中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. Periostin通过激活Wnt/β-catenin通路促进髓核细胞凋亡加重椎间盘退变

[学位论文] 朱大学兰州大学 2022年硕士导师: 康学文共78页

摘要 : 背景：椎间盘退行性变（Intervertebraldiscdegeneration，IVDD）通常与脊柱退行性疾病的发生密切相关，它不仅给人们带来严重的并发症如残疾、疼痛，同时也给个人和社会带来了严重的经济负担。Periostin（POSTN）作为一种细胞外基质蛋白，已被证实在... 展开背景：椎间盘退行性变（Intervertebraldiscdegeneration，IVDD）通常与脊柱退行性疾病的发生密切相关，它不仅给人们带来严重的并发症如残疾、疼痛，同时也给个人和社会带来了严重的经济负担。Periostin（POSTN）作为一种细胞外基质蛋白，已被证实在椎间盘细胞中表达，并且其与椎间盘退变密切相关。目的：探讨了POSTN促进大鼠髓核细胞（Nucleuspulposuscells，NPCs）凋亡的机制。方法：根据椎间盘退行性变患者术前脊柱磁共振成像（MRI）影像学结果对病人椎间盘（Intervertebraldisc，IVD）进行Pffirmann分级，在手术中收集PffirmannⅡ级（轻度退变），Ⅲ级（中度退变）和Ⅴ级（重度退变）的IVD组织标本（n=8）。苏木精-伊红（Hamp;E）染色、番红-O/固绿染色和甲苯胺蓝染色来进一步确认髓核（Nucleuspulposus，NP）组织样本的退变等级，并通过蛋白免疫印迹实验（westernblotting）和免疫组织化学检测不同退变等级的NP组织中POSTN、β-catenin和cleaved-caspase-3（C-caspase3）的表达水平。此外，通过建立动物和细胞退变模型进一步研究POSTN、β-catenin和C-caspase3的表达差异。在体外实验中，通过向正常的大鼠NPCs的培养基中添加不同浓度的重组POSTN（rPOSTN；1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml），以及在相同浓度的rPOSTN（5μg/ml）下与细胞作用不同时间（24h，48h，72h），探究rPOSTN对正常的大鼠NPCs中Wnt/β-catenin通路活性和凋亡的影响。另外，在大鼠退变NPCs中，通过慢病毒转染的方式抑制POSTN基因的表达，更进一步探究POSTN对Wnt/β-catenin通路和细胞凋亡的影响。对于POSTN介导大鼠NPCs凋亡的具体机制，在rPOSTN和Wnt/β-catenin通路抑制剂预处理后，检测各组间相关蛋白表达和细胞凋亡率的差异。最后，我们通过大鼠活体实验来进一步验证细胞实验的结果。Westernblotting、细胞免疫荧光和免疫组织化学技术用来检测各组间蛋白表达水平，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组中mRNA的表达，TUNEL检测和APCAnnexinV/7-ADD双染流式细胞术用来评估各组间细胞凋亡情况。结果：Westernblotting和免疫组织化学检测结果显示，在中度和重度退变的人体IVD中POSTN、C-caspase3和β-catenin的蛋白表水平达更高，与IVDD的Pffirmann分级呈正相关。在RT-qPCR检测的结果中也证实了POSTN和β-catenin的mRNA表达水平在严重退变的IVD中表达更高。此外，这一结论在动物和细胞退变模型中也得到了验证。在细胞实验中，随着rPOSTN干预浓度和时间的增加，细胞中Wnt3a、β-catenin、C-caspase3、caspase9和Bax的表达逐渐增加，与rPOSTN呈时间-剂量依赖性，而Bcl-2的表达则与之相反。TUNEL检测和APCAnnexinV/7-ADD双染流式细胞术的结果也显示了其细胞凋亡率与rPOSTN呈时间-剂量依赖关系。当POSTN基因被抑制时，在衰老退变的NPCs中Wnt/β-catenin通路活性和细胞凋亡率降低。有趣的是，当向POSTN基因抑制的细胞中添加rPOSTN时，其Wnt/β-catenin通路活性和细胞凋亡率重新增加。此外，我们发现抑制Wnt/β-catenin通路可部分缓解rPOSTN介导的大鼠NPCs凋亡。最后，在大鼠活体实验中，我们也进一步证实了抑制POSTN的表达可以改善穿刺诱导的IVDD。结论：总之，我们的研究表明POSTN在IVDD中表达升高，可通过激活Wnt/β-catenin通路促进大鼠NPCs凋亡加剧IVDD。收起

