中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 李小方中国科学技术大学 2009年硕士导师: 吴家睿共55页

摘要 : p53蛋白参与了细胞周期检查点和DNA修复等多种生命活动中，在维护基因组完整性中发挥重要的作用。多种类型的肿瘤中均发现p53的突变，提示肿瘤细胞体系中DNA损伤检查点的机制可能不同于正常的组织细胞。为探讨在p53失活的肿瘤细胞中DNA甲基化试... 展开

关键词 : 细胞周期 DNA损伤检查点甲磺酸甲酯肿瘤细胞检查点激酶1

2. Chk1和Chk2在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达水平及意义的研究

[学位论文] 刘继敏遵义医科大学 2020年硕士导师: 文飞球共48页

摘要 : 目的：研究急性淋巴细胞白血病（acute lymphocyticleukemia，ALL）患儿初诊时骨髓标本中细胞周期检查点激酶1（checkpoint kinase1，Chk1）和细胞周期检查点激酶2（checkpointkinase2，Chk2）的相对表达水平，分析Chk1和Chk2在儿童ALL中与临床... 展开目的：研究急性淋巴细胞白血病（acute lymphocyticleukemia，ALL）患儿初诊时骨髓标本中细胞周期检查点激酶1（checkpoint kinase1，Chk1）和细胞周期检查点激酶2（checkpointkinase2，Chk2）的相对表达水平，分析Chk1和Chk2在儿童ALL中与临床特征、早期疗效及临床危险度分层等指标的相关性，探讨两者在儿童ALL发病中的临床意义。方法：选取自2017年11月至2019年11月深圳市儿童医院血液肿瘤科收治的ALL患儿83例，其中B-ALL患儿68例，T-ALL患儿15例，同时选取12例免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenic purpura，ITP）作为对照组，采集病例组和对照组患儿的骨髓标本并分离提取白细胞。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的方法分别检测初诊病例组和对照组骨髓标本的Chk1和Chk2mRNA相对表达水平，利用2-ΔΔCt法分析和描述ALL患儿Chk1和Chk2相对表达水平，并对其相对表达水平与临床指标的相关性进行分析研究。结果： 1.Chk1在初诊ALL总体患儿中表达水平为[1.677（0.688，2.502）]，显著高于对照组[0.273（0.159，0.512）]，差异有统计学意义（P＜0.05），但B-ALL与T-ALL患儿之间Chk1表达水平无统计学差异（P＞0.05）。 2.Chk1表达水平在不同临床危险度分层具有统计学差异（P＜0.05），高危组患儿表达水平最高[2.441（1.608，5.502）]，中危组次之[1.953（0.749，2.447）]，低危组最低[0.975（0.205，1.866）]。 3.Chk1表达水平与ALL患儿年龄、初诊骨髓原幼淋巴细胞比例有具有相关性（r值分别为0.243、0.269，P值均＜0.05）。 4.Chk2在初诊ALL总体患儿中表达水平为[1.395（0.746，2.536）]，高于对照组[0.228（0.185，1.416）]，差异有统计学意义（P＜0.05），但B-ALL与T-ALL患儿中Chk2表达水平无统计学差异（P＞0.05）。 5.Chk2与临床危险度分层相关，在高危组患儿表达水平最高[2.727（1.259，3.698）]，中危组次之[1.403（0.744，2.019）]，低危组最低[0.833（0.715，1.948）]，但仅在高危组与低危组、高危组与中危组存在统计学差异（P＜0.05）。 6.ALL患儿中Chk1与Chk2表达水平变化趋势一致，呈正相关关系（r=0.467，P＜0.001）。结论： 1.Chk1、Chk2在儿童ALL中表达水平明显升高。 2.Chk1、Chk2的表达水平与儿童ALL临床危险度分层有关，可能是不良预后的标志物。 3.Chk1、Chk2表达失调可能在儿童ALL的发生发展中发挥作用。收起

