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[学位论文] 彭超南昌大学 2021年博士导师: 吕农华共256页

摘要 : 背景与目的：胃癌是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其发生是多因素多步骤过程，受到遗传因素、环境因素和幽门螺杆菌（Hp）感染的影响。Hp是常见的胃内致病菌，感染了全球50%以上的人口，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴... 展开背景与目的：胃癌是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其发生是多因素多步骤过程，受到遗传因素、环境因素和幽门螺杆菌（Hp）感染的影响。Hp是常见的胃内致病菌，感染了全球50%以上的人口，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌的发生密切相关，几乎100%的Hp感染者有慢性活动性胃炎，然而仅1-3%的Hp感染者最终发展成了胃癌，说明存在除了Hp以外的潜在因素在胃癌发生过程中发挥重要作用。近年来，大量研究证实菌群与疾病的发生发展密切相关。胃癌发生过程中胃内菌群的紊乱也逐渐被关注，然而，目前研究主要为对胃黏膜菌群的研究，而缺乏对胃液菌群的研究。此外，胃内微环境变化（包括胃酸、菌群和代谢产物）与胃癌发生的风险之间的关联也需要进一步研究。Hp感染影响宿主胃肠道菌群结构，可能参与了Hp诱导的胃内炎症和胃癌发生。既往研究表明益生菌可以抑制炎症，调节免疫和菌群。益生菌抑制Hp感染诱导的炎症已有报道，然而益生菌对Hp感染介导的胃癌发生风险的影响尚未见文章报道。根除Hp能够显著降低胃癌发生风险，根除方案中包含的PPI和抗生素已被证实可以影响胃肠道菌群。胃肠道菌群紊乱与疾病发生关系密切，因此大规模根除Hp应该考虑对于胃肠道菌群的影响。因此，本论文的目的是基于人体水平研究胃内微环境（胃酸、胃黏膜菌群、胃液菌群、代谢产物）改变与胃癌发生风险的关联，以及根除Hp对人体胃肠道菌群的短期和长期影响；基于动物水平研究益生菌对于Hp感染小鼠胃癌发生风险的影响和可能机制，以及益生菌对于根除Hp后胃肠道菌群、肠道屏障功能及短链脂肪酸含量的调节作用。材料与方法： 1.收集胃炎、肠上皮化生（肠化）、胃癌患者的胃黏膜、胃液样本，提取样本DNA，扩增目标16SrRNAV4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析胃黏膜和胃液菌群结构变化。应用笔形pH计检测胃液pH,盐酸萘乙二胺法检测胃液亚硝酸盐含量，循环酶法检测胃液中总胆汁酸含量，气相色谱分析法检测胃液中各短链脂肪酸含量。 2.构建HpPMSS1感染的INS-GAS小鼠模型，布氏肉汤灌胃的INS-GAS小鼠作为对照组，分别给予含唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的益生菌饮水和普通饮水。处死小鼠前一天收集粪便样本，处死小鼠后，应用笔形pH计测量小鼠胃内pH，取小鼠胃组织。Steiner银染法检测小鼠胃内Hp定植，HE染色观察小鼠胃内病理改变，免疫组化染色检测胃组织炎症指标CD45表达。提取小鼠胃组织和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析小鼠胃内和肠道菌群结构变化。提取小鼠胃组织RNA，富集mRNA，将mRNA片段化后反转合成cDNA，连接adaptor后进行片段筛选和文库富集，在IlluminaHiSeqXten高通量测序平台上机测序。应用生物信息学方法分析胃组织转录水平的变化。使用RT2ProfilerPCRArray方法分析小鼠胃组织“炎症应答和自身免疫”相关基因的表达情况，并使用蛋白质印迹法检测胃组织炎症免疫相关蛋白TLR2和IL-17的表达。 3.招募无症状的年轻成年志愿者，13C尿素呼气试验检测志愿者Hp感染状态，收集志愿者粪便。对Hp阳性志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本，之后给予Hp阳性者14天铋剂四联方案（艾司奥美拉唑20mg，枸橼酸铋钾220mg，阿莫西林1000mg，呋喃唑酮100mg，均为bid）根除Hp，在根除结束后4周时复查13C尿素呼气试验，收集Hp根除志愿者粪便，对Hp根除志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本。根除结束后24周，收集Hp根除志愿者粪便，对Hp根除志愿者进行内镜检查并取胃黏膜样本。提取志愿者胃黏膜和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析志愿者胃肠菌群结构变化。 4.构建HpPMSS1感染的C57BL/6小鼠模型，布氏肉汤灌胃的C57BL/6小鼠作为对照组，分别给予Hp根除药物和生理盐水处理14天。给予根除药物处理结束的小鼠益生菌（屎肠球菌R0026和枯草芽孢杆菌R0179）处理4周。收集根除药物处理结束时和益生菌处理结束时的小鼠粪便、胃黏膜和结肠样本。应用Giemsa染色法检测小鼠胃内Hp定植情况，HE染色观察小鼠胃组织炎症和病理情况。提取小鼠胃组织和粪便DNA，扩增目标16SrRNAV3-V4可变区片段，混样，纯化、建库后完成上机准备。基于IlluminaMiSeq高通量测序平台进行双末端测序，应用生物信息学方法分析小鼠胃内和肠道菌群结构变化。应用气相色谱法检测小鼠粪便各SCFA含量，蛋白质印迹法检测小鼠结肠组织紧密连接蛋白Occuludin和Claudin1的表达。结果：（一）胃癌发生过程中的胃内菌群结构和特定代谢产物变化及其与幽门螺杆菌的关系 1.胃癌发生过程中胃黏膜菌群的变化（1）α多样性分析：胃炎患者胃黏膜菌群的Chao指数和Shannon指数与肠化患者均无显著差异（P＞0.05），胃癌患者胃黏膜菌群的Chao指数显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.01）和肠化胃黏膜组（P＜0.001），Shannon指数也显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.01）和肠化胃黏膜组（P＜0.01）。胃癌旁组织和癌组织菌群Chao指数无显著差异，而胃癌胃黏膜组的Shannon指数显著高于癌旁胃黏膜组（P＜0.05）。此外，我们还将胃癌旁和胃炎患者胃黏膜菌群α多样性进行比较，发现癌旁胃黏膜组Chao指数显著高于胃炎胃黏膜组（P＜0.05），Shannon指数无显著差异。Hp感染患者的胃黏膜菌群Chao指数（P＜0.001）和Shannon指数（P＜0.001）显著降低。胃炎组和肠化组中Hp阳性者Chao指数和Shannon指数均显著低于Hp阴性者（allP＜0.001）。然而，在胃癌患者组，Hp阳性与Hp阴性者胃黏膜菌群的Chao指数和Shannon指数均无显著差异。（2）β多样性分析：基于不同距离算法的PCoA分析，发现胃炎胃黏膜组和肠化胃黏膜组的样本不能有效区分开，而胃癌胃黏膜组和其他两组样本有明显分离的趋势（ANOSIM，Bray-curtisP=0.001，weightedUniFracP=0.001）。胃癌组织胃黏膜样本于癌旁样本呈分离的趋势（ANOSIM，Bray-curtisP=0.07，weightedUniFracP=0.02）。癌旁和胃炎患者胃黏膜菌群结构存在显著差异（ANOSIM，Bray-curtisP=0.01，weightedUniFracP=0.03）。Hp阳性组与Hp阴性的胃黏膜样本成明显分离的状态（Adonis，EuclideanP=0.001;ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）。其中胃炎组（Adonis，EuclideanP=0.001;ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）和肠化组（ANOSIM，Bray-curtisP=0.001，weightedUniFracP=0.001）里Hp阴性和阳性样本分离效果很好，而胃癌组次之（ANOSIM，Bray-curtisP=0.057，weightedUniFracP=0.002）。（3）LEFSe分析：胃炎组中Bacillus显著高于其他肠化组和胃癌组，而在胃癌阶段，Lactobacillus，Prevotella，Veillonella，Haemophilus，Fusobacterium，Neisseria等菌属相对丰度显著升高。胃癌组织中Clostridia，Prevotella_7，Prevotella，Johnsonella，Solobacterium等相对丰度显著高于癌旁组织。胃炎胃黏膜组中Bacillus相对丰度显著高于癌旁组，而癌旁胃黏膜菌群中包括Lactobacillus，Prevotella_7，Veillonella，Fusobacterium，Neisseria等相对丰度升高。Hp阳性胃黏组中仅Helicobacter相对丰度显著高于Hp阴性胃黏膜组，而Bacillus，Lactobacillus，Rothia，Streptococcus，Fusobacterium等菌属相对丰度显著降低。在胃炎、肠化和胃癌三个阶段，Hp阴性亚组中Helicobacter相对丰度均显著低于Hp阳性亚组，而Hp阴性胃炎胃黏膜组中Lactococcus，Bacillus，Pseudomonas，Streptococcus，Neisseria等菌属相对丰度显著高于Hp阳性亚组。Hp阴性肠化胃黏膜组中Lactococcus，Bacillus，Acinetobacter，Streptococcus，Ralstonia等菌属相对丰度显著高于Hp阳性肠化胃黏膜组。相比于Hp阳性胃癌胃黏膜组，Hp阴性胃癌胃黏膜组中Streptococcus，Brevibacterium，Ochrobactrum，Ralstonia，和Rothia等菌属相对丰度显著升高。 2.胃癌发生过程中胃液菌群的变化（1）α多样性分析：胃炎胃液组的Shannon指数与肠化胃液组无显著差异，肠化胃液组的Shannon指数与胃癌胃液组无显著差异，而胃癌胃液组的Shannon指数显著低于胃炎胃液组（P＜0.01）。Hp阴性和阳性的患者胃液菌群Chao指数和Shannon指数均无显著差异。Hp阳性胃炎胃液组的Chao指数和Shannon指数与Hp阴性胃炎胃液组均无显著差异；Hp阳性的肠化胃液组的Chao指数和Shannon指数与Hp阴性肠化胃液组均无显著差异，然而Simpson指数显著低于Hp阴性肠化胃液组（P＜0.05）。（2）β多样性分析：基于非加权的UniFrac距离的PCoA显示胃炎和肠化组胃液样本比较接近，而胃癌组呈分离的趋势（ANOSIM，unweightedUniFracP=0.001），而基于加权UniFrac距离的PCoA分析中三组样本非常接近，难以有效区分开（ANOSIM，weightedUniFracP=0.17）。基于非加权的UniFrac距离的PCoA中Hp阳性和Hp阴性的样本距离非常接近（ANOSIM，weightedUniFracP=0.399），而基于加权UniFrac距离的PCoA分析显示Hp阳性和阴性胃液菌群具有显著差异（ANOSIM，weightedUniFracP=0.001）。基于Euclidean距离和weightedUniFrac距离的PCoA分析发现Hp阳性和阴性的胃炎胃液组样本分布具有显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.02，weightedUniFracP=0.018）。同样，基于Euclidean距离和weightedUniFrac距离对肠化和胃癌胃液的样本进行PCoA分析，结果显示：Hp阳性和Hp阴性的肠化胃液样本的分布具有显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.001，weightedUniFracP=0.001），而Hp阳性和Hp阴性的胃癌胃液样本分布无显著差异（ANOSIM，EuclideanP=0.06，weightedUniFracP=0.17）。（3）LEFSe分析：胃炎阶段Pseudomonas，methylobacterium，Treponema_2，Pelomonas，Acidovorax等菌属相对丰度显著高于肠化和胃癌阶段，而在肠化阶段Ochrobactrum，Campylobacter，Acinetobacter，Paracoccus和Staphylococcus等菌属相对收起