关键词 : 椎间盘退变细胞凋亡髓核细胞凋亡

2. 提高肝移植供肝质量的实验研究

[学位论文] 孙备北京协和医学院(中国医学科学院) 1999年博士导师: 姜洪池共76页

摘要 : 该课题探索具有改善肝脏能量代谢及抗氧自由基损伤作用的药物(H、Y、D),将其用于供肝保存,以期提高供肝保存效果.研究人员研制出HYD供肝保存液,即集UW液、HTK液及祖国医学优点于一身.采用大鼠肝脏非循环离体灌注模型(IPRL),观察HYD液对鼠肝6,12,24,30... 展开

关键词 : 细胞凋亡

3. 华蟾素对人胆管癌细胞系QBC939抑制作用的实验研究

[学位论文] 刘玮山西医科大学 2007年硕士导师: 陈筠共30页

摘要 : 目的：探讨华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939的抑制作用及可能的作用机制。方法： MTT法检测华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939增殖的影响，流式细胞仪检测华蟾素对QBC939细胞凋亡的作用，RT-PCR法研究华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939 Fas及caspase-3 mR... 展开

关键词 : 华蟾素胆管癌细胞凋亡 QBC939细胞凋亡

4. GM1对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的作用

[学位论文] 张桂林南方医科大学 2000年硕士导师: 傅万海共60页

摘要 : 目的:该课题研究新生大鼠HI后脑细胞凋亡情况及其进展、观察CM1对HI新生大鼠的治疗作用及其对凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达的影响.结论:新生大鼠HI后半小时即可见细胞凋亡,24小时明显,并随时间发展而增多,48-72小时达高峰,在相当长的一段时间内仍可... 展开