关键词 : 儿童患者急性淋巴细胞白血病细胞周期检查点激酶1 细胞周期检查点激酶2 蛋白表达发病机制

3. 低糖环境下糖异生关键酶PCK1缺失促进肝癌细胞增殖的机制研究

[学位论文] 向进 2022年博士导师: 唐霓共233页

摘要 : 背景：原发性肝癌目前在恶性肿瘤中发病率居第六位，死亡率排名第三位。原发性肝癌包括肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌，以及其他罕见类型[1]。HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）或丙... 展开背景：原发性肝癌目前在恶性肿瘤中发病率居第六位，死亡率排名第三位。原发性肝癌包括肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌，以及其他罕见类型[1]。HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）或丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染、摄入黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、超重、2型糖尿病和吸烟等[1]。由于早期HCC往往无症状，HCC患者通常在中期或晚期才被确诊，往往会错过治愈性治疗（肝切除或肝移植）的机会。对于晚期HCC患者，治疗选择包括局部消融、放疗、化疗和分子靶向治疗[2]。其中，多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是最早用于治疗晚期HCC的一线药物。但是激酶抑制剂等分子靶标药物疗效有限，易产生耐药，仅少部分患者获益，索拉非尼仅将患者的总生存期延长2.8个月[3]。由于目前化疗药物的疗效非常有限，因此深入了解肿瘤发生机制和开发新靶点小分子化疗药物迫切需要。众所周知，持续增殖是肿瘤最重要的特征之一[4]。在实体瘤内，无限增殖的肿瘤细胞过度消耗营养物质，肿瘤内部血管形成畸形等因素导致了周围环境营养限制（例如葡萄糖缺乏）[5,6]。因此，为了维持细胞增殖和存活，肿瘤细胞发生代谢重塑以供应能量需求和生物分子合成[7,8]。1920年，德国生物化学家OttoWarburg首次提出，肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也倾向于将葡萄糖转化为乳酸。这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应[9]，其特征是葡萄糖摄取和乳酸产生增强，尽管产生ATP的效率较低，这个过程中产生的代谢中间物可用于合成肿瘤生长所需的生物大分子[9]。作为糖酵解的逆向反应，糖异生是非糖的前体物质（如丙酮酸、乳酸和甘油等）合成葡萄糖或糖原的过程，主要发生在肝脏，对肿瘤生长和代谢重编程也起着重要调控作用[10,11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（Phosphoenolpyruvatecarboxykinase1，PCK1）是糖异生的第一步限速酶，催化草酰乙酸（OAA，Oxaloacetate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，Phosphoenolpyruvate）。已有报道发现，PCK1与肿瘤发生发展密切相关，但是在不同组织来源的肿瘤中发挥着不同的作用。肝癌细胞中PCK1呈现低表达，使用糖皮质激素上调PCK1表达可以抑制HCC细胞增殖[12]。我们课题组前期研究也发现，在低糖条件下，过表达PCK1能够激活AMPK/p27信号通路，阻滞细胞周期G1向S期转换和抑制HCC增殖[13]。然而，在黑色素瘤细胞中过表达PCK1反而促进了糖代谢的逆向流动，增加更多的中间代谢物合成以满足其旺盛的生长需求[14]。PCK1在结肠癌中高表达，能够促进结肠癌的生长[15,16]。上述研究提示，PCK1在糖异生器官（肝脏和肾脏）中表现出抗肿瘤作用，但在非糖异生器官来源的肿瘤中却具有促肿瘤作用。然而，PCK1在不同组织来源肿瘤中的差异表达、生物学功能以及潜在的调控机制尚不明确。氧连接N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，调控蛋白质的稳定性、酶活性、蛋白间相互作用和亚细胞定位等，从而调节各种生物学效应[17]。与磷酸化修饰不同的是，O-GlcNAc糖基化修饰由唯一的O连接N-乙酰葡糖胺转移酶（O-GlcNActransferase，OGT）或O-连接N-乙酰葡糖胺去除酶（O-GlcNAcase，OGA）将N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）连接到（或去除）靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸的羟基上[18]。二磷酸尿苷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）是蛋白质O-GlcNAc修饰的供体底物，来源于己糖胺生物合成途径（Hexosaminebiosyntheticpathway，HBP），由葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰辅酶A和核苷酸合成[19]。O-GlcNAc修饰水平主要决于细胞UDP-GlcNAc的浓度，因此被视作为一种重要的细胞营养感受器[17]。谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰基转移酶（Glutamine-Fructose-6-PhosphateAmidotransferase1,GFAT1）是HBP通路的第一个限速酶和关键调控节点，可将果糖-6-磷酸（F6P）和谷氨酰胺（Glutamine）催化为6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸。据报道，激活AMPK可以磷酸化GFAT1蛋白243位丝氨酸，从而抑制GFAT1酶活性，降低HBP流量和蛋白O-GlcNAc修饰水平[20]。O-GlcNAc修饰在多种类型的肿瘤中增加，并与肿瘤的发生发展密切相关，被视作是肿瘤细胞新的重要特征之一[21]。越来越多癌症相关的蛋白，例如c-Myc、β-Catenin、snail1，被证明存在O-GlcNAc修饰，通过多种机制调控肿瘤的致瘤信号通路，包括：细胞增殖、能量合成、血管生成、组织侵袭和转移、细胞死亡、氧化和代谢应激等[22]。细胞O-GlcNAc修饰的深入研究有助于认识蛋白质翻译后修饰在肿瘤发生发展中的作用，解释肿瘤细胞如何感受营养状态并协调基因表达，进一步加深我们对肿瘤发生机制的理解，为寻找肿瘤诊断和预后相关标志物提供新的线索，并有助于开发新的防治策略。因此，我们提出以下科学问题：葡萄糖缺乏条件下糖异生关键酶PCK1是否通过调控细胞HBP和蛋白O-GlcNAc修饰，进而调控肝癌细胞的增殖？实验方法： 1.观察低糖环境下，干预PCK1表达对肝癌细胞蛋白O-GlcNAc修饰水平的影响。首先在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞系敲除或过表达PCK1，并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12小时，观察不同糖条件下PCK1敲除或过表达后对O-GlcNAc修饰水平和细胞增殖的影响。同时，构建Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。通过荧光定量PCR和WesternBlot实验观察PCK1对HBP代谢和O-GlcNAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的mRNA和蛋白表达水平的影响。另外，在肝癌细胞中过表达PCK1酶失活突变体G309R观察O-GlcNAc修饰水平变化，明确PCK1的代谢酶活性是否在调节O-GlcNAc修饰水平中起着关键作用。 2.检测PCK1敲除细胞内OAA和UDP-GlcNAc水平。采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析技术检测低糖条件下PCK1对TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-GlcNAc和UTP从头合成途径代谢物水平的调控。外源添加OAA、天门冬氨酸（Asp），观察是否影响肝癌细胞UDP-GlcNAc合成、O-GlcNAc修饰水平及细胞增殖。GOT2是催化OAA生成Asp的重要代谢酶，GOT2抑制剂AOA处理PCK1敲除细胞，进一步明确观察是否能阻断此过程，确定PCK1敲除后通过OAA累积促进Asp及UDP-GlcNAc生物合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺，检测m+4OAA和m+3UDP-GlcNAc等代谢物水平变化。 3.观察过表达PCK1能否激活p-AMPK/p-GFAT信号轴。通过WesternBlot实验观察敲除或过表达PCK1对p-AMPK/p-GFAT1信号轴及O-GlcNAc修饰水平变化。AMPK激活剂或敲低基因技术干预p-AMPK/p-GFAT1信号轴确定PCK1抑制GFAT1活性、O-GlcNAc修饰和肝癌细胞增殖是否依赖于p-AMPK。采用靶标代谢物质谱技术检测DON干预p-GFAT1关键酶后PCK1敲除细胞UDP-GlcNAc水平变化。 4.观察PCK1敲除后对CHK2O-GlcNAc修饰水平的影响。为了进一步寻找在PCK1敲除的细胞中哪些重要蛋白发生O-GlcNAc修饰促进肝癌细胞的增殖，我们首先构建了OGT融合Flag标签重组质粒。低糖处理PCK1敲除肝癌细胞，并过表达OGT融合Flag标签蛋白，采用免疫沉淀联合质谱检测靶标结合蛋白。IP-MS富集并筛选出重要的调控周期蛋白Checkpointkinase2（CHK2）。采用Co-IP及IP实验验证CHK2是否与OGT发生相互作用，是否发生O-GlcNAc修饰。采用质谱技术初步鉴定、IP实验确证CHK2O-GlcNAc修饰的重要位点。构建CHK2修饰位点突变质粒验证CHK2发生O-GlcNAc修饰的关键位点。 5.明确CHK2发生O-GlcNAc修饰后其生物学功能的改变。采用泛素化IP实验观察过表达PCK1对CHK2泛素化修饰的影响。蛋白合成抑制剂CHX处理观察发生CHK2O-GlcNAc修饰对其蛋白稳定性的影响。通过Co-IP实验、寡聚体交联和分子动力学模拟实验观察发生CHK2O-GlcNAc修饰对二聚体形成情况的影响。敲除或过表达PCK1、O-GlcNAc修饰调控或外源添加PEP或OAA，进一步观察对CHK2及下游p-CDK2/p-Rb通路激活和肝癌增殖影响情况。进而在PCK1/CHK2双敲除肝癌细胞中恢复野生型CHK2或位点突变CHK2观察下游信号轴和细胞增殖情况。同时，构建裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。 6.在临床肝癌组织样本中分析PCK1与肿瘤大小、O-GlcNAc修饰和p-Rb表达的相关性。临床数据和40对临床原发性肝癌与癌旁组织样本中，我们采用Westernblot蛋白定量分析PCK1表达、O-GlcNAc修饰、CHK2O-GlcNAc修饰。同时分析PCK1表达与肿瘤大小、O-GlcNAc修饰和p-Rb表达的相关性。 7.在DEN/CCl4诱导Pck1肝脏敲除小鼠肿瘤模型中观察干预HBP后肿瘤增殖情况。繁殖筛选出Pck1肝脏特定敲除纯合子小鼠，采用DEN联合CCl4诱导肝癌形成。诱导8个月后观察小鼠DEN诱导肿瘤结节数，通过质谱分析、WesternBlot、sWGA等技术检测UDP-GlcNAc、蛋白O-GlcNAc修饰和CHK2O-GlcNAc修饰水平。观察给予HBP相关抑制剂DON及谷草转氨酶2抑制剂AOA治疗对小鼠肝肿瘤生长的影响。结果： 1.低糖环境下肝癌细胞PCK1敲除后促进蛋白O-GlcNAc修饰水平：在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞中分别敲除或过表达PCK1，并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12h，发现5mM葡萄糖条件下PCK1敲除促进O-GlcNAc修饰和细胞增殖，过表达PCK1结果相反。在Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证了相同结论。进一步发现，PCK1并不能影响HBP和O-GlcNAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的mRNA水平和蛋白表达；有趣的是，过表达PCK1酶失活突变体G309R并不能改变O-GlcNAc修饰，说明PCK1的酶活性可能在调节O-GlcNAc修饰水平中起着关键作用。 2.PCK1敲除后通过增加OAA累积促进UDP-GlcNAc合成：采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析发现低糖条件下PCK1下调TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-GlcNAc以及UTP合成相关代谢。OAA和Asp增加UDP-GlcNAc合成和O-GlcNAc修饰水平及促进肝癌细胞增殖，PCK1敲除细胞给予GOT2（GOT2，催化OAA生成Asp）抑制剂AOA能阻断此过程，说明PCK1敲除后通过OAA累积增加Asp和UDP-GlcNAc合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺分析发现过表达PCK1减少肝癌细胞中OAAm+4、Orotatem+4和UDP-GlcNAcm+3，此验证了上述结论。 3.过表达PCK1通过激活p-AMPK/p-GFAT1信号轴减少UDP-GlcNAc合成和O-GlcNAc修饰水平：过表达PCK1增收起