关键词 : 幽门螺杆菌胃肠菌群转录组学根除治疗益生菌

2. 热休克预处理对大鼠烧伤后急性胃粘膜损伤的保护作用机制的研究

[学位论文] 张红艳江西医学院 2004年博士导师: 吕农华共183页

摘要 : 目的：烧伤后应激性溃疡是烧伤患者常见的并发症和急重症，死亡率可高达10％～20％，因此一直是烧伤外科学重点研究内容之一。热休克蛋白(heat shock protein，HSPs)是机体在对各种应激如热休克、缺血缺氧等反应时合成的一个重要的内源性保护蛋... 展开目的：烧伤后应激性溃疡是烧伤患者常见的并发症和急重症，死亡率可高达10％～20％，因此一直是烧伤外科学重点研究内容之一。热休克蛋白(heat shock protein，HSPs)是机体在对各种应激如热休克、缺血缺氧等反应时合成的一个重要的内源性保护蛋白家族。近年来研究表明HSPs在心、脑、肝、肾等重要脏器的保护或修复中起着积极而重要的作用，因此HSPs在胃粘膜损伤中可能的保护作用也引起了人们的关注。本课题研究热休克预处理是否通过花生四烯酸和蛋白质合成依赖途径及调控胃粘膜氧自由基产生等机制诱导对烧伤大鼠胃粘膜的细胞保护作用，为临床防治烧伤后应激性溃疡提供依据。方法： 1、热休克预处理(heat shock preconditioning，HS)对烧伤大鼠胃粘膜热休克蛋白表达的作用:动物随机分成3大组①非热休克预处理组（B组）②热休克预处理组(HB组)③放线菌素D预处理组(AHB组)。分别在伤前及伤后3、6、12、24、48小时进行胃粘膜损伤指数(UI)评分，运用RT-PCR，免疫组化方法检测胃粘膜HSP60、HSP70mRNA及HSP70表达，探讨HSPs对大鼠烧伤后急性胃粘膜损伤(acute gastric mucosal lesion，AGML)的保护作用。 2、替普瑞酮对严重烧伤大鼠胃粘膜HSP60及HSP70表达的作用:将48只Wistar大鼠分为药物预防、药物治疗及相应对照组，观察不同处理组UI变化。RT-PCR检测胃粘膜HSP70mRNA表达，Western blot及免疫组化法检测胃粘膜HSP60和HSP70蛋白表达，探讨替普瑞酮对烧伤大鼠胃粘膜HSP60、HSP70及其基因表达的影响。 3、热休克预处理对烧伤大鼠胃粘膜氧自由基的作用:观察HS对大鼠烧伤后胃粘膜细胞显微和超微结构变化及T-SOD、MDA、线粒体SOD、线粒体细胞色素氧化酶(CCO)活性的影响，探讨氧自由基在大鼠烧伤后AGML中的作用及HS对烧伤大鼠AGML的保护机制。 4、热休克预处理对烧伤大鼠胃粘膜iNOS、COX-2表达的作用:观察热休克预处理烧伤大鼠胃粘膜损伤指数(UI)变化，并取胃粘膜标本，检测iNOS、COX-2的表达，进行图像分析，探讨iNOS、COX-2在烧伤大鼠AGML中的可能作用及HS对iNOS、COX-2表达的影响。结果： 1、大鼠严重烧伤后其胃粘膜HSP70mRNA表达迅速升高，伤后3h达峰值，在此时相点未观察到明显的胃粘膜损害。与HSP70mRNA的产生相对应，严重烧伤大鼠胃粘膜HSP70蛋白表达亦急剧增加，随后开始下降，伤后24h降至最低，此时胃粘膜损伤程度最严重(UI=12.74±1.92)。HSP70诱导的程度与UI呈显著负相关(r=-0.794P＜0.05)，提示HSP70在烧伤引起的AGML防御机制起重要作用。 2、大鼠经热休克预处理（肛温42℃～42.5℃15min）诱导HSPs产生后对烧伤引起的AGML有保护作用。表现为在各时相点其胃粘膜损伤程度明显低于对照组(P＜0.05-0.01)。RT-PCR及免疫组化研究显示，热休克预处理大鼠胃组织中HSP70及HSP60表达的水平较单纯烧伤组明显增高(P＜0.05～0.01)，用放线菌素D阻断HSP60、HSP70基因转录后，热处理的这种保护作用消失，表明热休克预处理对严重烧伤后AGML的保护作用与HSPs表达增加密切相关。 3、大鼠烧伤前2小时预先灌服替普瑞酮200mg/kg可诱导大鼠胃粘膜HSP70过度表达，并且替普瑞酮预处理能显著减轻大鼠烧伤后胃粘膜损害（伤后24小时UI分别为12.07±1.86比2.89±0.43，P＜0.01）。与对照组比较，替普瑞酮预处理后烧伤组大鼠胃粘膜HSP70mRMA、HSP60和HSP70表达水平升高(P＜0.05-0.01)，表明替普瑞酮可能通过诱导HSPs过量表达参与大鼠烧伤后胃粘膜保护。 4、大鼠严重烧伤后胃粘膜内T-SOD及线粒体SOD大量消耗，MDA明显增加，线粒体细胞色素氧化酶(CCO)活力亦随时间延长而降低。热休克预处理能显著降低胃粘膜T-SOD及线粒体SOD的消耗，提高CCO活性，降低线粒体内单价泄露。电镜观察显示胃粘膜细胞超微结构受损程度减轻，线粒体改变不明显。相关分析结果显示，胃粘膜损伤指数(UI)与MDA呈显著正相关(r=0.695P＜0.01);T-SOD和线粒体SOD与MDA呈显著负相关（r分别为-0.823和-0.764P＜0.01），而与HSP70呈显著正相关（r分别为0.527和0.436P＜0.05）;CCO与HSP60呈显著正相关(r=0.679P＜0.05)。表明严重烧伤后大鼠胃粘膜存在氧自由基损伤。热休克预处理可显著减轻烧伤大鼠胃粘膜氧自由基损伤，并对胃粘膜细胞线粒体具有保护作用，保护机制与HSPs保护抗氧化酶及线粒体CCO等呼吸酶活性密切相关。 5、大鼠烧伤后胃粘膜iNOS，COX-2表达显著升高，UI与iNOS呈显著正相关(r=0.672P＜0.05)。热休克预处理后大鼠胃粘膜iNOS表达明显受抑(P＜0.05-0.01)，COX-2表达也有所降低(P＜0.05)。表明烧伤后胃粘膜iNOS表达增强可能参与了烧伤大鼠AGML的发病。热休克预处理可抑制iNOS表达，减轻烧伤后急性胃粘膜损害。结论: 热休克预处理对大鼠严重烧伤导致的急性胃粘膜损伤有保护作用，这与HS对胃粘膜细胞线粒体的保护，胃粘膜氧自由基损伤的减弱以及胃粘膜iNOS表达的抑制机制有关。胃粘膜保护剂替普瑞酮可通过诱导热休克蛋白过度表达而减轻大鼠严重烧伤后所致的急性胃粘膜损伤。收起

关键词 : 烧伤后应激性溃疡胃粘膜损伤热休克预处理替普瑞酮热休克蛋白细胞保护作用疗效评价

3. 幽门螺杆菌感染对代谢综合征的影响及其与肠道菌群的相关性研究

[学位论文] 何丛南昌大学 2016年博士导师: 吕农华共167页

摘要 : 目的: 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）作为体内最常见的感染性病原体之一，现已公认是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤及胃癌等上消化道疾病重要的环境致病因素。随着研究的深入，Hp感染与胃肠外疾病的关系逐渐引... 展开目的: 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）作为体内最常见的感染性病原体之一，现已公认是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤及胃癌等上消化道疾病重要的环境致病因素。随着研究的深入，Hp感染与胃肠外疾病的关系逐渐引起人们的关注，如特发性血小板减少性紫癜、特发性缺铁性贫血等已作为Hp根除适应症写入共识。既往研究认为Hp感染引起胃肠外疾病的相关机制包括诱导机体产生慢性低度炎症、通过分子模拟引发交叉免疫反应、阻碍营养物质或药物吸收等。近来不少流行病学调查资料提示Hp感染与代谢综合征(metabolic syndrome，MS)密切相关。MS是一组包括中心性肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱和高血压等多症状参与的代谢异常症候群，可明显增加糖尿病和心脑血管疾病的发生风险。随着人类饮食结构和生活方式的改变，如高脂高热量食物的摄入和静坐等生活方式的增多，MS在全球范围的患病率逐年上升，已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。新近越来越多研究发现肠道菌群的失调参与肥胖、MS等代谢性疾病的发生和发展，Hp作为重要胃内致病菌其感染可引起胃肠道微生态改变，然而，到目前为止，还未见研究报道Hp感染、肠道菌群的变化和MS的发生这三者之间的关系。因此，本论文的研究目的是通过建立Hp感染联合高脂饮食动物模型，探讨在不同的饮食结构下Hp感染与MS的关系，并进一步观察肠道菌群的变化及其可能发挥的作用，为MS的预防提供新思路，同时也为确定MS是否作为Hp根除的适应症提供理论依据。材料和方法: 1.建立两种Hp标准菌株(SS1、ATCC43504)感染C57BL/6小鼠的动物模型，同时以布氏肉汤灌胃的C57BL/6小鼠作为对照组，分别给予普通饮食和高脂饮食。 2.监测动物的生长代谢情况，每隔2周测量体重和腹围，测定24h进食/进水量，计算能量摄入和能量利用率。 3.检测不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的葡萄糖耐量(IPGTT)和胰岛素耐量(IPITT)，绘制相应曲线并计算曲线下面积(AUC)。 4.检测不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的各项血液生化指标。糖代谢指标包括应用血糖仪测定空腹血糖，ELISA法测定空腹血浆胰岛素，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);应用全自动生化分析仪检测血脂包括总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG);应用ELISA法检测代谢相关激素包括瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、胃饥饿素(Ghrelin)、胰高血糖素(Glucagon)的水平，及炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)-alpha、白介素(IL)-1β和IL-6。 5.收集不同饮食干预12周和24周后Hp感染组和对照组小鼠的新鲜粪便样品，采用QIAamp DNA分离试剂盒提取细菌基因组DNA，扩增目标16S rRNA片段，混样、纯化、建库后完成上机准备。基于Illumina Miseq高通量测序平台对V4可变区进行双末端测序，应用生物信息学方法分析肠道菌群结构的变化。 6.分别于不同饮食干预12周和24周后处死动物，分离肝脏及内脏脂肪组织，称重，计算重量指数，行Western blot检测肝脏组织胰岛素信号通路IRSl/PI3K/Akt相关蛋白的表达，以及回肠黏膜组织紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达。结果: 1.不同饮食干预12周和24周Hp感染对体重腹围的影响 (1)高脂饮食组小鼠从第4周起体重即明显高于正常对照组(p＜0.01)，Hp感染组与未感染组之间体重无明显差异(p＞0.05)。 (2)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠腹围较正常对照组明显增大(p＜0.01)，其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组小鼠的腹围较对照亚组明显增大(p＜0.05)，而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组小鼠腹围无明显差异(p＞0.05)。 (3)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠腹围明显大于正常对照组(p＜0.01)，其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组小鼠的腹围明显大于对照亚组(p＜0.05)，而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组和对照亚组无明显差异(p＞0.05)。 2.不同饮食干预12周和24周Hp感染对脂肪含量和分布的影响 (1)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠内脏脂肪含量较正常对照组明显增高(p＜0.01)，其中高脂饮食组中HpSS1感染亚组较对照亚组明显增加(p＜0.01)，以附睾脂肪组织的变化最为明显，而HpATCC43504感染亚组与对照亚组无明显差异(p＞0.05);普通饮食组Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p＞0.05)。 (2)不同饮食干预12周后高脂饮食组小鼠内脏脂肪指数明显高于正常对照组(p＜0.01)，其中高脂饮食组中Hp感染亚组的内脏脂肪指数明显高于对照亚组(p＜0.01);普通饮食组中Hp感染哑组较对照亚组无明显差异(p＞0.05)。 (3)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠附睾脂肪含量较正常对照组明显增高(p＜0.01)，其中高脂饮食组中Hp感染亚组较对照亚组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组附睾脂肪含量也无明显差异(p＞0.05)。 (4)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠附睾脂肪指数较正常对照组明显增高(p＜0.01)，其中高脂饮食组中Hp感染亚组与对照亚组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组附睾脂肪指数也无明显差异(p＞0.05)。 3.不同饮食干预12周和24周Hp感染对能量代谢的影响 (1)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠进食量低于正常对照组(p＜0.05)，高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组下降更明显(p＜0.01);普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组进食量无明显差异(p＞0.05)。 (2)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠饮水量较正常对照组无明显差异(p＞0.05)，而高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组明显下降(p＜0.01);普通饮食组中Hp感染亚组饮水量较对照亚组无明显差异。 (3)不同饮食干预12周后高脂对照组小鼠能量摄入较正常对照组明显升高(p＜0.05)，而高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组能量摄入无明显差异(p＞0.05);高脂对照组和高脂饮食合并Hp感染组能量利用率较正常对照组均明显升高(p＜0.01)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组能量利用率无明显差异(p＞0.05)。 (4)不同饮食干预24周后高脂饮食组小鼠进食量较正常对照组无明显差异(p＞0.05)，而饮水量较正常对照组明显下降(p＜0.05);高脂对照组和高脂饮食合并HpSS1感染组小鼠能量摄入较正常对照组明显升高(p＜0.05)，而仅高脂对照组能量利用率高于正常对照组(p＜0.01)，高脂饮食合并Hp感染组较正常对照组无明显差异(p＞0.05)，普通饮食组中Hp感染亚组与对照亚组均无明显差异(p＞0.05)。结论: 1.Hp感染对MS的影响与饮食结构和作用时间密切相关，高脂饮食早期Hp感染可加重饮食诱导的胰岛素抵抗，促进脂肪重分布并加速腹型肥胖的发生，普通饮食下Hp感染对MS无明显影响。 2.Hp感染对MS的影响可能与肠道菌群结构的变化有关，Hp感染和饮食对肠道菌群的调控可能影响宿主代谢平衡，进而引起MS的发生。收起