关键词 : 脑损伤细胞凋亡缺氧缺血细胞凋亡脑细胞

5. 急性乐果中毒大鼠膈肌细胞凋亡的研究

[学位论文] 曹玉萍河北医科大学 2008年硕士导师: 田英平;苏建玲共54页

摘要 : 目的:急性有机磷农药中毒(acute organophosphomspesticides poisoning，AOPP)的主要致死原因是呼吸衰竭，而以呼吸肌麻痹为特征的外周性呼吸衰竭占有重要地位。探讨AOPP后呼吸肌麻痹发生机制，寻求合理有效的治疗方法，具有重要的现实意义。膈肌是最... 展开目的:急性有机磷农药中毒(acute organophosphomspesticides poisoning，AOPP)的主要致死原因是呼吸衰竭，而以呼吸肌麻痹为特征的外周性呼吸衰竭占有重要地位。探讨AOPP后呼吸肌麻痹发生机制，寻求合理有效的治疗方法，具有重要的现实意义。膈肌是最主要的呼吸肌，又是对有机磷最敏感的横纹肌，有机磷中毒是否存在膈肌细胞凋亡及其在呼吸肌麻痹中的作用、其机制如何均少见报道。另外，多年来一直认为乐果中毒应用复能剂无效，近年来临床上提出了不同的观点。其具体疗效如何、作用机制怎样均有待于进一步研究。本实验通过观察急性乐果中毒大鼠临床表现、膈肌细胞凋亡百分比、膈肌细胞凋亡基因bax、bcl2的表达及其二者的比值变化(bax/bcl2)，进一步探讨膈肌细胞凋亡在有机磷中毒呼吸肌麻痹中的作用；并通过观察不同剂量氯磷定和/或抗胆碱能药物对其影响，了解氯磷定在急性乐果中毒中的治疗作用及其机制，为急性乐果中毒应用复能剂提供实验依据，进一步完善急性有机磷农药中毒的救治方案。方法：本实验随机将150只SD大鼠随机分为5组：正常对照组(A组)36只、未治疗组(B组)6只、单用阿托品组(C组)36只、小剂量氯磷定+阿托品组(D组)36只、大剂量氯磷定+阿可托品组(E组)36只，除对照组外均给予，胃内灌注2LD50(640mg/kg)的乐果，制备有机磷中毒模型。对照组给予生理盐水灌胃观察，未治疗组观察其临床变化及转归情况。参与治疗的3组大鼠给予大、小不同剂量的氯磷定+阿托品或单用阿托品治疗，阿托品用法一致，染毒后3分钟给予阿托品10mg/kg肌注，此后据其流涎，流泪等毒蕈碱样症状酌情追加给药。氯磷定用法：小剂量氯磷定组首剂10mg/kg与阿托品一同肌注，然后于2h、4h、6h分别给予5mg/kg肌注；大剂量组为首剂突击量20mg/kg肌注，此后10mg/kg肌注q1h 3次、q2h 3次、q3h至24h、q4h至48h、q6h至4d。观察各组中毒大鼠临床表现：流涎、流泪、呼吸、肌颤、肌力等，了解不同治疗情况下中毒大鼠病情变化特点及其规律。于染毒后未治疗组待大鼠死亡，对照组、各治疗组于染毒后1d、2d、4d、8d、10d、12d断头处死大鼠，分别取膈肌，提取膈肌单细胞悬液，用流式细胞仪的方法观察不同治疗情况下各组中毒大鼠不同时间膈肌细胞凋亡百分比，凋亡基因bax、bcl2的表达、bax/bcl2的变化规律以及药物治疗对其的影响。