关键词 : 肝细胞肝癌己糖胺生物合成 O-GlcNAc修饰检查点激酶2

4. 具核梭状杆菌及Chk2在结肠癌中的差异性及与临床病理相关性的研究

[学位论文] 许明政重庆医科大学 2023年硕士导师: 王子卫共52页

摘要 : 研究背景结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是世界上最常见的癌症之一[1]。在恶性肿瘤疾病中，CRC的发病率位于世界第三，死亡率居于世界第二位，其发病机制尚不明确。人体与数以万亿计的微生物和谐共生[2]。人体胃肠道是一个复杂且富含丰富的微... 展开研究背景结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是世界上最常见的癌症之一[1]。在恶性肿瘤疾病中，CRC的发病率位于世界第三，死亡率居于世界第二位，其发病机制尚不明确。人体与数以万亿计的微生物和谐共生[2]。人体胃肠道是一个复杂且富含丰富的微生物群落的系统，其中结肠微生物菌群是胃肠道微生物菌群中密度最大、代谢最活跃的群落[3]，微生物种类的数量和多样性从胃到结肠纵向递增[4,5]，结肠中的含量高达1011个/mL[6]。具核梭状杆菌（fusobacteriumnucleatum,FN）是一种革兰氏阴性厌氧杆菌，多见于口腔疾病如牙周炎，近年来有研究发现其与CRC的发生发展有关，但具体的致癌机制仍未清楚[7,8]。检查点激酶2（checkpointkinase2,Chk2）是一种多功能酶，其功能在诱导细胞周期停滞和细胞凋亡中起中心作用[9]。FadA是牙周病原体FN的一种新的粘附素[10]。E-钙粘素是一种通过β-连环蛋白发挥作用的肿瘤抑制因子。在一个相关研究中也证实了E-钙粘素/β-连环蛋白通路激活参与CRC的发生发展[11]。 FadA与E-钙粘素/β-连环蛋白信号通路的关系已有多项研究。FadA调节E-钙粘素，激活β-连环蛋白信号，导致转录因子、癌基因、Wnt基因和炎症基因表达增加，并促进结直肠癌细胞的生长[12]。在一项小鼠研究中发现，FN中的FadA结合并激活E-cadherin/β-catenin通路，导致Chk2表达增加，从而引起DNA损伤导致CRC的进展[13]。CRC患者肿瘤组织中的菌群与邻近正常组织及不同肠段肿瘤中均存在差异。在一项组间差异性和线性判别分析分析研究中发现，结肠癌和直肠癌患者肠道菌群多样性及丰度有显著的差异，提示不同的菌群可能影响结肠癌和直肠癌的发展进程[14]。本文通过研究FN与Chk2的相关性，验证FN是否有可能通过Chk2影响结肠癌的发展。同时研究FN与Chk2在左右半结肠癌之间是否有差异性及与临床病理特征之间的相关性。方法采用qPCR（RT-PCR）方法检测21例左右半结肠癌组织及左右半结肠配对的正常组织中FN的丰度、Chk2的表达量，分析FN感染与Chk2表达在整体结肠癌之间及左右半结肠癌之间的差异性及相关性。并进一步分别分析FN、Chk2表达与结肠癌患者临床病理特征的关系，实验结果均采用SPSS27.0进行统计处理及分析，检验水准a=0.05，P＜0.05认为差异有统计学意义。结果 1、结肠癌组织及其配对正常组织中均可检测出FN，癌组织中FN的丰度较配对正常组织升高，两者分别为1.557332（0.228749,4.898019）、0.187910（0.087545,1.435664），癌组织中FN的丰度较配对正常组织升高，差异有统计学意义（P=0.038）。结肠癌中FN丰度在女性患者中较男性患者高，两者分别为6.797012（0.981599,36.898054）、3.239707（0.276445,5.402900），差异有统计学意义（P=0.003）。另外结肠癌中FN丰度在中高分化程度较低分化程度高，两者分别为7.481850（3.072668,52.672408）、1.197162（0.192666,10.950774），两者差异有统计学差异（P=0.004）。最后结肠癌组织中FN相对丰度与淋巴结转移与否（P=0.009）显著相关，无淋巴转移为9.289028（1.508428,37.302873）、有淋巴转移为2.793616（0.143692,8.192305）。但结肠癌组织中FN丰度与年龄、肿瘤部位、浸润深度无明显相关（P＞0.05）。 2、结肠癌组织及其配对组织中均有Chk2表达，结肠癌组织Chk2表达比配对正常组织升高，癌组织中Chk2的表达0.924051（0.388095,2.542732）较配对正常组织中Chk2的表达0.770340（0.454918,1.406779）升高，差异有统计学意义（P=0.018）。结肠癌组织Chk2在男性患者中的表达高于女性患者，两者分别为1.964866（1.079748,4.469959）、0.733521（0.293726,4.768989），差异有统计学意义（P=0.014）。另结肠癌组织中Chk2表达在≥65岁患者中较＜65岁患者中高，两者分别为1.237606（0.520273,1.885936）、1.237606（0.520273,1.885936）、0.370579（0.214212,1.118867），差异有统计学意义。最后结肠癌组织中Chk2在淋巴结转移与否显著相关，无淋巴转移3.378669（1.717221,9.297152）、有淋巴转移为0.947640（0.254932,4.900531），差异有统计学意义（P=0.003）。但结肠癌组织中Chk2表达与肿瘤部位、分化程度、浸润深度未见明显相关（P＞0.05）。 3、左、右半结肠癌中FN的丰度表达之间无明显差异，分别为1.965324（0.250943,13.626189）、1.671483（0.311466,5.108199），差异没有统计学意义（P=0.989）；左、右半结肠癌中Chk2的相对表达无明显差异，分别为1.249137（0.411010,2.157947）、0.850172（0.336510,3.395399）,差异无统计学意义（P=0.836）。 4、结肠癌组织中FN的丰度与Chk2表达升高之间存在明显相关性（rSpearman=0.535,P＜0.001）。其中左半结肠癌中FN的丰度与Chk2表达升高之间相关性显著（rSpearman=0.577,P＜0.001），右半结肠癌中FN的丰度与Chk2表达升高之间相关性显著（rSpearman=0.603,P＜0.001）。结论 1、FN在结肠癌组织中呈现高感染负荷现象，提示FN参与了结肠癌的发生发展，并且女性患者中FN感染现象较男性患者高。FN在中高分化程度较低分化程度方面有明显的高感染现象，同时与淋巴结转移呈负相关。提示FN可能在女性结肠癌患者中较男性患者普遍，另外FN在结肠癌的良恶性及侵袭转移过程有重要的影响。 2、Chk2在结肠癌组织中高表达，提示Chk2可能在结肠癌的发生发展中发挥了一定的作用，并且Chk2与结肠癌患者的性别、年龄、淋巴结转移密切相关。Chk2在男性患者中较女性患者中呈现高表达，在≥65岁的患者有更高的表达。提示Chk2可能在≥65岁男性患者中普遍存在，另结肠癌在肿瘤侵袭转移过程发挥一定的作用。 3、FN的感染导致结肠发生在左半、右半结肠癌之间无明显差异；Chk2的高表达影响结肠癌的发生发展在左半、右半结肠癌之间也无明显差异。 4、FN可能通过调节Chk2通路引发结肠癌的发生发展，并对结肠癌的侵袭转移过程有某种影响。这种影响在左半结肠癌及右半结肠癌之间并未表现出差异。收起