关键词 : 代谢综合征发病机制肠道菌群幽门螺杆菌病菌感染

4. 抗生素耐药及基因多态性对伴同方案根除幽门螺杆菌感染效果的影响

[学位论文] 洪军波南昌大学 2015年博士导师: 吕农华共160页

摘要 : 研究背景和目的：幽门螺杆菌（H. pylori）与胃炎、消化性溃疡、胃癌及多种胃肠道外疾病密切相关，需要进行有效根除。然而，H. pyori的根除率逐年下降，而导致根除失败的最主要原因为H. pylori对抗生素耐药及宿主基因多态性。我国的抗生... 展开研究背景和目的：幽门螺杆菌（H. pylori）与胃炎、消化性溃疡、胃癌及多种胃肠道外疾病密切相关，需要进行有效根除。然而，H. pyori的根除率逐年下降，而导致根除失败的最主要原因为H. pylori对抗生素耐药及宿主基因多态性。我国的抗生素耐药形势较为严峻，如何克服耐药导致的根除率降低是今后研究的重点。研究发现，增加抗生素种类可能通过发挥协同作用，提高根除率。伴同治疗方案包括质子泵抑制剂（PPI）+阿莫西林+克拉霉素+甲硝唑，其有效性及安全性已经得到证实。而且，最新研究发现即使在高耐药地区，14天伴同方案的根除率仍在90%以上，提示伴同方案能有效弥补抗生素耐药的缺陷，保持高的H. pylori根除率。然而，我国缺乏伴同方案相应资料，该方案的有效性及安全性？能否克服抗生素耐药？这些都是亟待解决的问题。关于宿主基因多态性对根除率的影响仍存在争议。有研究表明，在PPI治疗过程中，血浆PPI水平和胃内pH在CYP2C19快代谢（EM）组最低，中间代谢（IM）其次，慢代谢（PM）组最高，且EM患者根除率低于IM型及PM型。另外，含奥美拉唑三联标准剂量根除方案依赖CYP2C19基因状态，而埃索美拉唑受CYP2C19影响较小。然而，也有文献报道CYP2C19基因多态性并不影响根除率，且含上述两种PPI方案的根除率无差异。而且，鉴于国内人群EM型发生率低于国外人群，CYP2C19基因多态性能否影响含不同PPI伴同方案的根除率值得深入探讨。另一方面，IL-1β基因多态性主要包括IL-1β-31(T>C)和IL-1β-511(C>T)，且T型IL-1β水平显著高于C型，从而调节IL-1β表达及抑酸效果。研究发现，IL-1β-511基因多态性与根除率相关，IL-1β-511 C/C基因型H. pylori根除率显著低于IL-1β-511 C/T和T/T基因型。然而，也有文献报道IL-1β基因多态性并不影响根除率。可见，两者间的关系仍存在争议，需要进一步研究证实。此外，VacA及CagA为H. pylori最主要的毒力因子，可能通过改变H. pylori对抗生素敏感性及胃黏膜炎症影响根除效果，但这并未得到学者的一致认同，有待进一步探讨。因此，通过设计前瞻性、随机、对照研究探讨含不同PPI伴同方案的有效性、安全性及能否克服抗生素耐药。另外，探讨宿主基因多态性、H. pylori毒力因子及其它相关因素对该方案根除率的影响，为该方案在国内的推广提供循证医学证据。材料和方法： 1．提取健康人群外周血基因组 DNA，利用HRM确定各引物的最佳 Mg2+浓度。 2.建立HRM技术检测健康人群（389例）及十二指肠溃疡（DU）患者（374例）CYP2C19及IL-1β基因多态性，并用基因测序及质谱分析验证。 3．宿主基因多态性及抗生素耐药性对伴同方案根除率的影响（1）研究对象纳入符合入选标准的DU患者（RUT强阳性），行胃黏膜活检，登记人口学资料。（2）试验分组（随机分组，A、B组各187例） ①A组：埃索美拉唑镁（20mg/bid）+阿莫西林（1000mg/bid）+克拉霉素片（500mg/bid）+甲硝唑（400mg/bid），治疗10天； ② B组：奥美拉唑镁（20mg/bid）+阿莫西林（1000mg/bid）+克拉霉素片（500mg/bid）+甲硝唑（400mg/bid），治疗10天。 ③维持治疗：A组及B组分别给予耐信（20mg/qd）及洛赛克（20mg/qd），维持治疗2周，总疗程24天。（3）评价患者依从性及不良反应（4）利用幽门螺杆菌抗体分型检测试剂盒进行H. pylori分型检测（5）HRM检测CYP2C19及IL-1β基因多态性，并用质谱分析验证（6）H. pylori培养及对抗生素的耐药性鉴定 ①分离、培养H. pylori，采用E-test及K-B法检测其对抗生素的耐药性。 ②耐药判定标准： a．阿莫西林≥1μg/ml为耐药； b．克拉霉素≥1μg/ml为耐药； c．甲硝唑≥8μg/ml为耐药； d．左氧氟沙星≥1μg/ml为耐药； e．呋喃唑酮药敏试验采用K-B法，抑菌圈≤7mm为耐药。（7）治疗效果判定：停药4周后，复查13C呼气试验；采用PP分析及ITT分析评价伴同方案根除率。（8）补救治疗：对于根除失败患者，给予含埃索美拉唑镁（20mg/bid）+枸橼酸铋钾（220mg/bid）+阿莫西林（1000mg/bid）+呋喃唑酮（100mg/bid）方案，10天。停药4周后，复查13C呼气试验。结果： 1.人群中CYP2C19和IL-1β基因多态性的分布及意义（1）各引物最佳Mg2+浓度的测定 ①CYP2C19*2,*3引物的最佳Mg2+浓度均为3.0mM，CYP2C19*17引物的最佳Mg2+浓度为2.5mM。 ②IL-1β-31和-511引物的最佳Mg2+浓度均为2.5mM。（2）利用HRM技术，成功对CYP2C19*2,*3、IL-1β-31（T>C）及IL-1β-511（C>T）进行分型，与基因测序及质谱分析结果完全一致。（3）人群中CYP2C19及IL-1β基因多态性分布及差异 ①389例健康人群和374例DU患者CYP2C19基因型分布均无显著性差异：CYP2C19*1*1（43.7% vs41.2%）、*1*2（37.8% vs39.8%）、*1*3（7.2% vs6.1%）、*1*17（1.3% vs0.3%）、*2*2（8.5% vs9.6%）、*2*3（1.5% vs2.1%）、*2*17（0 vs0.3%）及*3*3（0 vs0.5%），P=0.42。相应地，健康人群及DU患者CYP2C19基因型分布均无显著性差异：EM（45.0% vs41.4%）、IM（45.0% vs46.3%）及PM（10.0% vs12.3%），P=0.471。 ②健康人群及DU患者IL-1β-31分布：CC（20.5% vs22.7%）、CT（51.7%vs53.5%）及TT（27.8% vs23.8%）；IL-1β-511分布：CC（28.3% vs24.6%）、CT（51.9% vs52.9%）及TT（19.8% vs22.5%），两组患者间均无显著性差异，P=0.429及P=0.437。 2.伴同方案对H. pylori感染的根除效果（1）患者筛选：共筛选586位DU患者，其中212位患者排除，最终纳入374位DU患者(A组及B组各187例)，A组及B组分别有7例(2例失访/5例因不良反应停药)及6例(4例失访/2例因不良反应停药)脱落，脱落率分别为3.7%及3.2%。（2）依从性：368例患者中，共有320例患者完全遵循根除方案，总体依从性为87.0%。A组与B组间依从性无显著差异，87.6% vs86.3%，P=0.726。（3）不良反应：恶心、头晕、口苦、腹泻、腹痛及四肢麻木感发生率分别为9.8%、4.9%、18.5%、7.1%、6.0%及1.4%，两组间均无显著差异，P=0.981~0.178。另外，A组和B组各有2例及5例患者因口苦、头晕及腹痛明显停用药物。此外，上述症状多为轻中度，停药后逐渐消失。（4）人口学资料：374例DU患者中，男性227例，占60.7%；女性147例，占39.3%，男、女比例1.5：1。女性患者平均年龄（42.4±11.0岁）显著大于男性患者38.7±12.1岁，P=0.003。然而，A、B两组间患者年龄无显著差异，39.2±11.9岁Vs41.1±11.7岁，P=0.114；而B组女性患者年龄显著大于男性，43.3±11.3岁vs39.5±11.7岁，P=0.025。两组患者辛辣饮食、吸烟、饮酒比例及BMI均无显著差异。（5）H. pylori培养结果：374例入选的DU患者中，H. pylori培养均成功。（6）伴同方案根除率：患者总体根除率为90.7%（PP分析）和86.1%（ITT分析）。（7）补救治疗：共有46例患者根除失败，30位患者（A组9例，B组21例）进行了含铋剂四联方案补救治疗，16例患者拒绝；A组9例患者均成功根除（100%），B组20例患者成功根除（95.2%）。 3.宿主基因多态性影响PPI代谢对伴同方案根除率的影响（1）A组患者的根除率均显著高于B组，95.4% vs86.0%，P=0.003（PP分析）；89.8% vs82.4%，P=0.036（ITT分析）。（2）CYP2C19基因多态性分布：两组患者CYP2C19*1*1（39.6% vs42.8%）、CYP2C19*1*2（40.6% vs39.0%）、CYP2C19*1*3（8.0% vs4.3%）、CYP2C19*1*17（0 vs0.5%）、CYP2C19*2*2（9.6% vs9.6%）、CYP2C19*2*3（1.1%vs3.2%）、CYP2C19*2*17（0.5% vs0）、CYP2C19*3*3（0.5% vs0.5%），均无显著性差异，P=0.471。相应的，两组患者CYP2C19EM（39.6% vs43.3%）、IM（49.2%vs43.3%）及PM（11.2% vs13.4%），无显著性差异，P=0.506。（3）CYP2C19和根除率的关系：EM型患者根除率为80.6%，显著低于IM+PM型患者（90.0%），P=0.01。（4）A组中，EM型根除率与IM＋PM型无显著差异，分别为89.2%及90.3%，P=0.812。B组中，EM型根除率显著低于IM＋PM型，分别为72.8%及89.6%，χ2=8.899，P=0.003。（5）A组EM型根除率显著高于B组，分别为89.2%及72.8%，χ2=6.623，P=0.01。A组IM＋PM型根除率与B组无显著性差异，分别为90.3%及89.6%，χ2=0.025，P=0.874。（6）IL-1β基因多态性分布：两组患者IL-1β-31CC（26.2% vs19.3%）、CT（54.0% vs52.9%）及TT（19.8% vs27.8%），无显著差异，P=0.104。同时，两组患者IL-1β-511CC（21.4% vs27.8%）、CT（52.4% vs53.5%）及TT（26.2% vs18.7%），无显著性差异，P=0.141。（7）IL-1β基因多态性与根除率的关系：IL-1β-31 CC型及CT+TT型患者根除率分别为89.4%及85.1%，两组间无显著性差异，P=0.315。IL-1β-511CC型及CT+TT型患者根除率分别为90.2%及84.8%，两组间无显著性差异，P=0.188。（8）CYP2C19协同IL-1β基因多态性对根除率的影响 ① CYP2C19 EM/IL-1β-31CC型及CYP2C19 EM/IL-1β-31CT+TT型根除率分别为79.4%及81.0%，两者间无显著性差异，P=0.837。CYP2C19 IM+PM/IL-1β-31CC型及CYP2C19 IM+PM/IL-1β-31CT+TT型根除率分别为96.1%及88.1%，两者间无显著性差异，P=0.115。 ②CYP2C19 IM+PM/IL-1β CC型根除率显著高于CYP2C19 EM/IL-1β CC型，分别为96.1%及79.4%，P=0.026。CYP2C19 EM/IL-1β CT+TT型收起