结果：1、临床表现：在乐果染毒后未治疗组大鼠很快出现流涎、全身波浪状肌颤、呼吸困难、抽搐，最后因呼吸衰竭而于9.29±8.55h死亡；阿托品治疗可很好地改善染毒大鼠流涎、眼分泌物增多等症状，呼吸困难、肌颤、肌无力等症状均延迟出现，且持续时间缩短，可挽救大部分中毒大鼠生命；给予氯磷定+阿托品治疗组大鼠与单用阿托品治疗组相比，呼吸困难，全身肌颤，抽搐，肌无力等症状出现相对较晚，且程度轻，症状消失快，差异显著(p＜0.05)。在同时间点大量氯磷定治疗组大鼠比小剂量氯磷定组症状轻、恢复快，疗效优于后者，差异显著(p＜0.05)。 2、流式细胞仪DNA倍体分析：(1)不同治疗组大鼠(C、D、E组)染毒后2-12天膈肌细胞凋亡百分比均高于正常对照组(A组)，有显著性差异(p＜0.01)，且存在一定变化趋势：不同治疗组(C、D、E组)膈肌细胞凋亡百分比随时间逐渐升高，至8天达高峰，随后下降。其中C组膈肌细胞凋亡百分比均高于D、E组，染毒后10-12天差异更显著(p＜0.01)；染毒后10-12天D组与E组膈肌细胞凋亡百分比有显著性差异(p＜0.05)。 3、凋亡基因表达：(1)染毒后不同治疗组大鼠(C、D、E组)膈肌细胞凋亡基因bax表达不同程度的升高。其中C组凋亡基因bax表达较正常对照组(A组)升高有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)，至4天达高峰，随后下降，染毒后12天接近正常；染毒后4-8天D组膈肌细胞凋亡基因bax表达较正常对照组(A组)升高，有显著性差异(p＜0.01.或p＜0.05)，染毒后10天下降接近正常；染毒后8天E组膈肌细胞凋亡基因bax表达较正常对照组(A组)升高有显著性差异(p＜0.05)，染毒后10天下降接近正常。C组较D、E组凋亡基因bax表达升高，有显著差异(p＜0.05)；同时间点E组凋亡基因bax表达较D组表达有降低趋势，但无统计学差异(p＞0.05)。(2)凋亡基因bcl2表达：各组间无统计学差异(p＞0.05)。(3)染毒后不同治疗组大鼠(C、D、E组)凋亡基因bax/bcl2比值不同程度的升高。其中C组凋亡基因bax/bcl2较正常对照组(A组)升高有显著性差异(p＜0.05)，至4天达高峰，随后下降；染毒后2天D组凋亡基因bax/bcl2有一定升高，有显著性差异(p＜0.05)，随后下降； C组较D、E组凋亡基因bax/bcl2升高有显著差异(p＜0.05)；而同时间点E组bax/bcl2较D组有降低趋势，但无显著差异(p＞0.05)。结论：1.急性乐果中毒大鼠存在膈肌细胞凋亡，而其变化趋势与临床上呼吸肌麻痹出现和恢复时间相似，故可能是导致呼吸肌麻痹原因之一。2.有机磷农药中毒可能通过诱导凋亡基因bax高表达及提高凋亡基因bax/bcl2比值而诱导膈肌细胞调亡。3.阿托品治疗可以改善中毒大鼠的临床表现，可以对抗OPs对呼吸中枢的抑制作用，改善呼吸困难，并能挽救大部分中毒大鼠的生命。4.氯磷定对急性乐果中毒切实有效，且可能通过抑制凋亡基因bax表达及降低凋亡基因bax/ocl2，从而减少膈肌细胞凋亡，保护膈肌，防治呼吸肌麻痹。收起