关键词 : 结肠癌具核梭状杆菌检查点激酶2 病理相关性临床诊断

5. LKB1在非小细胞肺癌PD-1阻断治疗中的作用研究

[学位论文] 申祥凤吉林大学 2020年博士导师: 许志祥共139页

摘要 : PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的应用显著改善了非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗，已成为NSCLC患者治疗不可或缺的一部分，改变了NSCLC的治疗格局。然而，大多数患者仍不能从中获益，尤其是某些驱动基因突变阳性的患者。已有临床研究证实，肿瘤PD-L1表... 展开 PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的应用显著改善了非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗，已成为NSCLC患者治疗不可或缺的一部分，改变了NSCLC的治疗格局。然而，大多数患者仍不能从中获益，尤其是某些驱动基因突变阳性的患者。已有临床研究证实，肿瘤PD-L1表达水平越高，NSCLC患者越可能从PD-1/PD-L1抑制剂中获益。故肿瘤PD-L1表达可作为评估PD-1/PD-L1抑制剂疗效的预测因子，用于筛选敏感患者。肝激酶B1（LKB1）亦称丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11（STK11），可磷酸化激活14种AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）超家族成员。15%-35%的NSCLC患者存在LKB1突变，后者常与鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）突变共同发生，是NSCLC中常见的驱动基因突变。先前的临床观察发现，KRAS/LKB1共突变的NSCLC患者中PD-L1表达水平低，PD-1/PD-L1抑制剂在该类患者中的疗效差。然而，LKB1是否可直接调控NSCLC中PD-L1的表达及LKB1突变/缺失肿瘤内PD-L1低表达在其抵抗PD-1/PD-L1阻断治疗中的作用尚不清楚。在本研究中，通过癌症基因组数据库（TCGA）和肿瘤组织样本的免疫组织化学染色（IHC）分析了NSCLC患者中PD-L1与LKB1表达的关系。在NSCLC细胞中，通过基因沉默或过表达LKB1明确其对PD-L1表达的调控，并初步探究了其可能的调节机制。在免疫功能正常的C57BL/6小鼠中接种TC-1/shR-Ctrl和TC-1/shR-LKB1细胞，建立同基因型小鼠皮下肿瘤模型，评估LKB1表达完整性在PD-1阻断治疗中的作用；联合应用AMPK激活剂二甲双胍和抗PD-1单克隆抗体，评估该组合疗法在不同LKB1表达状态肿瘤中的治疗作用。我们的研究结果显示，在NSCLC患者中，PD-L1与LKB1的表达呈正相关。沉默LKB1可明显抑制TC-1细胞中AMPK信号的激活，降低p-AMPK和p-ACC的水平，抑制PD-L1mRNA和蛋白的表达。相反，在人肺腺癌细胞A549中过表达LKB1可激活AMPK信号，增加p-AMPK和p-ACC的表达，并促进PD-L1mRNA和蛋白的表达。AMPK激活剂二甲双胍可明显逆转TC-1细胞中LKB1沉默所致的PD-L1表达减少。AMPK抑制剂Compound C则可显著抑制TC-1细胞中PD-L1的表达，并可抑制A549细胞中LKB1过表达所致的PD-L1表达上调，证实AMPK在LKB1引起的PD-L1上调中具有重要作用。有研究报道，LKB1缺失可致细胞内丝氨酸代谢异常，上调甲基供体S-腺苷甲硫氨酸、DNA甲基转移酶DNMTs和细胞内总体DNA甲基化水平。我们的研究发现，LKB1沉默可抑制TC-1细胞中DNMT3A的表达，但对PD-L1启动子甲基化并无明显影响。 NRF2可作为PD-L1的转录因子，增加PD-L1的表达。KRAS/LKB1共突变的肺腺癌常伴随NRF2的负性调控分子——KEAP1基因的异常改变。先前的研究也发现，AMPK可参与调控KEAP1/NRF2信号。因此，研究了KEAP1/NRF2信号途径在LKB1对PD-L1表达调控中的作用。结果显示，沉默LKB1可明显增加TC-1细胞中KEAP1的表达，下调NRF2的表达。过表达LKB1可显著减少A549细胞中KEAP1的表达，增加NRF2的水平。NRF2激活剂富马甲酸二甲酯DMF可上调LKB1沉默TC-1细胞中PD-L1mRNA的水平，而NRF2抑制剂ML385预处理则可显著抑制A549细胞中LKB1过表达所致的PD-L1mRNA表达上调。总之，我们的研究证实LKB1/AMPK及KEAP1/NRF2信号途径可参与调控NSCLC中PD-L1的表达。动物实验结果显示，抗PD-1单克隆抗体作为单药治疗，可显著抑制LKB1正常表达肿瘤的生长，但对LKB1沉默/缺失肿瘤的生长没有抑制作用，表明LKB1表达完整性对PD-1阻断治疗发挥抗肿瘤作用至关重要。AMPK激活剂二甲双胍可明显激活肿瘤内的AMPK信号，上调PD-L1的表达。联合应用二甲双胍和抗PD-1单克隆抗体可有效抑制LKB1正常表达肿瘤的生长，而对LKB1沉默/缺失肿瘤的生长无明显作用。进一步的研究发现，与LKB1正常表达的肿瘤相比，LKB1沉默/缺失肿瘤中招募T淋巴细胞和树突状细胞（DCs）的趋化因子CCL5和CXCL12的表达降低，而招募中性粒细胞的趋化因子CXCL5的表达明显上调，CXCL7的表达也有所增加。且在二甲双胍单药治疗或与抗PD-1单克隆抗体联合治疗的小鼠肿瘤中亦如此，提示二甲双胍并未改善LKB1沉默/缺失肿瘤的免疫抑制性微环境，LKB1沉默/缺失肿瘤的免疫抑制性微环境可能在其抵抗二甲双胍和/或抗PD-1单克隆抗体治疗中亦发挥作用。总之，我们的研究结果表明，NSCLC患者中，PD-L1的表达与LKB1正相关。LKB1可通过AMPK和KEAP1/NRF2信号上调NSCLC细胞中PD-L1的表达。AMPK激活剂二甲双胍可增强抗PD-1单克隆抗体对LKB1正常表达肿瘤生长的抑制作用，但对LKB1沉默/缺失肿瘤没有作用。联合应用二甲双胍和抗PD-1单克隆抗体或可作为LKB1正常NSCLC的治疗策略。收起

