细胞Ishikawa和RL95-2的O-GlcNAc修饰水平，qPCR和WesternBlot实验验证转染效率； 4．CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell小室实验分别检测调控子宫内膜癌细胞O-GlcNAc修饰对细胞增殖、自我更新、迁移和侵袭能力的影响，WesternBlot检测O-GlcNAc修饰对子宫内膜癌细胞干性标志因子OCT4和SOX2蛋白表达的影响； 5．细胞免疫荧光实验检测O-GlcNAc修饰对OCT4和SOX2表达及定位的影响； 6．环己酰亚胺追踪实验检测O-GlcNAc修饰对OCT4和SOX2稳定性的影响； 7．裸鼠皮下成瘤实验检测O-GlcNAc修饰对小鼠体内成瘤能力的影响，qPCR和WesternBlot实验检测瘤体OCT4和SOX2表达水平。三、结果 1．免疫组化结果显示，人子宫内膜癌组织O-GlcNAc修饰水平高于癌旁组织； 2．高浓度葡萄糖处理促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移能力；并且促进O-GlcNAc以及干性因子OCT4和SOX2的表达； 3．O-GlcNAc修饰水平增加，促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭以及自我更新等恶性行为； 4．子宫内膜癌细胞中O-GlcNAc修饰水平增加，促进干性因子OCT4和SOX2的表达； 5．子宫内膜癌细胞中O-GlcNAc修饰水平增加，促进OCT4和SOX2核内转移； 6．O-GlcNAc修饰抑制干性因子OCT4和SOX2的蛋白酶体途径降解，增加其稳定性； 7．异种移植实验显示，抑制OGT降低了体内成瘤能力以及瘤体中OCT4和SOX2的表达。四、结论 1．O-GlcNAc修饰水平在人子宫内膜癌组织中升高； 2．O-GlcNAc修饰促进人子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭以及自我更新； 3．O-GlcNAc修饰促进干性因子OCT4和SOX2入核，通过增加其稳定性影响OCT4和SOX2的表达； 4．抑制O-GlcNAc修饰在体内抑制肿瘤生成和瘤体OCT4和SOX2的表达。收起