关键词 : 乐果中毒膈肌细胞凋亡农药中毒细胞凋亡

6. 细胞凋亡的多级分子调控机制

[学位论文] 姚展中国科学技术大学 2008年博士导师: 吴缅共118页

摘要 : 细胞凋亡，是细胞生命终结的重要方式。过多的细胞凋亡和正常水平的凋亡过程的抑制都会导致疾病的发生甚至危及生命。因此，细胞凋亡的发生是受到严密的控制的。从细胞接收到凋亡信号刺激到信号逐级的传递都如同预先设定好的程序一样进行，而这一程序... 展开细胞凋亡，是细胞生命终结的重要方式。过多的细胞凋亡和正常水平的凋亡过程的抑制都会导致疾病的发生甚至危及生命。因此，细胞凋亡的发生是受到严密的控制的。从细胞接收到凋亡信号刺激到信号逐级的传递都如同预先设定好的程序一样进行，而这一程序就写在细胞的基因组之中。因为这一调控方式如同生命的其他特征一样是代代相传的，即使在因为长期进化而产生的不同物种之间这一作用途径也具有显著的保守性。从某种意义上讲，细胞凋亡的通路是通过一系列RNA和蛋白质的合成和加工而实现的。因为在正常情况下，导致细胞凋亡的分子在细胞中是处在低水平和低活性状态的，而抑制细胞凋亡的分子则起主导作用，而在凋亡刺激信号的作用下，这种平衡关系则会被逆转。而导致这一逆转的过程又受到包括转录调控、RNA加工、蛋白质翻译调控、蛋白质翻译后修饰以及蛋白质降解等多种途径的调控，而这里的研究工作就是为了揭示细胞捌亡中的这些多级调控是如何协同作用而决定细胞的命运。首先，我们鉴定了细胞凋亡的上游信号分子Caspase-8/Mch5上位于两个Death Effector Domain(DED)结构域之间的一个新的自身切割位点，当细胞接收到凋亡信号的刺激时，Caspase-8能通过自身的剪切激活而对该位点进行切割，从而释放出Caspase-8/Mch5蛋白氨基端的肽段DEDa；该活性多肽分子能通过与细胞核．质穿梭蛋白ERK结合而被转运到细胞核内，并通过与p53结合蛋白TOPORS发生相互作用而影响转录因子p53的转录活性，最终引发Caspase-8基因自身的上调。该发现揭示了caspase-8的自身放大正反馈的转录调控途径，为研究细胞凋亡过程中信号网络调控提供了一个新的机制。同时，上面的工作也提示了细胞核仁在细胞凋亡调控中可能扮演重要角色。通过对细胞核仁中的重要蛋白B23在核仁压力刺激下的动态分布的研究，我们发现，核糖体RNA转录抑制导致的核仁解体会导致B23在细胞质中与hnRNP-U/Al结合。尽管这一结合本身受到特异的结合hnRNP-U的mRNA调控，它同时也会通过调控RNA的加工水平，而影响细胞对核仁压力的响应，而且这一作用机制中hnRNPA1参与的miRNA-18a加工也起着重要作用。降低B23的表达水平或者通过过量表达抑制结合的RNA抑制其与hnRNP-U/A1的结合，都会导致细胞对于Actinomycin引起的核仁压力更加敏感而趋向凋亡。同时这-机制对于细胞周期的调控也有重要作用，抑制B23与hnRNP-U/Al将导致细胞更加难以从细胞周期检验点的持续中逃逸而发生细胞凋亡。姚展最后，我们也尝试通过抗药细胞株的筛选，寻找到一些参与抗药机制的基因。通过对HeLa细胞使用紫杉醇进行筛选，我们成功的分离了一个抗紫杉醇的细胞株，该细胞株对于紫杉醇引起的周期阻断和细胞凋亡都极不敏感，利用microarray对该细胞株的基因表达谱的分析，促使我们发现并鉴定了一个在该细胞株中高表达的抗紫杉醇基因TXR-3，对于其作用机制的研究还在进行之中。收起