关键词 : 非小细胞肺癌阻断治疗免疫检查点抑制剂肝激酶B1 免疫机制

6. Chk1和p53在肿瘤细胞S期DNA损伤检查点中的复杂关系研究

[学位论文] 马晓宇中国科学技术大学 2012年博士导师: 吴家睿共114页

摘要 : Chk1激酶是哺乳动物细胞周期中S期DNA损伤检查点的主要调控蛋白，能够因DNA链的断裂而激活，进而对磷酸脂酶Cdc25A等周期调控蛋白进行磷酸化，使其通过泛肽-蛋白酶途径降解，导致细胞周期进程的停滞。P53是肿瘤抑制因子，已有的研究揭示，它在S期DNA损... 展开 Chk1激酶是哺乳动物细胞周期中S期DNA损伤检查点的主要调控蛋白，能够因DNA链的断裂而激活，进而对磷酸脂酶Cdc25A等周期调控蛋白进行磷酸化，使其通过泛肽-蛋白酶途径降解，导致细胞周期进程的停滞。P53是肿瘤抑制因子，已有的研究揭示，它在S期DNA损伤检查点的活动过程中也发挥着重要的作用。但是，目前并不是很清楚Chk1和p53二者在这个过程中是如何进行分工和协调？在本项研究中，我们对Chk1和p53在S期DNA损伤检查点的作用关系进行了深入的探讨。我们选择了HeLa细胞作为研究体系。HeLa细胞感染了HPV18病毒，而病毒的E6蛋白能够与p53结合并导致p53的降解，使HeLa细胞的p53通路不能被正常激活。我们使用E6 siRNA对HeLa细胞的HPV18 E6基因进行抑制，使得p53的表达水平和功能得到了很好的恢复。同时我们将E6 siRNA技术与细胞同步化相结合，得到了S期p53功能恢复的HeLa细胞，为后续的研究奠定了基础。我们的研究结果显示，在用DNA损伤药物MMS处理的S期HeLa细胞中，如果用Chk1抑制剂UCN-01抑制了Chk1的磷酸化，在p53功能缺失的情况下将上调G2/M期的关键周期蛋白cyclinB1表达，进而导致相当比例的异常有丝分裂期细胞的出现。但是，在18E6 siRNA转染而恢复了p53功能的S期HeLa细胞中，同样的处理条件下，cyclinB1蛋白水平的上调被抑制，说明p53阻止了DNA损伤的S期HeLa细胞由于Chk1的失活而导致的周期蛋白Cyclin B1的重新积累。同时，在Chk1失活情况下，恢复功能的p53抑制了MMS阻滞的Hela细胞中异常有丝分裂期比例的增加，但是却提高了凋亡比例，说明在DNA损伤所致的S期阻滞细胞中，当Chk1的功能被抑制时，p53可以在S期DNA损伤检查点中起到协助作用，通过诱导凋亡的方式以阻止细胞进入异常的有丝分裂。然而，恢复了p53功能的S期HeLa细胞，在MMS单独处理使得Chk1激活的条件下却没有发生caspase-3的激活，也没有出现明显的细胞凋亡。如果在这些MMS处理的细胞中同时采用UCN-01抑制Chk1的活性，将导致caspase-3的激活，并形成明显的细胞凋亡。有趣的是，MMS的处理会导致p53功能恢复的HeLa细胞的凋亡因子Bax的基因表达水平和蛋白质水平的显著上调，并且这种上调不依赖于Chk1的活性。这些结果说明激活的Chk1能够抑制p53诱导的caspase-3依赖的细胞凋亡过程，但是并没有抑制p53介导的Bax的上调。进一步研究结果显示，在p53功能恢复的HeLa细胞中，在MMS单独处理使得Chk1激活的条件下Bcl-2蛋白水平没有明显的下调，而且抗凋亡因子MAP的蛋白水平出现明显的上调;同时细胞色素c从线粒体中的释放则受到了明显的抑制。这些结果说明，激活的Chk1通过维持Bcl-2和XIAP这两个抗凋亡蛋白的高水平而抑制了MMS损伤下p53诱导的Bax促凋亡效应以及caspase-3的激活，从而阻止了细胞凋亡的发生。综上所述，我们的工作揭示了Chk1激酶和p53在肿瘤细胞周期DNA损伤检查点中应对DNA损伤反应中的复杂关系。无论是在p53功能缺失还是p53功能被恢复的HeLa细胞中，Chk1激酶都是负责S期DNA损伤检查点工作的重要检查点蛋白。在DNA损伤发生时，Chk1可以通过诱导细胞周期阻滞来阻止异常有丝分裂，同时通过抑制p53诱导的细胞凋亡来维持细胞的活力。一旦Chk1的活性被抑制，激活的p53可以起到协助的作用，通过诱导caspase-3依赖的细胞凋亡过程以防止细胞进行异常的有丝分裂。这些研究为发展治疗肿瘤的药物研发和防治策略提供了新的思路。收起