关键词 : 子宫内膜癌 O-GlcNAc修饰干性潜能

8. SIRT1蛋白的O-GlcNAc修饰在应激下的细胞保护作用及调控机制研究

[学位论文] 单慧中国海洋大学 2018年博士导师: 于文功共150页

摘要 : SIRT1是依赖于NAD+的蛋白脱乙酰化酶。SIRT1可以对组蛋白和p53、叉头（Fox）转录因子、Ku70、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）、PPARγ共激活因子-1α（PGC-1α）、核因子κB（NF-κB）、真核翻译起始因子2α（EIF2α）、热休克因子1（HSF1）等... 展开 SIRT1是依赖于NAD+的蛋白脱乙酰化酶。SIRT1可以对组蛋白和p53、叉头（Fox）转录因子、Ku70、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）、PPARγ共激活因子-1α（PGC-1α）、核因子κB（NF-κB）、真核翻译起始因子2α（EIF2α）、热休克因子1（HSF1）等非组蛋白进行脱乙酰化，从而参与代谢、DNA修复、基因组稳定性、细胞周期、细胞生存和凋亡、细胞衰老和肿瘤形成等过程。为了对抗来自环境和体内产生的各种压力，机体会激活相应基因来调控细胞的生存和凋亡。SIRT1作为一个重要的压力感受器，它的激活和表达水平会受到多种压力的调控，如基因毒、氧化、代谢和蛋白毒刺激等。尽管目前已经发现NAD+/NADH的比值、蛋白与蛋白之间的相互作用以及一些翻译后修饰可以参与SIRT1活性的调控，但是应激条件下SIRT1脱乙酰化酶活性的调节机制还不十分清楚。 O连接的N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAc）是一种发生在细胞核和细胞质蛋白丝氨酸和苏氨酸残基上动态可逆的翻译后修饰。它由糖基转移酶（OGT）添加，并且由糖苷酶（OGA）去除。目前已发现数千种蛋白被O-GlcNAc修饰，这些蛋白几乎参与了所有的生理和病理过程。与SIRT1相似，O-GlcNAc修饰也是一种压力感受器。在多种压力刺激时，细胞中总的O-GlcNAc修饰水平会增加，并通过调控多种生物途径对细胞起到保护作用，包括磷酸肌醇3激酶/Akt途径、热休克因子蛋白表达、钙离子稳态、蛋白质稳定性等。由上述可知，SIRT1和O-GlcNAc修饰在应激保护中发挥相似的功能，这启示我们O-GlcNAc修饰很可能参与SIRT1蛋白的调控。我们课题组前期研究发现，O-GlcNAc糖基转移酶OGT与SIRT1的C末端具有直接的相互作用，进一步检测发现SIRT1蛋白被O-GlcNAc修饰，LC-MS/MS鉴定出SIRT1蛋白的主要O-GlcNAc修饰位点为549位的丝氨酸（S549）。在本论文中，我们研究了O-GlcNAc修饰对SIRT1的调控作用，揭示了SIRT1的O-GlcNAc修饰在细胞应激条件下的变化、调控机制和发挥的生理功能。首先，我们从SIRT1蛋白的表达、定位和脱乙酰化活性方面，探究了O-GlcNAc修饰对SIRT1的调控作用。研究发现，SIRT1的O-GlcNAc修饰不影响SIRT1的表达和定位。利用我们构建的OGT与靶蛋白双质粒大肠杆菌高效共表达系统，将OGT与SIRT1（包括野生型SIRT1与S549位点突变为丙氨酸的突变型SIRT1）在大肠杆菌中共表达从而获得具有高O-GlcNAc修饰的SIRT1；通过体外SIRT1脱乙酰化活性检测，我们发现S549位点的O-GlcNAc修饰促进SIRT1的脱乙酰化活性。在细胞水平，通过检测SIRT1的底物蛋白p53的乙酰化水平，我们也得到相同的结果。既然O-GlcNAc修饰可以调节压力感受器SIRT1的脱乙酰化活性，那么，在压力刺激时SIRT1的O-GlcNAc修饰是否会发生变化呢？我们发现，无论是细胞水平还是动物水平，在基因毒、氧化和代谢刺激下SIRT1的O-GlcNAc修饰都会瞬时显著的增加，并且SIRT1的活性也显著升高。接着，我们探究了代谢刺激下SIRT1蛋白O-GlcNAc修饰增加的机制。使用AMPK激活剂和抑制剂刺激细胞发现，SIRT1蛋白O-GlcNAc修饰的升高依赖于AMPK的激活。另外，我们发现AMPK的激活增加了OGT与SIRT1的相互作用，从而导致SIRT1的O-GlcNAc修饰升高。最后，我们探究了SIRT1的O-GlcNAc修饰在应激条件下的生物学功能和机制。研究发现，压力刺激使细胞中SIRT1的O-GlcNAc修饰升高，并降低凋亡蛋白cleavedCaspase3和cleavedPARP的表达及Caspase3/7的活性，减少细胞凋亡，对细胞起到保护作用。进一步实验发现，SIRT1的O-GlcNAc修饰可以降低p53和FOXO3的乙酰化水平，这很可能是其发挥细胞保护作用的分子机制。综上所述，本论文探究了O-GlcNAc修饰对SIRT1的调控作用，并且发现在细胞应激时SIRT1的O-GlcNAc修饰水平显著升高，探究了O-GlcNAc修饰升高的机制和对细胞的保护作用。这种应激条件下SIRT1激活的新机制，为衰老和老年性相关疾病的预防和治疗提供了新的理论基础。收起