关键词 : 幽门螺杆菌伴同方案宿主基因多态性抗生素耐药毒力因子根除率

5. 基于急性胰腺炎数据库研究急性胰腺炎病情严重程度及感染性胰腺坏死的早期预测方法

[学位论文] 何文华南昌大学 2013年博士导师: 吕农华共156页

摘要 : 背景与目的：急性胰腺炎(AP)是一个世界范围内高发病率和死亡率的常见疾病，其中重症急性胰腺炎(SAP)死亡率达36%-50%。研究显示器官功能衰竭和感染性胰腺坏死(IPN)是决定死亡的主要因素，早期评估患者的病情严重度及IPN的发生，以指导积极地早... 展开背景与目的：急性胰腺炎(AP)是一个世界范围内高发病率和死亡率的常见疾病，其中重症急性胰腺炎(SAP)死亡率达36%-50%。研究显示器官功能衰竭和感染性胰腺坏死(IPN)是决定死亡的主要因素，早期评估患者的病情严重度及IPN的发生，以指导积极地早期治疗是改善患者预后、降低病死率的关键。2012年新修订的亚特兰大分类标准（简称新亚特兰大标准）将AP的严重程度分为三级：轻度AP(MAP)、中度AP (MSAP)和重度AP (SAP)，但未推荐APACHE Ⅱ等多因素评分系统或生物学指标用于MSAP或SAP的早期预测。本研究目的通过建立大样本的AP数据库，找出预测MSAP、SAP和死亡风险的最佳评分系统或生物学指标，并基于数据库筛选出与IPN发生的相关因素，建立早期预测IPN的多因素评分系统。方法：（一）急性胰腺炎数据库的建立 1．AP数据库的收集内容及标准参照国内外最新的AP诊治共识和指南，经我院消化内科专家讨论后制定； 2．采用Epi Info 7软件设计AP数据库，包括设计住院和门诊随访的资料的输入页面，设计自动计算功能，然后连续性地收集AP住院患者数据。（二）比较多因素评分系统及生物学指标在早期预测急性胰腺炎病情严重程度的价值 1．从建立的AP数据库中选取年龄在18岁至85岁，发病3天以内入院AP患者作为研究对象，分别按1992年亚特兰大分类标准（简称旧亚特兰大标准）和新亚特兰大分类标准对病情严重程度进行分级；将住院期间死亡或病重自动出院的患者界定为有死亡风险患者。 2．将多因素评分系统和生物学指标在MAP、MSAP和SAP三组间进行显著性检验，再以受试者操作特征(ROC)曲线比较它们预测病情严重度和死亡风险的准确性。（三）多分类Logistic回归和决策树建立预测感染性胰腺坏死的多因素评分系统 1．从建立的AP数据库选取年龄在18～85岁、发病3天内入院患者作为研究对象，按新亚特兰大分类标准分为3组：无胰腺坏死(NPN)组、无菌性胰腺坏死(SPN)组和感染性胰腺坏死(IPN)组。 2．从临床资料中选取可能与IPN相关的变量，进行NPN、SPN和IPN组间临床变量的显著性检验，从中挑选有统计学差异的变量作为多分类Logistic回归和决策树分析的自变量，定义属性、编码并设置哑变量。 3．将入选的研究对象随机分为建模库(占60%)和验证库(占40%)，以NPN、SPN和IPN作为因变量，通过平行线检验选择有序或无序多分类Logistic回归分析，以逐步回归法筛选与IPN密切相关的自变量建立多分类Logistic回归模型；以CHAID为生长法进行决策树分析筛选自变量并建立CHAID模型。 4．根据多分类Logistic回归筛选的变量的权重系数和变量类型建立预测IPN的多因素评分系统，基于决策树模型筛选的变量建立预测IPN的多因素评分系统，通过计算ROC曲线下面积(AUC)来比较两种多因素评分系统预测IPN的准确性。结果：（一）急性胰腺炎数据库的建立 1．建立的AP数据库收集了269项指标，包括基本信息、病史资料、体格检查、实验室检查、影像学检查、内科治疗、干预措施、并发症、病情评估与预后和出院随访资料。已连续性收集了2011年1月1日到2012年12月31日入住南昌大学第一附属医院的1087例AP患者数据。 2．AP数据库实现了多项创新性功能，包括自动检查错误数据、自动计算数据、自动评分、自动诊断短暂性和持续性器官功能衰竭，自动诊断MAP、MSAP和SAP。此外，它还具有数据查询、数据导入与交换、数据统计分析等功能。（二）比较多因素评分系统及单因素生物学指标在早期预测急性胰腺炎病情严重程度的价值 1．从AP数据库中选取的708例患者，按旧亚特兰大AP分类标准诊断MAP278例(39.26%)，SAP 430例(60.74%)；按照新亚特兰大分类标准诊断MAP 215例(30.23%)，MSAP 324例(45.90%)和SAP 169例(23.87%)；死亡或病重自动出院的患者41例(5.79%)，新亚特兰大分类标准诊断的SAP患者其死亡风险显著高于MSAP患者（17.16%比3.7%，P＜0.001）。 2．ROC曲线分析显示，各种多因素评分系统(APACHEⅡ评分、Ranson标准、BISAP评分)，CTSI和生物学指标(HCT、BUN、Cr、CRP和PCT)对于MSAP无预测价值，AUC在0.448～0.615之间。 3．ROC曲线分析显示，多因素评分系统、CTSI对于新亚特兰大标准诊断的SAP均有早期预测价值。在入院第1天和第2天，APACHEⅡ评分预测SAP的AUC分别为0.752和0.772; BISAP评分预测SAP的AUC分别为0.715和0.736;Ranson标准、CTSI和CRP在入院第2天预测SAP的AUC分别为0.718、0.654和0.707;其它生物学指标预测SAP的AUC均低于0.7。 4．ROC曲线分析显示，入院第1天APACHEⅡ评分、BISAP评分、HCT、BUN和Cr预测死亡风险的AUC分别为0.893、0.818、0.559、0.875和0.844，入院第2天APACHEⅡ评分、Ranson标准、BISAP评分、BUN、Cr、CRP和PCT预测死亡风险的AUC分别为0.864、0.723、0.755、0.904、0.853、0.628和0.726,入院第3天内CTSI预测死亡风险的AUC为0.478。（三）多分类Logistic回归和决策树建立预测感染性胰腺坏死的多因素评分系统 1．从AP数据库中选取的708例患者中，NPN患者521例(73.6%)，SPN患者127例(17.9%)，IPN患者60例(8.5%)。其中合并SPN的死亡风险为9.45%，合并IPN患者的死亡风险达20.00%，经行×列卡方检验差异有统计学意义(P＜0.001)。 2．多分类Logistic回归分析筛选出呼吸次数、体温、吸烟史、CTSI、NEU、Cr和PCT共7个预测IPN的变量，OR值分别为5.898、2.563、4.464、3.243、3.116、2.83和5.456。基于多分类Logistic回归模型建立了多因素评分系统，ROC曲线分析其预测IPN的AUC为0.947，截断值取9分的敏感性为95.09%，特异性为79.8%。 3．决策树选出CTSI、PCT和NEU_个预测变量，其中CTSI分节点的界值为3分（卡方值=145.78，P＜0.001），PCT分节点的界值为0.5ng/ml(卡方值=29.325，P＜0.001)，NEU分节点的界值为85%(卡方值=12.229，P=0.001）。基于决策树CHAID模型建立了多因素评分系统，ROC曲线分析其预测IPN的AUC为0.869，截断值取3分的敏感性为85.71%，特异性为69.14%。 4．ROC曲线分析显示，Logistic多因素评分系统预测IPN的准确性最高(AUC=0.945)，决策树多因素评分系统和PCT均有很高的准确性（AUC分别为0.869和0.864），但低于Logistic多因素评分系统； CTSI和APACHEⅡ评分预测IPN的AUC分别为0.756和0.690。结论： 1．利用Epi info 7软件成功建立了AP数据库，创新性地设计了自动检查错误数据、自动计算、自动评分、自动诊断等功能，使用简单、界面友好、成本低廉，在临床和科研中有很高的应用价值。 2．基于AP数据库的患者数据分析显示，各种多因素评分系统（如APACHEⅡ、BISAP等）和生物学指标（如CRP、BUN）对MSAP都无预测价值，只对SAP和死亡风险有预测价值；其中APACHE Ⅱ评分的预测SAP和死亡风险的准确性最高，BUN和Cr对于死亡风险的预测准确性也很高。 3．基于AP数据库进行多分类Logistic回归和决策树分析，分别建立了早期预测IPN的Logistic多因素评分系统和决策树多因素评分系统，其中Logistic多因素评分系统预测IPN的准确性最高，它对于指导SAP患者的抗生素使用和干预治疗具有临床应用价值。收起