关键词 : Chk1激酶肿瘤细胞 DNA损伤检查点肿瘤抑制因子药物研发防治策略

7. EZH2通过激活CHEK1转录促进卵巢癌干细胞对顺铂耐药的研究

[学位论文] 侯亚亚华中科技大学 2018年硕士导师: 王泽华共77页

摘要 : 目的：课题组前期研究发现组蛋白甲基转移酶EZH2(enhancer of zeste homolog2)在维持卵巢癌细胞干性中起重要作用，且EZH2高表达与卵巢癌干细胞顺铂耐药相关；用PCR芯片筛选发现细胞周期检查点激酶CHEK1(checkpoint kinase1)可能是EZH2相关下游... 展开目的：课题组前期研究发现组蛋白甲基转移酶EZH2(enhancer of zeste homolog2)在维持卵巢癌细胞干性中起重要作用，且EZH2高表达与卵巢癌干细胞顺铂耐药相关；用PCR芯片筛选发现细胞周期检查点激酶CHEK1(checkpoint kinase1)可能是EZH2相关下游基因。本研究旨在探讨EZH2是否通过激活CHEK1促进卵巢癌干细胞的顺铂耐药。方法： 1.在SKOV3细胞株中采用过表达质粒瞬时上调EZH2的表达。在前期通过动物皮下瘤化疗结合体外成球建立的SKOV3干细胞模型SK3rd中，采用慢病毒CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)构建稳定下调EZH2的细胞株SK3rd-sgEZH2。 2.蛋白免疫印迹实验和qRT-PCR实验检测EZH2表达质粒和CRISPR/Cas9转染后EZH2及CHEK1的表达变化。 3.在SKOV3和A2780中采用过表达质粒瞬时上调EZH2的表达，或者采用siRNA(Small interfering RNA)干扰技术瞬时下调EZH2的表达，双荧光素酶报告实验检测EZH2表达水平对CHEK1启动子区转录活性的影响。 4.染色质免疫共沉淀实验验证EZH2与CHEK1启动子区的直接结合。 5.在SK3rd-sgEZH2细胞中，转染CHEK1过表达质粒（SK3rd-sgEZH2/CHEK1），蛋白免疫印迹实验验证转染效果。 6.采用无血清悬浮培养法检测细胞球形体（sphere）的形成能力。 7.蛋白免疫印迹实验检测顺铂作用后，细胞DNA损伤标记物yH2AX、CHEK1磷酸化水平及其下游分子p-CDC25C蛋白水平的变化。 8.流式细胞术检测细胞周期的分布。 9.流式细胞术检测顺铂诱导的细胞凋亡。 10.MTT实验和克隆形成实验检测细胞对顺铂的化疗反应性。 11.采用SK3rd细胞接种于裸鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。成瘤后裸鼠随机分为四组，每组6只，分别为单用顺铂+溶剂对照组、顺铂+DZNEP（EZH2抑制剂）组、顺铂+AZD7762（CHEK1抑制剂）组和顺铂+DZNEP+AZD7762组（三药联用组）。腹腔注射给药4个周期，隔天记录老鼠体重，测量瘤径。 12.免疫组织化学染色检测以上四组SK3rd移植瘤中EZH2、p-CHEK1、细胞增殖标记物Ki67、凋亡蛋白Cleaved-caspase3和DNA损伤标记物γH2AX的水平。结果： 1.在SKOV3中上调EZH2后，CHEK1的蛋白水平及mRNA水平均增加；而在SK3rd中下调EZH2后，CHEK1的蛋白水平及mRNA水平均降低。 2.双荧光素酶报告实验结果显示：在SKOV3和A2780中上调EZH2，CHEK1启动子区的转录活性增加；下调EZH2后，CHEK1转录活性降低。 3.染色质免疫共沉淀结果显示：在SKOV3和A2780中，EZH2能直接与CHEK1启动子区转录起始位点TSS附近的区域（-301bp~-106bp和+129bp~+316bp）结合。 4.蛋白免疫印迹实验验证转染效果：与SK3rd相比，SK3rd-sgEZH2细胞的EZH2和CHEK1的蛋白水平均显著降低；SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞的EZH2水平显著降低，而CHEK1的表达较SK3rd稍有升高。 5.悬浮3D培养结果显示，与SK3rd相比，SK3rd-sgEZH2细胞的sphere成球能力显著降低；而与SK3rd-sgEZH2/NC相比，SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞的sphere成球能力增加。 6.蛋白免疫印迹实验结果显示：顺铂作用下，SK3rd细胞中CHEK1的磷酸化水平及其下游p-CDC25C的表达显著增加，DNA损伤标记物yH2AX则稍有增加，DNA损伤应答作用显著增强。与SK3rd相比，在Sk3rd中敲除EZH2，DNA损伤应答作用被抑制；而在SK3rd-sgEZH2中上调CHEK1可完全逆转EZH2敲除引起的DNA损伤应答抑制作用。 7.流式细胞术结果显示：顺铂作用下，SK3rd细胞中G1期细胞比例显著降低，而S期及G2/M期细胞比例显著升高，细胞周期阻滞作用显著增强。与SK3rd相比，SK3rd-sgEZH2细胞的周期阻滞作用被抑制。而在SK3rd-sgEZH2中上调CHEK1可完全逆转EZH2敲除引起的细胞周期阻滞抑制作用。 8.流式细胞术结果显示：在未给铂药处理的SK3rd细胞中，单独敲除EZH2以及敲除EZH2同时上调CHEK1均不影响细胞凋亡；在顺铂处理后，与SK3rd相比，SK3rd-sgEZH2细胞的凋亡率增加，而上调CHEK1可完全逆转敲除EZH2的促凋亡作用。 9.MTT实验和克隆形成实验结果显示：与SK3rd相比，SK3rd-sgEZH2细胞对顺铂的耐药性显著降低；而上调CHEK1之后的SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞对顺铂的耐药性又恢复到接近SK3rd的水平。 10.皮下移植瘤裸鼠实验结果显示：与单用顺铂相比，顺铂+DZNEP、顺铂+AZD7762、三药联用组移植瘤体积分别下降了26%（P=0.25）、47%（P=0.057）、81%（P＜0.001），移植瘤重量分别下降了33%（P=0.34）、49%（P=0.045）、72%（P＜0.001）。 11.动物移植瘤免疫组织化学实验结果显示：DZNEP和AZD7762可分别有效抑制移植瘤EZH2及p-CHEK1水平；与单用顺铂组相比，顺铂+DZNEP组、顺铂+AZD7762组、三药联用组中Ki67的表达依次降低，而Cleaved-caspase3和yH2AX的表达水平则依次增加。结论：我们的研究结果表明EZH2通过与CHEK1的启动子区直接结合，激活其转录，进而促进卵巢癌干细胞对顺铂的耐药性。而通过抑制EZH2及CHEK1的功能能够增加卵巢癌干细胞对顺铂化疗的敏感性，为卵巢癌的治疗提供新的思路。收起