关键词 : SIRT1蛋白 O-GlcNAc修饰压力应激细胞保护分子调控

9. PGK1的O-GlcNAc修饰通过调控葡萄糖代谢促进肿瘤生长

[学位论文] 聂颢浙江大学 2019年博士导师: 易文共102页

摘要 : 当前，癌症依旧严重威胁着人类健康。据2015年世界卫生组织对全球172个国家人口死因的数据统计，癌症是其中91个国家人口过早死亡(70岁前)的首要或次要原因，是另外22个国家人口过早死亡的第三或第四原因。2018年，结肠癌成为全球发病率排行第四，致死... 展开当前，癌症依旧严重威胁着人类健康。据2015年世界卫生组织对全球172个国家人口死因的数据统计，癌症是其中91个国家人口过早死亡(70岁前)的首要或次要原因，是另外22个国家人口过早死亡的第三或第四原因。2018年，结肠癌成为全球发病率排行第四，致死率排行第五的癌症。许多肿瘤细胞，即使是在氧气充足的条件下，也会优先通过糖酵解途径，而不是经线粒体三羧酸(Tricarboxylic acid，TCA)循环代谢葡萄糖，这一现象被称为瓦尔堡效应(Warburg effect)，是由德国诺贝尔医学奖获得者瓦尔堡于上世纪30年代提出。瓦尔堡效应对肿瘤的生长和发展至关重要，当前，研究者普遍认为肿瘤细胞为满足自身的生长和增殖需求，通过代谢重编程增强胞内糖酵解并抑制TCA循环，从而大量快速地消耗葡萄糖。然而，肿瘤细胞在快速增殖过程中协调糖酵解和TCA循环的具体机制仍不得而知。磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase，PGK)，是细胞糖酵解途径中的重要代谢酶，它能可逆地催化1,3-二磷酸甘油酸1位上的高能磷酸键转移到ADP上，生成ATP和3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate，3-PG)，这也是糖酵解途径中第一个有ATP产生的步骤。根据瓦尔堡效应判断，PGK对肿瘤细胞的代谢至关重要。PGK有两种亚型，PGK1和PGK2。PGK1广泛存在于绝大多数的细胞中，并且PGK1的表达水平在多种肿瘤细胞中均出现上调，而PGK2仅存在于减数分裂和减数分裂后的精原细胞。 O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAC)修饰是一种蛋白翻译后修饰，发生于蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上，O-GlcNAc修饰与其它糖基化修饰不同，它能根据不同的环境刺激在细胞的任何位置发生或移除。当前已有超过3000种存在O-GlcNAc修饰的蛋白被鉴定出来，而O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA)是分别介导O-GlcNAc糖链添加或移除的两种酶。被O-GlcNAc修饰的蛋白包括转录因子，细胞信号传导蛋白，代谢酶等，因此O-GlcNAc修饰参与许多重要的生物进程，如转录，代谢，信号传导，自噬等。另外，大多数肿瘤细胞中O-GlcNAc水平较正常细胞普遍偏高，O-GlcNAc修饰能从多层面支持肿瘤细胞的生存与增殖，因此高水平的O-GlcNAc也被作为肿瘤细胞的一个重要的生物学标志。本文中我们发现，PGK1第255位置上的苏氨酸(Threonine 255，T255)能被O-GlcNAc动态修饰，且这种糖基化修饰能增强其作为代谢酶的活性，从而增强糖酵解途径，增加乳酸产量，同时T255O-GlcNAc修饰能诱导PGK1发生从胞质到线粒体的易位。在线粒体中，PGK1发挥激酶作用，它能磷酸化并激活丙酮酸脱氢酶激酶1(Pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDHK1)，活化的PDHK1进一步磷酸化并抑制下游丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase，PDH)复合物，导致线粒体中丙酮酸的代谢受到阻遏，并抑制整个TCA循环。阻断PGK1上T255O-GlcNAc修饰会导致瓦尔堡效应受到抑制，从而在体外实验和裸鼠模型中抑制结肠癌细胞的增殖。此外，我们还在收集到的结肠癌病人肿瘤样本中发现，癌变组织中PGK1的糖基化水平较周边正常组织显著升高。因此我们得出结论，PGK1的O-GlcNAc修饰能增强糖酵解并抑制TCA循环，从而增强瓦尔堡效应，促进肿瘤细胞的增殖。肿瘤细胞的代谢与正常细胞存在差异，在近年的临床和临床前研究中，将这些差异作为靶点已成为肿瘤治疗策略研究的热点。而本文的实验结果为将代谢酶PGK1和O-GlcNAc作为抗肿瘤潜在靶点提供了新的思路和理论基础；同时也是本实验室对代谢酶O-GlcNAc修饰调控肿瘤生长研究中的重要一环。收起