关键词 : 急性胰腺炎病情严重程度感染性胰腺坏死数据库早期预测

6. 高甘油三酯血症的类型在急性胰腺炎重症化中的作用及机制的研究

[学位论文] 张悦南昌大学(医学院) 2019年博士导师: 吕农华共147页

摘要 : 背景与目的：高甘油三酯血症(Hypertriglyceridemia, HTG )是急性胰腺炎(Acute pancreatitis, AP)的其中一个重要病因，也是AP发生持续性器官衰竭的独立危险因素，与AP严重程度密切相关。并且从文献的数据中我们也能发现，大部分的HTG患者，即使... 展开背景与目的：高甘油三酯血症(Hypertriglyceridemia, HTG )是急性胰腺炎(Acute pancreatitis, AP)的其中一个重要病因，也是AP发生持续性器官衰竭的独立危险因素，与AP严重程度密切相关。并且从文献的数据中我们也能发现，大部分的HTG患者，即使是重度HTG患者不发生胰腺炎或不能促进AP的恶化，而临床也未对这其中的原因进行解释，因此目前关于HTG怎样影响了AP重症化及其机制尚不明确。 HTG的严重程度与AP的不良预后密切相关，但也不能解释同等严重程度的HTG患者的AP预后不一致的现象。高脂血症的类型是HTG的一个重要的特点，即HTG根据富甘油三酯脂蛋白(Triglyceride-rich lipoproteins, TRLs)的种类的差异可分为乳糜微粒(Chylomicrons, CMs)升高型、极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein，VLDL)升高型及两者混合升高型，它们均以甘油三酯(Triglycerides, TGs)升高为主要表现。不同类型HTG的AP发生率不一致，但不同类型与AP严重程度的关系的研究尚缺乏，我们推测HTG的不同的类型可能也影响了AP重症化的发生。因此，我们将探讨HTG的不同类型与AP严重程度的关系，并阐明其在AP进展中的作用机制。材料与方法： (一)对比相同HTG类型但不同HTG严重程度对胰腺炎的重症化的影响 1.将Gpihbp1-/-的HTG小鼠根据TG水平的不同分为两组不同HTG严重程度的动物模型(HTG1组TG水平大于1000mg/dL小于2000mg/dL，HTG2组大于2000mg/dL)，通过雨蛙肽诱导AP的发生，对比不同HTG严重程度的小鼠的胰腺损伤程度及炎症水平的差异，以明确不同HTG严重程度对胰腺重症化的影响。 2.为进一步明确HTG严重程度(血TG水平)对胰腺炎重症化的影响，我们将TG水平大于2000mg/dL的Gpihbp1-/-小鼠随机分为两组，一组提前给予非诺贝特降脂治疗，另一组作为对照，当降脂治疗组的小鼠的血TG水平明显且稳定降低后，通过雨蛙肽诱导AP，对比血TG水平降低与未降低TG水平的Gpihbp1-/-小鼠胰腺损伤程度的差异。 (二)对比相同HTG严重程度但不同HTG类型对胰腺炎的重症化的影响 1.通过透射电镜和马尔文粒径仪对比ApoC3-tg和Gpihbp1-/-两种HTG动物模型中的血TRLs颗粒的大小，以明确这两种来源的TRLs是否存在差异。 2.通过两种相同HTG严重程度但不同类型的HTG小鼠(ApoC3-tg和Gpihbp1-/-)作为动物模型，经雨蛙肽诱导AP，对比不同HTG类型小鼠的胰腺损伤程度，以明确HTG类型在加重胰腺炎损伤中的作用。 3.通过给予泊洛沙姆407(Poloxamer 407, P407)一过性升高ApoC3-tg小鼠在雨蛙肽诱导后的TG水平，对比给予P407与不给予P407的ApoC3-tg小鼠在雨蛙肽诱导后胰腺损伤程度，以明确升高ApoC3-tg小鼠在胰腺诱导过程中的TG水平是否对胰腺炎病理损伤有加重作用。 4.通过胰腺组织脂质抽提的方法，对比ApoC3-tg和Gpihbp1-/-小鼠雨蛙肽诱导与不诱导的胰腺组织中游离脂肪酸(Free fatty acids, FFAs)水平，以明确是否诱导胰腺炎后有大量FFAs产生并堆积在组织间隙，同时明确在未诱导胰腺炎时两种HTG小鼠胰腺组织中的FFAs本身存在差异。 (三)对比ApoC3-tg和Gpihbp1-/-小鼠血中的TRLs对原代胰腺腺泡细胞的影响 1.通过体外ApoC3-tg和Gpihbp1-/-小鼠来源的TRLs在不同浓度下(TG浓度定义)刺激原代胰腺腺泡细胞，比较各浓度下不同来源的TRLs及相同来源不同浓度的TRLs对细胞损伤的差异，以明确这两种不同类型的HTG小鼠是否由于其不同的TRLs对胰腺腺泡细胞有不同的损伤作用。 2.通过两种小鼠来源的TRLs分别联合与不联合奥利司他、雨蛙肽或脂肪酶刺激胰腺腺泡细胞，检测胰腺腺泡细胞坏死程度与FFAs产生水平，以明确这两种TRLs对胰腺腺泡细胞的损伤作用是否与脂肪酶的浓度有关。 3.为避免胰腺腺泡细胞在损伤过程中释放的脂肪酶的影响，通过体外无细胞环境下分析两种TRLs与脂肪酶的关系。首先通过商品化(外源性)过高浓度脂肪酶(非病理生理性的)与两种来源的TRLs反应，检测FFAs释放量；再通过提前获取的雨蛙肽刺激胰腺原代腺泡细胞产生的含有脂肪酶活性的上清(内源性脂肪酶溶液)与两种来源的TRLs进行反应，检测FFAs的释放量，并检测反应前上清的脂肪酶活性；最后通过以内源性脂肪酶活性为参照，设置不同浓度的商品化脂肪酶(外源性)与两种来源的TRLs反应，检测FFAs的释放量。主要为明确脂肪酶与两种不同来源的TRLs的作用关系。 4.通过超速离心对3例合并HTG的急性胰腺炎患者来源的血浆进行乳糜微粒和极低密度脂蛋白的分离，分离出的乳糜微粒和极低密度脂蛋白分别联合雨蛙肽对胰腺腺泡细胞进行刺激，对比乳糜微粒和极低密度脂蛋白这两种不同的TRLs对胰腺腺泡细胞的损伤作用的差异，可更有力地证明TRLs中不同颗粒是否存在不同的细胞毒性作用。 5.以往已报道脂肪酸成分也是胰腺腺泡细胞损伤的关键，因此我们通过液相色谱-质谱联用仪对ApoC3-tg和Gpihbp1-/-小鼠TRLs中的脂肪酸种类进行检测，比较了两者在脂肪酸种类上的差异，以进行补充性的探索。 (四)Gpihbp1-/-小鼠的TRLs及其分解产物FFAs对中性粒细胞的影响 1.在Gpihbp1-/-小鼠导致胰腺炎重症化的基础上，并且其诱导的胰腺组织中集聚了大量中性粒细胞和FFAs，加之坏死组织周围大量中性粒细胞的形态发生改变，因此我们进一步通过体外Gpihbp1-/-小鼠的TRLs或其分解产物FFAs刺激骨髓来源的中性粒细胞，检测是否出现中性粒细胞的损伤，以明确该TRLs及FFAs是否对中性粒细胞也有损伤作用。 2.由于中性粒细胞产生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)对其它组织细胞有损伤作用，因此我们也通过Gpihbp1-/-小鼠的TRLs或其分解产物FFAs刺激中性粒细胞后检测其ROS水平。 3.检测胰腺坏死组织的中性粒细胞胞外捕获网络(Neutrophil extracellular traps, NETs)水平及并通过体外Gpihbp1-/-小鼠的TRLs或其分解产物FFAs刺激中性粒细胞检测是否促进NETs水平。 (五)体内实验验证脂肪酶对Gpihbp1-/-小鼠发生胰腺炎重症化中的影响 1.在Gpihbp1-/-小鼠雨蛙肽诱导胰腺炎重症化模型的基础上，加之体外实验证实的脂肪酶的抑制可阻止胰腺腺泡细胞的损伤，前期研究得出雨蛙肽诱导野生型小鼠出现血脂肪酶及淀粉酶的升高，棕榈油酸联合乙醇诱导则不出现酶水平的升高，因此我们通过两种不同病理生理机制的胰腺炎诱导方法诱导Gpihbp1-/-小鼠，以雨蛙肽诱导作为对照，即可诱导胰腺炎重症化，探究棕榈油酸联合乙醇是否可导致Gpihbp1-/-小鼠胰腺损伤加重，以在体内验证脂肪酶是否可能也是影响HTG小鼠重症化的因素之一。 2.通过多因素logistics回归分析在AP合并有重度HTG患者中，早期24小时内血清脂肪酶活性是否是持续性器官衰竭发生的独立危险因素。结果： (一)在Gpihbp1-/-动物模型中，HTG的严重程度与雨蛙肽诱导的胰腺炎的重症化有关 1.与HTG1组相比，HTG严重程度更高的Gpihbp1-/-小鼠(HTG2组)在雨蛙肽诱导胰腺炎后胰腺病理损伤明显加重并出现大片状胰腺坏死(无正常细胞结构)，胰腺组织的炎症水平也明显加重，并且胰腺坏死区周围凋亡细胞明显增多，大片状胰腺坏死发生率也明显更高。 2.非诺贝特降脂治疗组的Gpihbp1-/-小鼠血TG水平明显降低，在雨蛙肽诱导后，胰腺病理损伤明显减轻，大片状胰腺坏死发生率也明显降低。 (二)在ApoC3-tg和Gpihbp1-/-动物模型中，HTG的类型与雨蛙肽诱导的胰腺炎的重症化有关 1.在同等血浆TG水平的情况下，多种检测方法显示Gpihbp1-/-较ApoC3-tg小鼠的TRLs颗粒大，透射电镜显示Gpihbp1-/-较ApoC3-tg小鼠的TRLs颗粒大而数量少。 2.在同等TG水平的情况下，经雨蛙肽诱导后，Gpihbp1-/-较ApoC3-tg小鼠出现明显严重的胰腺病理损伤，更严重的中性粒细胞浸润及更高的胰腺坏死发生率。 3.即使通过P407一过性升高ApoC3-tg小鼠在雨蛙肽诱导后的血TG水平，诱导后的胰腺病理损伤仅轻度升高，不出现大片状胰腺坏死的现象。 4.Gpihbp1-/-小鼠在雨蛙肽诱导后胰腺组织中的FFAs明显高于ApoC3-tg小鼠及不诱导胰腺炎的Gpihbp1-/-小鼠。 (三)相比ApoC3-tg小鼠，Gpihbp1-/-小鼠的TRLs由于对脂肪酶更敏感而产生更多的FFAs，从而导致更多的原代胰腺腺泡细胞损伤坏死 1.随着TG水平升高，Gpihbp1-/-小鼠来源血浆TRLs对胰腺腺泡细胞的损伤逐渐加重，而ApoC3-tg小鼠的TRLs无明显的胰腺腺泡细胞损伤作用；在TG水平为40mg/dL时，Gpihbp1-/-小鼠来源血浆TRLs对胰腺原代腺泡细胞的损伤明显高于ApoC3-tg小鼠。 2.奥利司他减少Gpihbp1-/-小鼠的TRLs刺激胰腺腺泡细胞时释放的FFAs的产生并抑制细胞坏死；联合雨蛙肽可增加两种TRLs的FFAs的释放且增加了胰腺腺泡细胞坏死程度，但Gpihbp1-/-组仍高于ApoC3-tg组；联合高浓度的外源性胰脂酶可大量增加两种TRLs的FFAs的释放且增加了胰腺腺泡细胞坏死程度，并且Gpihbp1-/-组与ApoC3-tg组FFAs的产生水平和细胞坏死水平一致。 3.外源性过量的胰脂酶(远超过病理生理浓度)可促使ApoC3-tg和Gpihbp1-/-产生一致的FFAs水平；与ApoC3-tg来源的TRLs对比，内源性脂肪酶(来源性雨蛙肽刺激胰腺腺泡细胞的上清液)促进Gpihbp1-/-来源的TRLs产生更多的FFAs；在各浓度(病理生理浓度)的外源性脂肪酶的作用下，Gpihbp1-/-来源的TRLs也较ApoC3-tg产生更多的FFAs。 4.合并HTG的急性胰腺炎患者来源的乳糜微粒较极低密度脂蛋白在胰腺腺泡细胞中产生更多的FFAs并对胰腺腺泡细胞有更强的损伤作用。 5.另外，我们还发现Gpihbp1-/-小鼠的TRLs中的多不饱和脂肪酸(以往文献显示不饱和脂肪酸是产生细胞毒性的主要脂肪酸)明显高于ApoC3-tg小鼠。 (四)Gpihbp1-/-小鼠来源的TRLs及其释放的FFAs导致中性粒细胞损伤及功能变化 1.Gpihbp1-/-小鼠来源的TRLs或其释放的FFAs均促进中性粒细胞死亡，其中TRLs引起的细胞死亡后形态较完整，而FFAs引起的细胞死亡导致细胞裂解(细胞DNA大量释放至细胞外)。 2.Gpihbp1-/-小鼠来源的TRLs可促进中性粒细胞ROS产生，而TRLs释放的FFAs不能促进ROS的产生。 3.Gpihbp1-/-小鼠雨蛙肽诱导后的胰腺坏死组织区NETs形成增加，而Gpihbp1-/-小鼠来源的TRLs及其释放的FFAs均不能促进中性粒细胞NETs形成。 (五)脂肪酶在高甘油三酯血症致急性胰腺炎重症化中起重要作用 1.与棕榈油酸联合乙醇诱导野生型小鼠对收起