关键词 : 卵巢癌组蛋白甲基转移酶2 细胞周期检查点激酶1 耐药性

8. Chk1介导的CCNB1高表达在结直肠癌中的作用及机制研究

[学位论文] 方益锋浙江大学 2016年博士导师: 蔡秀军共118页

摘要 : 结直肠癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率及病死率在女性恶性肿瘤中高居第二位、男性中高居第三位，仅次于肺癌和乳腺癌。每年全球结直肠癌新发病例超过136万，死亡病例约69万。在我国，其发病率随着人民生活水平的提高、饮食结构向高... 展开结直肠癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率及病死率在女性恶性肿瘤中高居第二位、男性中高居第三位，仅次于肺癌和乳腺癌。每年全球结直肠癌新发病例超过136万，死亡病例约69万。在我国，其发病率随着人民生活水平的提高、饮食结构向高脂高蛋白低纤维素方向变化而逐年上升，结直肠癌已成为我国近30年来发病率增长最快的恶性肿瘤。随着近年来医学水平的不断进步，人们对于结直肠癌的治疗水平也有了长足的发展，目前关于结直肠癌发生发展及浸润、扩散、转移机制研究方兴未艾。结直肠癌的发生发展是一个极复杂的过程，不仅与环境、饮食及生活习惯等各种外在因素有关，其内在更是一个多阶段、多步骤、多基因参与的复杂过程。尽管在结直肠癌的发生发展过程中有大量的分子事件被发现，这些分子事件在这一过程中发挥着至关重要的作用，但这些分子事件在肿瘤发生发展过程中的具体作用尚未完全清楚。细胞周期素B1(CCNB1)是细胞周期蛋白家族中一个重要的成员，是细胞G2/M检测点有关的重要细胞周期调控因子。它的一个重要角色就是调节细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)并与之形成复合体后使底物磷酸化，启动细胞从G1/S期进入G2/M期，并促进有丝分裂。越来越多的证据表明CCNB1参与了细胞周期检测点的控制，它的功能障碍是肿瘤发生中的早期事件，在人类许多肿瘤中可以观察到其失调控表达，包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌等。同时，有证据表明抑制CCNB1的表达可以使乳腺癌细胞对化疗更加敏感。此外，研究表明在肿瘤细胞中野生型P53通过SP1转录因子抑制CCNB1的转录表达。在结直肠癌细胞株HCT116 p53+/+细胞中CCNB1的蛋白水平呈低表达，而在HCT116 p53-/-细胞中呈高表达。这些研究表明CCNB1在肿瘤发展中潜在的关键作用，然而，CCNB1在结直肠癌中的具体功能机制尚未可知。大部分癌症被认为高度依赖于细胞周期检查点激酶1(Chk1)的异常表达，并且CCNB1在以前是被作为预测Chk1抑制剂的疗效的生物标记物。目前对于CCNB1和Chk1各自在肿瘤中的表达机理及临床意义的研究较多，但对二者在结直肠癌中是否存在相关性以及二者通过何种途径共同影响结直肠癌的发生、发展方面的研究仍不清楚。本研究通过检测CCNB1、Chk1在结直肠癌和正常结直肠组织标本中的表达情况、分析其相关性，并通过体外细胞功能实验验证Chk1是CCNB1的正向调控因子，同时结合体内外实验深入探索CCNB1对结直肠癌细胞生物学行为的影响，探讨其发挥生物学效应的具体作用机制。本研究旨在揭示结直肠癌发生发展的新机制，并为探寻结直肠癌防治新策略提供坚实可靠的实验证据和理论支持。第一部分 CCNB1在结直肠癌中的表达及功能研究目的: 验证CCNB1在结直肠癌组织中表达升高，明确CCNB1对结直肠癌细胞增殖、周期、凋亡等生物学行为的影响。方法: 收集结直肠癌组织和癌旁正常组织标本，采用实时荧光定量PCR(quantitativereal-time RT-PCR，qRT-PCR)法检测30对结直肠癌组织及癌旁正常组织的CCNB1mRNA和蛋白的表达水平。分别选取P53-wild HCT116、P53-mutant SW480和P53-null HCT116细胞株作为实验对象，利用细胞转染技术分别转染CCNB1特异性siRNA或阴性对照siRNA，并采用MTT法检测肿瘤细胞的增殖能力、PI单染检测细胞周期分布、Annexin-Ⅴ联合PI法检测细胞凋亡、western blot检测CCNB1调控的下游周期蛋白及凋亡蛋白表达。结果: 1.CCNB1在结直肠癌组织中的表达较癌旁正常组织显著升高。 2.在结直肠癌细胞株P53-wild HCT116、SW480和P53-null HCT116中，抑制CCNB1的表达均能能抑制肿瘤细胞的增殖，并能通过调节细胞周期相关分子CDK1/CDC25C促使细胞周期发生G2/M期阻滞。 3.在P53-wild HCT116细胞中抑制CCNB1表达能够通过调节p53/Bax通路促使肿瘤细胞发生早期凋亡，而在P53-null HCT116细胞中抑制CCNB1表达也能通过非p53途径促进肿瘤细胞发生早期凋亡。结论: 1.CCNB1在结直肠癌组织中表达显著升高。 2.下调CCNB1的表达可抑制结直肠癌细胞增殖、诱导细胞周期G2/M期阻滞和促进肿瘤细胞凋亡，提示CCNB1在结直肠癌发生过程中发挥致癌作用。第二部分结直肠癌CCNB1高表达依赖-细胞周期检查点激酶1(Chk1)的表达目的: 确定Chk1是CCNB1的上游调控分子，揭示Chk1在结直肠癌中的作用机制。方法: 首先，分别在结直肠癌组织和癌旁正常组织中用qRT-PCR法检测Chk1 mRNA的表达水平，western blot法检测Chk1的蛋白表达水平，分析与CCNB1的组织相关性。其次，利用siRNA特异性干扰结直肠癌细胞中Chk1的表达，western blot检测CCNB1的蛋白表达，MTT法检测肿瘤细胞的增殖能力，明确Chk1在结直肠癌中的作用和对CCNB1的调控作用。结果: 1.Chk1在结直肠癌组织中的表达水平均较癌旁正常组织明显增高，并与CCNB1表达水平呈显著正相关。 2.干扰结直肠癌细胞Chk1的表达可抑制CCNB1的蛋白水平，细胞增殖能力受阻。结论: Chk1在结直肠癌中靶向调控CCNB1的表达，提示Chk1是CCNB1的上游调控分子。第三部分慢病毒介导的CCNB1 shRNA对结直肠癌裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究目的: 明确持续抑制CCNB1表达对裸鼠移植瘤生长的调控作用。方法: 首先构建含特异性靶向CCNB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体，将慢病毒分别转导HCT116和SW480细胞株，通过抗生素筛选后得到各自的CCNB1稳定低表达细胞株，western blot法检测CCNB1的表达水平以明确稳筛效率。将上述稳转细胞株及相对应的慢病毒空载体转导的对照组细胞株分别接种于裸鼠皮下，观察成瘤及移植瘤生长情况，免疫组织化学染色方法检测移植瘤中CCNB1的表达，western blot检测移植瘤中与CCNB1的下游分子，包括CDC25C、CDK1、p53和Bax的表达。结果: 1.抑制CCNB1的表达可抑制裸鼠移植瘤的生长速度。 2.在移植瘤中抑制CCNB1表达能够抑制CCNB1下游细胞周期相关蛋白CDC25C和CDK1的表达下降，在HCT116移植瘤中也能下调下游凋亡相关蛋白p53和Bax的表达。结论: 裸鼠体内成瘤实验发现抑制CCNB1可抑制结直肠癌移植瘤的生长，并与体外研究一致。收起