关键词 : 肿瘤生长 O-GlcNAc修饰瓦尔堡效应糖酵解 TCA循环

10. BMAL1的O-GlcNAc修饰在昼夜节律中的作用研究

[学位论文] 麻砚涛中南大学 2014年硕士导师: 李家大共90页

摘要 : 目的: 生物体的睡眠/觉醒、进食等行为以及各种生理、生化、代谢过程遵循着大约24小时的周期性变化，称为昼夜节律(circadian rhythms)，其广泛存在于光敏感的生物中。从调节低等生物，如蓝藻的光合作用，到影响哺乳动物的进食行为，昼夜节律与能... 展开目的: 生物体的睡眠/觉醒、进食等行为以及各种生理、生化、代谢过程遵循着大约24小时的周期性变化，称为昼夜节律(circadian rhythms)，其广泛存在于光敏感的生物中。从调节低等生物，如蓝藻的光合作用，到影响哺乳动物的进食行为，昼夜节律与能量代谢之间存在着紧密的联系。机体能量代谢如何调节昼夜节律系统的分子机制至今并不明确，我们的研究旨在探讨蛋白质氧连β-N-乙酰葡糖胺修饰(O-linked β-N-acetlgluosamine，O-GlcNAcylation)是否在调节机体昼夜节律系统中发挥作用，从而为阐明能量代谢如何调节昼夜节律提供新的线索。方法: 哺乳动物昼夜节律系统的分子模型是以转录因子CLOCK、BMAL1所组成的异源二聚体为核心的转录、翻译反馈环路。利用实时昼夜节律性光度分析技术，我们在体外NIH3T3细胞中检测蛋白质O-GlcNAc修饰抑制剂DON对于细胞内节律基因表达的影响。琥珀酰麦胚凝集素(sWGA)可以特异性富集被O-GlcNAc修饰的蛋白，在sWGA富集NIH3T3内源性蛋白时，我们利用不同节律蛋白抗体检测哪些节律蛋白可以被富集。同时，利用特异性识别糖基化蛋白的抗体CTD110.6检测免疫沉淀得到的节律蛋白是否能够被O-GlcNAc修饰。利用免疫共沉淀和GST pull down技术检测节律蛋白与催化蛋白质糖基化的酶OGT之间是否存在相互作用。利用放线菌酮抑制细胞内新蛋白合成，检测细胞内节律蛋白在O-GlcNAc修饰被抑制时，稳定性是否改变。利用荧光素酶报告系统检测O-GlcNAc修饰减弱时，CLOCK/BMAL1异源二聚体转录活性是否改变;实时荧光定量PCR检测此时其下游节律基因的表达。结果: 1.DON处理细胞后，实时昼夜节律性光度测定发现节律基因的表达明显降低，细胞节律衰减加快; 2.sWGA特异性富集到核心节律蛋白BMAL1;免疫沉淀得到的BMAL1蛋白节律性地被O-GlcNAc修饰，其修饰程度随着OGA过表达降低，OGT过表达增高; 3.免疫共沉淀及GST pull down实验检测到BMAL1与OGT之间存在相互作用; 4.DON处理细胞或过表达OGA时，BMAL1蛋白稳定性降低; 5.DON处理细胞或过表达OGA时，CLOCK/BMAL1蛋白转录活性降低，下游基因表达减弱。结论: 1.核心节律蛋白BMAL1可以被O-GlcNAc修饰并具有节律性; 2.O-GlcNAc修饰增强了BMAL1蛋白稳定性; 3.O-GlcNAc修饰减弱时，CLOCK/BMAL1蛋白转录活性降低，下游基因表达减弱。我们的研究发现，BMAL1蛋白的O-GlcNAc修饰可能是一种新的机体能量代谢调节昼夜节律的重要方式，为阐明能量代谢与昼夜节律之间的复杂关系提供了新的线索。收起

关键词 : 昼夜节律 O-GlcNAc修饰能量代谢 BMAL1转录因子