关键词 : 急性胰腺炎重症化游离脂肪酸高甘油三酯血症临床治疗

7. 幽门螺杆菌感染对胃黏膜上皮细胞DNA损伤修复机制的影响

[学位论文] 谢川南昌大学 2016年博士导师: 吕农华共141页

摘要 : 背景与目的: 胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一。最新全球癌症的流行病学数据表明：全球胃癌男、女性新发病人数分别占癌症的第4位和第5位，男、女胃癌病死率分别占癌症相关死亡的第3位和第5位。我国是胃癌发病大国，全球每年新发胃癌半数以上在中国... 展开背景与目的: 胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一。最新全球癌症的流行病学数据表明：全球胃癌男、女性新发病人数分别占癌症的第4位和第5位，男、女胃癌病死率分别占癌症相关死亡的第3位和第5位。我国是胃癌发病大国，全球每年新发胃癌半数以上在中国。大多数胃癌病例确诊时已处晚期，治疗方法有限、预后不佳。明确胃癌的发生机制，制定有效的胃癌一级预防策略迫在眉睫。 DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）是一种最严重的DNA损伤形式，其精确修复依赖于DNA损伤信号通路的激活传递及各种修复蛋白的协同发挥功能。细胞自噬对基因组稳定亦发挥重要作用，细胞自噬的缺陷可通过影响DNA损伤修复过程中关键蛋白的活性导致DNA修复异常。DNA损伤修复机制的缺陷易引起基因组的不稳定，而这种基因组的不稳定性毫无疑问对肿瘤的发生发展起着十分重要的促进作用。目前认为，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染是慢性非萎缩性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一演变过程的始动因素，然而其确切致癌机制尚不清楚。Hp感染是否可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs？DNA损伤反应信号通路及细胞自噬如何变化？Hp感染是否可以通过干扰 DNA的修复机制进而导致基因组不稳定性，引起细胞生物学功能的异常......？本研究将针对以上问题进行探讨，为阐明Hp的致癌机制提供新的理论依据。材料与方法: （一）Hp感染诱导胃黏膜上皮细胞DSBs的体内外研究： 1.收集慢性非萎缩性胃炎（chronic non-atrophic gastritis, CNAG）、肠上皮化生（intestinal metaplasia, IM）、异型增生（dysplasia, Dys）和胃癌（gastric cancer, GC）组织，通过免疫组化检测各病变阶段γH2AX（DSBs的检测指标）的表达，并分析其与Hp感染的关系； 2.通过建立Hp活菌体外与GES-1细胞共培养细胞模型，Western blot检测γH2AX的表达，中性单细胞凝胶电泳实验检测DSBs； 3.构建Hp感染蒙古沙鼠动物模型，免疫组化检测胃黏膜组织γH2AX的表达。（二） Hp感染对DNA损伤修复信号通路及细胞自噬的影响： 1.免疫组化检测不同病变阶段胃黏膜标本 DNA损伤修复通路、细胞自噬相关蛋白的表达，并分析其与Hp感染的关系； 2.检测Hp活菌体外与GES-1细胞共培养后DNA损伤修复通路、细胞自噬相关指标的变化； 3.利用Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒检测Hp活菌作用GES-1细胞后自噬流的变化； 4.流式细胞术检测Hp活菌与GES-1细胞培养后细胞周期变化； 5. Hp活菌与Rad51过表达或敲除的GES-1细胞共培养，检测DSBs及相关指标的变化。（三）细胞自噬对Hp诱导GES-1细胞DSBs损伤修复的影响： 1. Hp活菌与自噬干预后GES-1细胞共培养，检测DSBs及相关指标、Rad51的表达和细胞周期的变化； 2.同时干预GES-1自噬水平及Rad51表达水平，观察自噬对DNA损伤修复的调节是否依赖于Rad51的表达。结果：（一）Hp感染诱导胃黏膜上皮细胞DSBs的体内外研究：我们通过检测不同病变阶段胃黏膜标本中γH2AX的表达，发现其在胃黏膜癌变过程中发挥重要作用，且γH2AX表达与胃癌部位、大体分型、分化程度、肿瘤浸润深度、TNM分期和淋巴转移相关，与胃癌预后呈负相关；进一步分析发现γH2AX在Hp阳性IM与Dys组织的表达高于Hp阴性组。通过构建Hp活菌体外与GES-1细胞共培养，发现Hp感染可诱导GES-1细胞发生DSBs。进一步在蒙古沙鼠模型进行验证，发现 Hp感染可诱导蒙古沙鼠胃黏膜上皮细胞γH2AX的高表达。上述实验结果提示：Hp体内外感染均可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs。（二）Hp感染对DNA损伤修复信号通路及细胞自噬的影响：我们检测了不同胃黏膜病变阶段中DNA损伤修复通路、细胞自噬相关蛋白的表达，发现DNA损伤修复通路及细胞自噬参与胃黏膜的癌变过程，且与胃癌临床病理参数密切相关，其中Beclin-1、p62和BRCA2表达与胃癌预后呈正相关，而p-ATM（S1981）、Rad51表达与胃癌预后呈负相关。进一步分析各病变阶段Hp阳性亚组与Hp阴性亚组间的差异，发现：①在CNAG和IM病变阶段，Hp阳性亚组中p-ATM（S1981）、p-Chk2（T68）、p-p53（S15）的表达均高于Hp阴性亚组；②在Dys病变阶段，Hp阳性亚组中Rad51的表达低于Hp阴性亚组。在细胞实验中，我们发现Hp活菌作用GES-1细胞6h后即可激活DNA损伤反应信号通路以及细胞自噬，诱导细胞发生S期阻滞；但随着作用时间延长，12h后Rad51蛋白表达和自噬水平均呈下降趋势；转染Rad51质粒对Hp诱导的GES-1细胞DSBs起保护作用，敲除Rad51则作用相反。动物实验进一步证实，Hp感染12月亚组蒙古沙鼠胃黏膜组织p62表达水平高于对照组；Hp感染18月亚组蒙古沙鼠胃黏膜组织Rad51表达水平低于对照组。上述实验结果提示：DNA损伤修复信号通路在胃黏膜癌变早期发挥重要的抗癌屏障作用；Hp感染可激活胃黏膜上皮细胞DNA损伤信号通路及细胞自噬，但随着感染时间延长，Hp感染可下调自噬水平并导致 DNA同源重组修复能力下降。（三）细胞自噬对Hp诱导GES-1细胞DSBs损伤修复的影响：我们采用两种自噬激动（Rapamycin和饥饿处理）及自噬抑制剂（3-MA和BafA1）对GES-1细胞进行预处理，后与Hp活菌共培养；发现上调自噬可促进GES-1细胞Rad51表达，减少DSBs发生，而抑制自噬则下调GES-1细胞Rad51表达，并促进DSBs发生；进一步行补救实验（即在上调自噬的同时敲除Rad51或抑制自噬的同时过表达 Rad51），发现细胞自噬对 DSBs的保护作用依赖于Rad51的表达。结论： 1. Hp感染可诱导胃黏膜上皮细胞发生DNA双链断裂并激活DNA损伤应答信号通路；DNA损伤应答信号通路的激活在早期胃黏膜癌变过程中发挥重要抗癌屏障作用。 2. Hp感染可通过抑制细胞自噬水平，降低 Rad51表达，进而影响胃黏膜上皮细胞DNA损伤修复机制。收起

关键词 : 幽门螺杆菌感染胃癌胃黏膜上皮细胞 DNA损伤修复致癌机制

8. 幽门螺杆菌CagA通过调控Hippo/YAP信号诱导细胞上皮间充质转化中的作用机制研究

[学位论文] 李年双南昌大学 2018年博士导师: 吕农华共136页

摘要 : 背景与目的: 近年来虽然胃癌的发病率和死亡率总体有所下降，但仍是包括中国在内东亚地区的高发恶性肿瘤。最新统计学数据表明，胃癌居我国肿瘤发病率与死亡率第二位。目前大多数胃癌患者确诊时已处于晚期，治疗方法有限、预后较差。幽门螺杆菌（... 展开背景与目的: 近年来虽然胃癌的发病率和死亡率总体有所下降，但仍是包括中国在内东亚地区的高发恶性肿瘤。最新统计学数据表明，胃癌居我国肿瘤发病率与死亡率第二位。目前大多数胃癌患者确诊时已处于晚期，治疗方法有限、预后较差。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，与弥漫型及肠型胃癌的发生也密切相关。早在1994年WHO将H.pylori列为I类致癌因子。多研究表明，根除H. pylori可明显降低胃癌的发生风险。关于H.pylori感染致胃黏膜癌变的机制研究对于胃癌的早期筛查及预防策略制定具有十分重要的意义。目前全球范围内近50%人群感染 H. pylori，仅少数人发展成胃癌。究其原因，除宿主与环境因素外，H. pylori细菌毒力差异是导致其感染后不同临床结局的关键因素。CagA是H.pylori最关键的毒力因子之一，其通过T4SS系统进入宿主细胞后可通过多种调控多种信号通路导致细胞过度增殖、凋亡受抑制、迁移能力增强等多种生物行为学异常，最终促进胃黏膜癌变过程。循证医学证据表明，CagA阳性的H. pylori菌株可明显增加胃癌发生的风险。CagA转基因小鼠最终也会发生胃上皮内瘤变，促进上皮细胞表型转化为间充质表型，称之为上皮间充质转化（Epithelial-Meschymal transion,EMT），使细胞失去极性、获得迁移能力等。但是H.pylori CagA调控EMT的具体机制仍不明确。 Hippo/YAP信号通路通过调控细胞增殖与凋亡平衡，在控制器官发育、维持器官大小等发面发挥着重要作用。近年来研究表明，YAP作为该信号通路中关键的效应分子，其异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关。Hippo信号的异常可上调YAP的表达，促进YAP从细胞质转入细胞核中，诱导下游功能基因过表达，进而驱动细胞的过度增殖、存活及转移等。有研究显示，H.pylori感染与烷化剂MNNG联合作用后可引起小鼠胃黏膜YAP及其下游靶基因mRNA水平上调。但是H.pylori单一感染是否会引起Hippo/YAP信号异常进而激活原癌蛋白YAP，以及毒力蛋白CagA在H.pylori调控Hippo/YAP信号通路中具体扮演何种角色，以上均需进一步探讨。 Hippo/YAP信号通路在调控EMT这一重要肿瘤恶性转化标志过程中起着非常重要的作用。Hippo/YAP信号通路异常引起YAP过表达进入细胞核后可诱导EMT的发生。EMT是胃黏膜恶性转化的标志之一，发生后上皮细胞失去极性与粘附，转化成迁移能力较强的间充质细胞样特征。CagA+H. pylori感染胃黏膜上皮细胞后也可诱导EMT的发生。目前，Hippo/YAP信号在CagA+H.pylori诱导EMT发生过程的作用尚不清楚。因此，在本课题中，我们旨在探讨Hippo/YAP信号通路在H.pylori感染致胃黏膜病变过程中的作用；阐明CagA在H.pylori感染调控Hippo/YAP信号中所扮演的角色；进一步研究Hippo/YAP信号转导在H.pylori感染诱导EMT过程中的作用及临床意义。材料与方法: （一）探讨H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路的影响 1.收集不同病理分期的胃癌（含癌旁组织），通过免疫组化检测Hippo/YAP信号中关键分子YAP及其同源物TAZ的表达，并分析其表达与临床病理参数的关系； 2.将CagA+H.pylori菌株7.13、PMSS1与CagA-H.pylori菌株SS1与胃癌AGS细胞共培养，Western blot检测Hippo/YAP信号关键蛋白的表达，qRT-PCR检测信号下游靶基因CTGF、CYR61的表达；（二）幽门螺杆菌cagA基因敲除PMSS1△cagA突变菌株的构建与鉴定 1.参考PMSS1 cagA基因全长序列，设计两对引物（cagAupF/cagAL-5’RXS、cagAdnR/cagAF-3’FXS），采用重叠PCR构建cagA up-dn扩增片段，使其包含cagA基因上下游片段。将cat基因盒插入该片段，最终得到cagA基因敲除的重组质粒； 2.通过电转化和自然转化将cagA基因敲除的重组质粒转化至PMSS1野生型菌株，筛选单克隆培养得到cagA基因敲除突变菌株PMSS1△cagA； 3.设计引物，琼脂糖凝胶电泳检测PMSS1△cagA菌株中cagA基因片段是否存在以及验证cat基因盒的插入方向；Western blot检测PMSS1△cagA菌株中CagA是否被敲除。（三）毒力因子CagA在幽门螺杆菌诱导YAP表达、核移位及转录活性中的作用机制研究 1.将PMSS1野生型与△cagA菌株分别与胃癌AGS细胞共培养，Western blot检测CagA的转运及磷酸化水平，观察细胞形态学变化； 2.将从胃黏膜不同病变阶段（慢性胃炎、肠上皮化生、胃癌）分离的临床H. pylori菌株分别与AGS细胞共培养，Western blot检测CagA的转运及磷酸化水平； 3.将CagA+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株与相应的cagA基因敲除突变菌株与胃癌AGS细胞共培养： ①Western blot检测Hippo/YAP信号通路中关键分子YAP蛋白表达水平； ②免疫荧光检测YAP的细胞内定位； ③qRT-PCR检测Hippo/YAP信号关键效应分子YAP及其下游靶基因CTGF、CYR61 mRNA表达水平。（四）Hippo/YAP通路活化在H.pylori CagA诱导上皮间充质转化过程中的作用 1.将CagA+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株与相应的cagA基因敲除突变菌株与胃癌 AGS细胞共培养，免疫荧光实验检测EMT上皮细胞标志物 E-cadherin的表达水平； 2.外源性转入YAP cDNA至胃癌AGS细胞，Western blot检测EMT相关蛋白表达； 3.使用YAP抑制剂Verteporfin预处理后将CagA+H. pylori PMSS1、7.13菌株感染细胞，免疫荧光检测E-cadherin的表达水平，Western blot检测EMT相关蛋白表达，Transwell实验检测细胞侵袭能力； 4.收集慢性非萎缩性胃炎（chronic non-atrophic gastritis,CNAG）、肠上皮化生（intestinal metaplasia,IM）、异型增生（dysplasia,Dys）和胃癌（gastric cancer,GC）组织，通过免疫组化检测各病变阶段YAP、E-cadherin的表达，并分析其与H.pylori感染的关系。结果：（一）探讨H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路的影响 1.我们通过检测胃癌组织中 YAP及其同源物TAZ的表达，发现细胞质与细胞核均存在二者表达。胃癌组织YAP、TAZ表达水平显著高于癌旁组织，且随着肿瘤恶性程度增加，其细胞内定位从细胞质逐渐转入至细胞核。进一步分析其表达与临床病理参数之间关系发现，YAP、TAZ表达水平与患者年龄、性别及肿瘤位置及肿瘤大小无明显关系，与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移数密切相关。 2.CagA+ H.pylori PMSS1、7.13菌株与胃癌AGS细胞共培养后，发现H.pylori感染早期可上调Hippo/YAP信号关键效应分子YAP及其下游靶基因CTGF、CYR61表达。而磷酸化YAP及其上游激酶LATS1磷酸化表达均上调。以上实验结果提示：CagA+ H.pylori感染早期可诱导胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路活化，YAP激活，下游靶基因表达上升，该过程不依赖于经典的Hippo上游信号调控机制。（二）cagA基因敲除H.pylori PMSS1△cagA突变菌株的构建与鉴定 1.通过重叠PCR法成功构建cagA基因敲除的重组质粒，由于cat基因盒（上、下游引物分别为54、55）插入方向随机，得到54、55两种cagA基因敲除重组质粒。以自然转化（N）、电转化（E）进入PMSS1菌株后筛选氯霉素抗性的克隆并扩增，最终得到四株PMSS1△cagA突变菌株，分别命名为54E、54N、55E、55N。 2.琼脂糖凝胶电泳结果表明这四个突变菌株cagA均已被敲除，54E、54N菌株中cat基因盒以54→55方向插入，55E、55N菌株中cat基因盒以55→54方向插入。Western blot结果显示这四个突变菌株不表达CagA蛋白。以上结果表明：PMSS1△cagA突变菌株构建成功。（三）毒力因子CagA在幽门螺杆菌诱导YAP表达、核移位及转录活性中的作用机制研究 1. PMSS1菌株CagA敲除后无CagA转运至胃癌AGS细胞中。CagA+H.pylori菌株可诱导胃上皮细胞形态拉伸形成“蜂鸟状表型”，CagA敲除后细胞形态无变化。SS1菌株由于缺乏功能性的T4SS1导致CagA无法进入宿主细胞内，感染后细胞形态也无明显变化。 2.来自于胃癌组织的H.pylori临床菌株进入胃上皮细胞中CagA表达明显高于来自于慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生组织的H.pylori临床菌株，慢性萎缩性胃炎与肠上皮化生组无明显差异。 3.CagA+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株感染AGS细胞后可诱导Hippo/YAP信号中关键分子YAP的表达，促进其核转位，以及上调下游靶基因CTGF、CYR61的表达，而CagA敲除后则显著抑制了H.pylori活化Hippo/YAP信号通路的能力。以上结果证实：CagA在H.pylori感染异常调控Hippo/YAP信号过程中起着重要作用。（四）Hippo/YAP通路活化在H.pylori CagA诱导上皮间充质转化过程中的作用 1.CagA+H.pylori感染AGS细胞后可抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达，CagA敲除后即可恢复部分E-cadherin表达，表明H.pylori CagA可诱导EMT发生； 2.细胞过表达YAP后可下调E-cadherin的表达，上调间充质细胞标志物N-cadherin的表达，促进EMT的发生； 3.Verteporfin抑制YAP活性后可恢复部分H.pylori感染导致的E-cadherin下调，抑制H.pylori感染诱导的N-cadherin、Slug上调； 4.Verterporfin显著抑制CagA+H.pyloti感染诱导的胃癌AGS细胞侵袭； 5.随着胃黏膜病变程度加深（慢性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌），YAP表达逐渐上升，相反，E-cadherin表达逐渐降低，二者表达呈负相关。进一步分析各病变阶段H.pylori感染组与H.pylori未感染组间的差异，发现在慢性胃炎的患者中，H.pylori感染组YAP表达水平显著高于H.pylori未感染组，E-cadherin表达水平则呈现相反的趋势。以上研究结果提示，Hippo/YAP信号异常导致的促癌基因YAP激活在CagA+H.pylori感染诱导EMT过程中发挥重要作用。且在胃黏膜癌变早期过程中H.pylori感染即可活化Hippo/YAP信号通路，激活YAP表达，降低EMT上皮细胞标志物E-cadherin表达。结论： 1.H.pylori感染可引起Hippo/YAP信号转导异常，促进关键效应分子YAP激活并从细胞质转入至细胞核，诱导下游靶基因表达。细菌毒力蛋白CagA在该收起