关键词 : 结直肠癌发病机制细胞周期素B1 细胞周期检查点激酶1 蛋白表达

9. 肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究

[学位论文] 卢珍中国科学院大学 2020年博士导师: 陈有海；万晓春共105页

摘要 : 癌症是世界范围内危害人类健康的主要死亡因素。虽然目前以程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1(programmed cell death protein-1/programmed death ligand-1，PD-1/PD-L1)通路阻断为代表的免疫检查点阻断疗法在临床上已经取得了令人惊喜的效果，然而... 展开癌症是世界范围内危害人类健康的主要死亡因素。虽然目前以程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1(programmed cell death protein-1/programmed death ligand-1，PD-1/PD-L1)通路阻断为代表的免疫检查点阻断疗法在临床上已经取得了令人惊喜的效果，然而，只有一部分肿瘤患者对该疗法有响应。因此，对抗肿瘤免疫的调控机制进行深入的研究、进一步提高患者对肿瘤免疫疗法的应答，具有重要的社会意义。自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)是机体抗肿瘤免疫监视的重要组成部分。研究发现，肿瘤中NK细胞的浸润与患者良好的预后成正相关，并能增强机体对免疫检查点阻断疗法的应答。目前，基于NK细胞的肿瘤免疫疗法已经在恶性肿瘤的临床试验中显示出良好的效果。此外，越来越多的研究表明，肿瘤微环境代谢可能是影响抗肿瘤免疫反应和免疫治疗疗效的重要因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是细胞能量代谢的感受器，在肿瘤微环境等代谢压力的诱导下可被激活，通过触发代谢重编程调控细胞的生存。AMPK已经被证明在肿瘤发展中发挥环境依赖性作用，既具有抑制肿瘤生长的作用，也能够促进肿瘤的发展。然而，肿瘤AMPK在机体抗肿瘤免疫监视以及免疫检查点阻断疗法中的作用，目前尚不清楚。本研究对肿瘤AMPK活化对NK细胞介导的肿瘤免疫监视和PD-L1阻断疗法的影响进行了研究。首先构建了anti-PD-L1应答的肿瘤模型和anti-PD-L1不应答的肿瘤模型，通过分析肿瘤组织的蛋白表达，发现，AMPK的活化水平在anti-PD-L1应答的肿瘤中显著升高、而在anti-PD-L1不应答的肿瘤中没有差异。使用药物抑制AMPK活化显著削弱PD-L1阻断疗法的治疗效果。这说明，肿瘤AMPK活化对于PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有重要作用。同时，也验证了NK细胞在PD-L1阻断治疗中的作用。为了研究AMPK活化和NK细胞这两种对PD-L1阻断治疗具有重要作用的因素之间的相互关系，使用AMPK的激活剂—二甲双胍，也是临床治疗2型糖尿病的一线药物，来诱导AMPK活化。结果显示，二甲双胍诱导的AMPK活化以NK细胞依赖的方式显著抑制小鼠肿瘤的生长。在体外，二甲双胍诱导的AMPK活化可以促进肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性。另外，通过构建肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)过表达的细胞系来诱导AMPK活化，进一步确认了AMPK活化对NK细胞抗肿瘤免疫的促进作用。转录组学分析结果显示，AMPK活化显著促进了模式识别受体通路相关基因的富集，并伴随着有益趋化因子基因表达的上调，这与黑色素瘤患者更高的生存率相关。进一步的机制研究表明，AMPK活化可能通过诱导错误折叠蛋白的过度积累，从而使肿瘤细胞更容易被NK细胞杀伤。更重要的是，我们的研究发现，不管是二甲双胍还是LKB1过表达诱导的AMPK活化与PD-L1阻断抗体联用时，表现出明显的协同抑制肿瘤生长的作用。综上所述，本研究首次发现细胞能量感受器AMPK的活化对PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有关键作用。AMPK活化通过促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫发挥抑制肿瘤生长的作用，并能协同增强PD-L1阻断疗法的治疗效果。这些结果提示，在临床治疗中增强肿瘤AMPK的活化具有提高肿瘤免疫治疗疗效的潜力。收起

关键词 : 恶性肿瘤免疫检查点阻断疗法腺苷酸活化蛋白激酶自然杀伤细胞抗肿瘤机制

10. MLCK在下咽癌FaDu上皮细胞和肠上皮细胞的作用及机制研究

[学位论文] 熊垒安徽医科大学 2023年硕士导师: 左莉共70页

摘要 : 目的：本研究旨在探讨肌球蛋白轻链激酶（Myosinlightchainkinase，MLCK）在下咽癌FaDu细胞和小鼠肠上皮细胞的分子机制。方法：（1）构建MLCK基因敲除的下咽癌FaDu细胞株，分为对照组，MLCKKO1组和MLCKKO2组；采用RT-qPCR和Westernblot方法检测... 展开目的：本研究旨在探讨肌球蛋白轻链激酶（Myosinlightchainkinase，MLCK）在下咽癌FaDu细胞和小鼠肠上皮细胞的分子机制。方法：（1）构建MLCK基因敲除的下咽癌FaDu细胞株，分为对照组，MLCKKO1组和MLCKKO2组；采用RT-qPCR和Westernblot方法检测敲除效率；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；Tunel染色、Cleavedcaspase-3免疫荧光检测细胞凋亡；Westernblot检测凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的变化；划痕实验和transwell迁移实验检测细胞迁移。（2）建立动物模型：7只小鼠随机分配为两组，对照组3只，实验组4只。模型组每3天腹腔各注射250μg的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4,CTLA-4）和程序性死亡-配体1（programmedcelldeath1ligand,PD-L1）抗体,每天测量小鼠体重并对其进行临床评分，给药12天后取小鼠回肠进行相关实验。RT-qPCR实验检测细胞因子；免疫荧光检测CD8阳性细胞的变化；Tunel染色和Cleavedcaspase-3免疫荧光染色检测细胞凋亡；Ki67免疫荧光染色检测细胞增殖；免疫荧光染色检测免疫检查点阻断（immunecheckpointblockade，ICB）处理对紧密连接相关蛋白Claudin-2、闭锁小带蛋白1（ZonulaOccludens-1,ZO-1）以及磷酸化的肌球蛋白轻链（phosphorylatedmyosinlightchain,p-MLC）和钠/葡萄糖协同转运蛋白1（sodium/glucosecotransporter1,SGLT1）的影响。结果：（1）在下咽癌FaDu细胞中敲除MLCK基因，Tunel染色以及Cleavedcaspase-3免疫荧光阳性细胞数增加；流式细胞术检测细胞周期无明显变化，细胞凋亡比例增加；Westernblot检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和Cleavedcaspase-3/Caspase-3比例增加；MLCK敲除后，紧密连接蛋白Occludin表达增加，用siRNA沉默Occludin后，Caspase-3以及Cleavedcaspase-3表达降低；自噬相关蛋白ATG5、Beclin-1和LC3B-Ⅱ表达增加，P62表达减少；划痕实验和transwell实验检测细胞迁移速率均减慢。（2）小鼠经过ICB处理12天后，小鼠体重和临床评分无明显变化；RT-qPCR检测细胞因子发现IL-6和IL-22表达降低，Ifng表达增加；免疫荧光检测发现CD8阳性细胞表达增加；Tunel染色和Cleavedcaspase-3免疫荧光阳性细胞比例增加，Ki67免疫荧光阳性细胞比例减少；紧密连接蛋白Claudin-2表达增加，ZO-1表达减少，p-MLC表达增加；SGLT1表达增加。结论：在下咽癌FaDu细胞中，MLCK敲除诱导细胞凋亡，其可能是通过上调紧密连接蛋白Occludin调控的，Occludin表达增加可增加Caspase-3表达，继而诱发细胞凋亡，沉默Occludin后可能会减少细胞凋亡。此外，MLCK敲除会诱导细胞自噬，抑制细胞迁移，其具体机制需进一步研究。小鼠经过ICB处理后，其回肠上皮细胞也发生凋亡，并产生了炎症反应。其肠道通透性也发生了相应的变化，可能与MLCK的表达和磷酸化底物p-MLC相关。收起

关键词 : 下咽癌肌球蛋白轻链激酶紧密连接蛋白细胞凋亡免疫检查点阻断