关键词 : 胃癌幽门螺杆菌毒力因子效应分子信号通路上皮间充质转化

9. 厌氧消化链球菌通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜病变

[学位论文] 欧阳耀斌南昌大学医学部 2022年博士导师: 吕农华共135页

摘要 : 背景与目的: 作为一种可能的胃内致病菌，P.anaerobius在胃黏膜癌变过程有何作用，其能否激活胃黏膜TLRs和下游的NF-κB信号通路介导胃内病变，这些值得深入探讨。本课题拟采用人体胃黏膜样本、转基因动物、细胞三个层面的实验明确：P.anaerobiu... 展开背景与目的: 作为一种可能的胃内致病菌，P.anaerobius在胃黏膜癌变过程有何作用，其能否激活胃黏膜TLRs和下游的NF-κB信号通路介导胃内病变，这些值得深入探讨。本课题拟采用人体胃黏膜样本、转基因动物、细胞三个层面的实验明确：P.anaerobius是否在胃黏膜癌变过程丰度增加；P.anaerobius能否在体内外发挥促癌作用；P.anaerobius致病机制如何、TLRs、NF-κB信号通路在其致病中有何作用。明确以上问题，可为菌群参与胃癌发生提供新的证据以及为胃癌防控提供新的思路。材料与方法: （一）胃炎、肠化、胃癌患者P.anaerobius丰度变化（二）P.anaerobius对胃上皮细胞生物学行为的影响构建P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS模型。（三）P.anaerobius通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症构建P.anaerobius与胃上皮细胞AGS、GES-1共培养模型，行以下实验： 1.提取AGS、GES-1细胞mRNA，行转录组测序，分析P.anaerobius感染相关差异基因，行差异基因KEGG通路富集分析； 2.提取AGS细胞蛋白，Western blot检测细胞NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IKK、p-IKK（Ser176/180）、IκBα）表达，免疫荧光实验检测P.anaerobius感染后AGS细胞P65入核情况； 3.提取AGS细胞mRNA，qRT-PCR检测NF-κB信号通路上游TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5）及TRIF、Myd88表达，Western blot检测以上分子蛋白表达； 4.转染TLR4siRNA抑制AGS细胞TLR4表达，Western blot检测抑制TLR4后，P.anaerobius感染对细胞NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IKK、p-IKK（Ser176/180）、IκBα）及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达变化； 5.分别使用TLR4siRNA、TLR4抑制剂TAK-242及TRIF siRNA抑制细胞TLR4、TRIF表达，qRT-PCR检测抑制TLR4、TRIF表达后，P.anaerobius感染对细胞炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18）表达变化； 6.构建FLAG与目的基因TLR4融合质粒，构建P.anaerobius与TLR4过表达细胞共培养模型。使用FLAG抗体行外源性免疫共沉淀（IP）实验下拉与TLR4结合的细菌蛋白并行质谱分析鉴定蛋白成分。（四）P.anaerobius感染对INS-GAS小鼠胃黏膜病变的影响 P.anaerobius菌隔天灌胃3个月构建P.anaerobius感染INS-GAS小鼠模型，灌胃结束后1个月处死小鼠，收集小鼠粪便、胃黏膜样本，行以下实验： 1.PCR实验、FISH实验检测P.anaerobius菌定植； 2.H＆E染色检测胃黏膜病变、阿尔新蓝-核固红染色检测胃黏膜化生情况； 3.免疫组化检测小鼠胃黏膜CD45、Ki67表达； 4.qRT-PCR检测小鼠胃黏膜炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18）表达; 5.Western blot、免疫组化、免疫荧光实验检测P.anaerobius感染INS-GAS小鼠胃黏膜NF-κB信号通路关键蛋白（p-P65（Ser536）、P65、IκBα）及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达。结果：（一）胃炎、肠化、胃癌患者P.anaerobius丰度变化我们收集了胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜样本行16S rRNA测序，通过LEFSe分析筛选了胃炎、胃癌患者胃黏膜显著差异的细菌。结果表明在属水平上胃癌患者消化链球菌属（Peptostreptococcus）丰度显著高于胃炎患者。进一步分析发现消化链球菌属相对丰度在胃炎、肠化、胃癌三个阶段呈递增趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。为了证实测序结果，我们收集了胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜组织蜡块，对蜡块切片行FISH实验检测P.anaerobius菌定植，FISH实验结果与测序结果相一致，P.anaerobius菌在胃炎、肠化、胃癌患者胃黏膜丰度逐渐增高。以上结果表明胃炎、肠化、胃癌三个病变阶段P.anaerobius菌丰度逐渐增高，提示其可能参与胃黏膜癌变过程。（二）P.anaerobius对胃上皮细胞生物学行为的影响结果一提示P.anaerobius可能是胃内致病菌，于是我们进一步构建了P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS的体外模型，以明确P.anaerobius对胃上皮细胞的生物学行为影响。电镜实验结果表明P.anaerobius菌可直接与细胞表面接触，且部分P.anaerobius菌可进入细胞内。CCK-8、EDU实验表明P.anaerobius感染可显著促进胃上皮细胞增殖（P＜0.05），Transwell侵袭、迁移实验表明P.anaerobius菌可显著促进细胞侵袭、迁移能力（P＜0.001）。此外，P.anaerobius感染显著上调细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-18表达（P＜0.001），促进细胞炎症。（三）P.anaerobius通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症我们进一步构建了P.anaerobius感染胃上皮细胞AGS、GES-1模型，提取细胞mRNA行转录组测序。分析显示P.anaerobius菌感染细胞后，NF-κB信号通路显著富集，我们推测P.anaerobius菌通过NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症。实验发现P.anaerobius菌可显著上调细胞p-P65（Ser536）、p-IKK（Ser176/180）表达（P＜0.05），显著下调IκBα表达（P＜0.05），促进P65入核，且P.anaerobius上调p-P65（Ser536）表达呈MOI依赖。TLRs、TRIF、Myd88是NF-κB信号通路上游，我们发现P.anaerobius菌感染显著上调细胞TLR4、TLR5、TRIF mRNA表达（P＜0.05），而TLR1、Myd88表达无明显变化。P.anaerobius菌感染后同样上调细胞LTR4、TRIF蛋白表达（P＜0.05），而Myd88表达无明显变化。于是我们推测P.anaerobius菌可通过TLR4/TRIF激活下游NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症。实验结果表明使用TLR4siRNA抑制TLR4表达后可抑制P.anaerobius介导的NF-κB信号通路激活。使用TLR4siRNA、抑制剂TAK-242，TRIF siRNA抑制TLR4、TRIF表达后均可明显减轻P.anaerobius介导的细胞炎症因子TNF-α、IL-1β表达（P＜0.01）。（四）P.anaerobius感染对INS-GAS小鼠胃黏膜病变的影响为了明确P.anaerobius感染能否在体内诱导INS-GAS转基因小鼠胃黏膜病变，我们构建了P.anaerobius感染INS-GAS小鼠模型。并首先检测了P.anaerobius定植，结果表明对照组小鼠粪便DNA扩增产物电泳后未见条带，6只感染组小鼠中有4只可见明显的P.anaerobius特异性条带。胃黏膜FISH实验发现感染组小鼠胃内可见P.anaerobius菌定植，以上结果表明P.anaerobius在INS-GAS小鼠胃内成功定植。小鼠胃黏膜H＆E染色显示P.anaerobius感染小鼠胃黏膜明显增厚，可见腺体囊状扩张，黏膜基底部有明显炎症细胞浸润，炎症评分显著高于对照组（P＜0.05），P.anaerobius感染小鼠胃黏膜CD45免疫组化染色评分显著高于对照组（P＜0.05）。此外P.anaerobius感染可显著上调小鼠胃黏膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18表达（P＜0.05）。小鼠胃黏膜阿尔新蓝-核固红染色可见P.anaerobius感染小鼠胃黏膜有大量呈蓝色的泌酸性黏液腺体，表明P.anaerobius感染与黏膜肠化有关。我们进一步验证了P.anaerobius感染对小鼠胃黏膜NF-κB信号通路关键蛋白及TLR4、TRIF、Myd88蛋白表达的影响，结果表明P.anaerobius菌感染可显著上调小鼠胃黏膜TLR4、TRIF、p-P65（Ser536）表达，促进P65入核，下调IκBα表达（P＜0.05）。结论： 1.P.anaerobius感染可介导胃上皮细胞生物学行为改变，引起INS-GAS小鼠胃黏膜病变，促进体内外炎症反应; 2.P.anaerobius感染通过TLR4/TRIF/NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症，抑制TLR4及TRIF可明显减轻P.anaerobius感染介导的炎症反应。收起

关键词 : 胃黏膜炎症厌氧消化链球菌信号通路细胞生物学

10. 短链脂肪酸对重症急性胰腺炎的保护作用及其机制研究

[学位论文] 李雪洋南昌大学医学部 2022年博士导师: 吕农华共132页

摘要 : 背景与目的: 急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）通常由胆道结构性梗阻、饮酒、内镜逆行胰胆管造影和药物引起，最终导致腺泡细胞死亡，诱发局部和全身炎症。大约15%-20%的患者会发展为重症急性胰腺炎（severeacutepancreatitis,SAP）。SAP过程... 展开背景与目的: 急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）通常由胆道结构性梗阻、饮酒、内镜逆行胰胆管造影和药物引起，最终导致腺泡细胞死亡，诱发局部和全身炎症。大约15%-20%的患者会发展为重症急性胰腺炎（severeacutepancreatitis,SAP）。SAP过程中出现微循环损伤和低血容量，可引起肠黏膜缺血，继而再灌注损伤，导致肠屏障功能障碍和肠道菌群移位，而且肠黏膜屏障损伤导致的肠道细菌移位是引起胰腺感染坏死感染的关键环节。肠道菌群构成肠黏膜的生物屏障，可防御病原体感染，除肠道菌群本身，菌群代谢产物短链脂肪酸（Shortchainfattyacids,SCFAs），包括乙酸、丙酸、丁酸，可为肠上皮细胞提供能量，对肠黏膜屏障的正常生理功能及上皮完整性起重要保护作用。SCFAs可通过降低肠道pH值，增加粪便酸化，增加肠道菌群的生长和多样性。此外，SCFAs能促进一些有益细菌的增殖，如双歧杆菌（Bifidobacteria）和乳酸杆菌（Lactobacilli）。这些有益菌反过来刺激了短链脂肪酸的合成，降低肠道pH值，抑制病原菌定植，改善肠道微生物屏障功能，促进肠道内环境稳定。但是肠道菌群-SCFAs在SAP发生发展过程中肠黏膜屏障损伤的机制仍不清楚，因此从调节肠道菌群-SCFAs代谢失衡角度纠正肠黏膜屏障功能障碍减少肠道细菌移位对预防SAP继发胰腺坏死感染、改善患者预后具有现实指导意义。材料与方法: （一）检测分析短链脂肪酸在SAP发病过程中含量的变化 1、通过GC-MS技术检测SAP患者和健康人群粪便SCFAs含量。 2、通过GC-MS技术检测SAP小鼠和正常对照小鼠粪便SCFAs含量。（二）构建SAP动物模型，探讨短链脂肪酸对SAP疾病严重程度的影响。 1、构建雨蛙素诱导的SAP小鼠模型，实验分为六个组：control组、cer组、SCFAs_cer组、乙酸_cer组、丙酸_cer组和丁酸_cer组，比较各组小鼠胰腺损伤程度、胰腺体重比和胰腺病理评分。 2、除雨蛙素诱导的SAP模型外，通过构建另外两种SAP动物模型即Bombesin联合雨蛙素模型和M3/ptf1α小鼠SAP模型，验证SCFAs在SAP中的作用，比较各组小鼠胰腺损伤程度。 3、分别通过ELISA检测各组小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平，观察雨蛙素诱导的SAP小鼠模型其水平变化及补充SCFAs后的影响。 4、通过免疫组化检测各组小鼠胰腺组织MPO（中性粒细胞）和F4/80（巨噬细胞）表达，观察SCFAs对SAP小鼠胰腺组织炎症细胞浸润的影响。 5、通过血清多因子ELISA检测各组小鼠血清IL-17A、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和INF-γ的浓度，观察SCFAs对SAP小鼠全身炎症反应的影响。 6、为了确定SCFAs在SAP恢复过程中的作用，本研究选择了观察SCFAs对两种SAP小鼠模型（单纯雨蛙素模型和Bombesin联合雨蛙素模型）诱导SAP后第三天的胰腺损伤修复的影响。 7、通过HE染色观察SAP小鼠肠道损伤及补充SCFAs后的改变。 8、为了观察SCFAs对SAP小鼠肠道炎症反应的影响，本研究通过免疫荧光技术检测了各组小鼠肠道NLRP3的表达，Westrenblot检测各组小鼠肠道NLRP3、IL-18、caspase-1p20和TLR2的表达，PCR检测各组小鼠肠道NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的相对表达。 9、为了观察SCFAs对SAP小鼠肠道屏障功能影响，本研究通过免疫荧光和Westrenblot的方法检测各组小鼠肠道occludin和claudin-1的表达和检测血清D-乳酸含量分析SCFAs对小鼠肠道通透性的影响。（三）探讨补充短链脂肪酸引起的肠道菌群变化对SAP严重程度的影响 1、为了观察SCFAs对各组小鼠肠道菌群的影响，本研究通过16SrRNA检测了各组小鼠的肠道菌群，分别比较各组小鼠肠道菌群α多样性、β多样性以及差异细菌组成情况。 2、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群在SAP中的作用，本研究通过菌群移植的方法给小鼠移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群，观察各组小鼠胰腺损伤情况、胰腺组织炎症细胞浸润、血清淀粉酶脂肪酶和血清炎症因子水平。我们利用了两种小鼠模型验证这一作用：即普通SPF级小鼠和假无菌小鼠模型。 3、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群在SAP小鼠肠道损伤中的作用，本研究观察了移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群后对SAP小鼠肠道病理的影响，通过免疫荧光和Westrenblot的方法检测了各组小鼠肠道occludin和claudin-1的表达，ELISA方法检测了各组小鼠血清D-乳酸水平，荧光定量PCR的方法检测了各组小鼠肠道炎症因子的相对表达。 4、为了进一步研究补充SCFAs对小鼠肠道菌群的影响，具体影响何种细菌从而发挥保护小鼠肠道功能，减轻小鼠SAP。本研究利用组间比较分析的方法比较了正常对照组和SAP造模组小鼠肠道菌群差异。 5、为了研究假长双歧杆菌在SAP胰腺损伤和胰腺损伤恢复中的作用，本研究分别观察了补充假长双歧杆菌后，各组小鼠24h和3day时间点小鼠胰腺损伤情况和各组小鼠胰腺组织炎症细胞浸润数量。 6、本研究通过检测各组小鼠occludin和claudin-1的表达观察假长双歧杆菌对SAP小鼠肠道屏障损伤的影响。 7、本研究通过检测各组小鼠血清炎症因子水平观察假长双歧杆菌对SAP小鼠全身炎症反应的影响。（四）探究短链脂肪酸影响SAP小鼠肠道屏障功能的可能机制 1、本研究通过RNA-seq的方法分析SAP小鼠小肠组织基因转录水平的变化，以及SCFAs干预对SAP小鼠小肠组织基因转录水平的影响，筛选出转录组差异基因。 2、本研究将正常对照组和SAP组的差异基因集、SAP组和SAP补充SCFAs组的差异基因集分别进行KEGG功能富集分析和通过GSEA分析方法研究相关通路相关基因表达量是否在不同组别具有显著差异。 3、为了验证IL-17信号通路在SAP中的作用以及SCFAs对该通路的影响，本研究首先在肠上皮细胞中验证SCFAs对IL-17A激活的影响，其后通过Westernblot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。 4、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群对IL-17信号通路的作用，本研究通过Westernblot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。 5、为了观察补充假长双歧杆菌对IL-17信号通路的作用，本研究通过Westernblot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。结果：（一）重症急性胰腺炎疾病状态下粪便短链脂肪酸的含量减少 1、收集SAP患者和健康体检人群的粪便，利用GC-MS技术检测两组人群粪便SCFAs含量并进行定量分析。结果发现SAP患者粪便SCFAs与健康人群相比，总酸、乙酸、丙酸和丁酸含量均明显下降。 2、构建了小鼠SAP模型，通过GC-MS技术检测两组小鼠粪便SCFAs含量，结果亦发现SAP小鼠粪便SCFAs总酸、乙酸、丙酸和丁酸较正常小鼠明显下降。（二）短链脂肪酸可以减轻小鼠组织急性胰腺炎 1、比较control组、cer组、SCFAs_cer组、Acetate_cer组、Propionate_cer组和Butyrate_cer组六组小鼠胰腺组织病理发现，混合SCFAs处理组小鼠胰腺炎明显减轻，胰腺水肿、炎症细胞浸润和腺泡细胞坏死均明显减少，乙酸、丙酸和丁酸单独处理组小鼠胰腺炎稍有减轻，但效果不如三种混合处理组明显。 2、Bombesin联合雨蛙素模型和M3/ptf1α小鼠SAP模型结果也证实SCFAs可以减轻小鼠胰腺组织水肿、炎症细胞浸润以及细胞坏死明显减少。 3、ELISA的方法检测了各组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量结果发现单纯SAP造模组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量明显升高，而补充SCFAs组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量明显降低。 4、免疫组化的方法检测了小鼠胰腺MPO（中性粒细胞）和F4/80（巨噬细胞）表达，结果显示，与单纯SAP造模组相比，补充SCFAs组小鼠胰腺组织MPO和F4/80的表达明显减少。 5、通过血清多因子检测技术本研究检测了血清IL-17A、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和INF-γ的血清浓度，结果发现补充与单纯SAP造模组相比，补充SCFAs组小鼠血清IL-17A、IL-1β、TNF-α和INF-γ明显降低，IL-6和IL-10与单纯造模组相比无明显差异。 6、观察SCFAs对两种SAP模型（单纯雨蛙素模型和Bombesin联合雨蛙素模型）中造模后第三天的胰腺损伤修复的影响，结果发现单纯雨蛙素造模SAP小鼠至第三天时，胰腺组织仍可见大面积胰腺组织损伤，正常腺泡组织比较少，但是，补充SCFAs组SAP小鼠至第三天时可见大片正常的胰腺组织。 7、观察不同处理组小鼠的肠道病理发现，单纯雨蛙素造模组小鼠小肠组织较正常对照小鼠比，小肠绒毛变短，部分绒毛顶端缺损，固有层水肿，黏液层变薄，而补充SCFAs后小肠绒毛损伤得到缓解。 8、免疫荧光技术检测了各组小鼠肠道NLRP3的表达发现，雨蛙素造模组小鼠肠道组织胞核和胞质均可见明显的NLRP3表达，补充短链脂肪酸后可以减少SAP小鼠肠道NLRP3的表达；Westernblot结果发现，与正常对照组小鼠相比，小鼠小肠组织蛋白NLRP3、IL-18、caspase-1p20和TLR2的表达在单纯雨蛙素造模组明显上调，而补充SCFAs后这些蛋白的表达均明显下降NLRP3、IL-18、caspase-1p20、TLR2）；PCR检测各组小鼠肠道单纯造模组小鼠肠道组织结果发现NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α较正常对照组明显升高，补充SCFAs组小鼠炎症水平下降，表现为促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显下降，NLRP3炎症小体表达也明显下降，抗炎因子IL-10表达增加。 9、免疫荧光和Westrenblot的方法检测结果发现单纯SAP造模组小鼠肠道claudin-1和occludin蛋白的表达较正常组明显下调，补充SCFAs后可以增加claudin-1和occludin的蛋白表达；检测单纯SAP造模组和补充SCFAs造模组相比，补充SCFAs组血清D-乳酸含量明显下降。（三）补充短链脂肪酸通过影响小鼠肠道菌群减轻小鼠SAP。 1、通过16SrRNA检测了各组小鼠的肠道菌群，结果发现SAP小鼠的Shannon指数和Chao指数较正常对照小鼠低，而SAP小鼠补充SCFAs后肠道菌群的Shannon指数和Chao指数明显增加。继续分析观察各组小鼠肠道菌群的相似性与差异性发现，正常对照组、SAP组和SCFAs_SAP组三组小鼠肠道菌群有明显的分离趋势，说明三组间存在明显的差异;进一步通过LEfSe分析方法去筛选正常对照组与SAP组的肠道菌群差异细菌以及观察补充短链脂肪酸后SAP小鼠差异细菌的变化发现，SAP小鼠Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceae、Streptococcaceae等细菌较正常对照组相对丰度明显降低，而补充SCFAs后可增加SAP小鼠这些细菌的相对丰度。 2、移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群亦可以减轻小鼠胰腺炎，小鼠胰腺水肿、炎症浸润及坏死面积明显减少，血清淀粉酶收起

关键词 : 重症急性胰腺炎短链脂肪酸肠道菌群肠黏膜屏障假长双歧杆菌 IL-17A