关键词 : 细胞凋亡多级

7. Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡的信号转导机制

[学位论文] 王玉中国医科大学 2008年博士导师: 孙黎光共84页

摘要 : 目的： Fas也称Apo-1或CD95，是肿瘤坏死因子(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)家族的一个代表，在生理和病理的凋亡过程中广泛涉及，如肿瘤监视、免疫功能、爆发性肝炎和神经再生等。Fas曾经在抗癌治疗中被使用，然而在治疗应用上Fas受到很大限制，... 展开目的： Fas也称Apo-1或CD95，是肿瘤坏死因子(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)家族的一个代表，在生理和病理的凋亡过程中广泛涉及，如肿瘤监视、免疫功能、爆发性肝炎和神经再生等。Fas曾经在抗癌治疗中被使用，然而在治疗应用上Fas受到很大限制，这是由于它的毒性和激活NF-kB家族转录因子，NF-kB易引起炎症和抗凋亡的作用。在体外，为了克服这些问题，特殊的NF-kB抑制剂、转录和蛋白合成抑制剂放线菌素D被应用，通过放线菌素D(actinomycin D，AD)处理细胞，使对Fas抗体介导的凋亡不敏感的细胞株变得敏感，这是由于放线菌素D能激活细胞内信号，在诱导凋亡过程中提供了与Fas协同的共刺激信号，从而促进细胞凋亡。凋亡或程序性死亡在胚胎形成和发展中是重要的现象，它维持着机体的自我平衡。对于敏感细胞，当Fas受体与Fas配体或可溶性Fas抗体相结合时，Fas受体三聚化作用导致细胞凋亡．对于Fas抗体诱导细胞凋亡的分子机制已经进行了初步的研究，在Fas-AD诱导的细胞凋亡过程中可以激发多个信号途径，其中以caspase蛋白激酶执行细胞有秩序的死亡而闻名。在哺乳动物细胞，凋亡是以依赖线粒体途径和非依赖线粒体途径两条途径促进细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在调节线粒体凋亡途径中起到一个中心作用。Bcl-2家族蛋白的作用位点主要在线粒体膜上，能刺激线粒体细胞色素C的释放，细胞色素C与Apaf-1一起激活caspase-9，easpase-9激活easpase-3随之导致凋亡。对于非依赖线粒体途径：主要通过死亡受体(FaLs associated death domain，FADD)作用激活easpase-8，进而激活下游的easpase-3，从而引起细胞凋亡。Caspase-8除了直接激活caspase-3外，还可以通过内质网通路间接激活caspase-3。在两个途径中，最后步骤涉及到依靠大量的多蛋白复合体caspase从钝化的形式变为激活形式，一旦激活，caspase断裂各种底物导致细胞死亡，在此过程中caspase-8是顶端的caspase，对于启动Fas诱导的凋亡是非常重要的。在caspase亚家族中，对于理解凋亡，caspase-3由于其易变底物的特殊性而尤其重要。 RB肿瘤抑制蛋白在通过G1/S调控点调节细胞周期中起主导作用，参与细胞周期的调节。通常认为失活的RB在G1/S临界点通过磷酸化释放E2F转录因子诱导细胞周期基因表达，加速S期进入引起细胞增殖。RB还有很多其他的细胞功能，包括介导分化的信号，在有丝分裂过程中调节染色体分离，维持基因的完整性。扰乱这些RB功能的途径能潜在的引起增殖的增高或基因的不稳定导致肿瘤的发生。有丝分裂原蛋白激酶已经被暗示是凋亡的上游信号，包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5亚家族。在哺乳动物细胞，它们是由不同的外界刺激物(如紫外线和渗透性刺激等)调节的独立模型，通过传导不同信号导致细胞的增殖、分化和凋亡。在死亡受体诱导凋亡的过程中，这个途径的作用还不太清楚，可能依靠特殊的死亡受体和细胞类型。目前，关于Fas-AD诱导Bel-7402肿瘤细胞凋亡的过程中，P38MAPK与caspase-8是否一起参与，P38MAPK与caspase家族之间的关系，以及P38MAPK、caspase与Bcl-2、Rb的关系还不清楚，本研究利用Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡，通过P38MAPK抑制剂SB203580及caspase-8抑制剂Ac-IEFD-cho的作用，来确定P38MAPK、caspase-8、caspase-3及Bcl-2、RB的关系，进一步揭示Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡的信号转导机制。方法： 1、通过MTT法检测Fas-AD作用后的Bel-7402细胞活力，浓度下的不同作用时间点检测。 2、通过倒置显微镜、电子显微镜和流式细胞仪检测在Fas抗体不同Fas、Fas-AD、SB203580(P38MAPK 特异性抑制剂)及Ac-IEFD-cho(caspase-8特异性抑制剂)对Bel-7402细胞凋亡的影响。 3、通过Western-blot法、RT-PCR法检测Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho对培养的Bel-7402细胞的P38MAPK、caspase-8、caspase-3的激活作用，对FasR、Bcl-2、RB表达的影响及其可能的信号转导通路。 4、利用激光共聚焦显微镜通过免役荧光法检测Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho作用后P38MAPK与caspase-3的细胞内定位。 5、通过免疫沉淀法确定P38MAPK与caspase-3的作用关系，caspase-3与RB的作用关系及其可能的信号转导通路。结果： 1、Fas-AD能明显抑制Bel-7402细胞增殖，且随Fas抗体浓度及其作用时间呈依赖关系。 2、Fas-AD能明显诱导Bel-7402细胞凋亡，SB203580和Ac-IEFD-cho能明显抑制Fas-AD诱导的细胞凋亡。倒置显微镜下观察显示，Fas-AD作用24 h后能明显地诱导Bel-7402细胞凋亡，细胞质出现大量空泡，核仁的数量减少，死亡细胞较多。SB203580和Ac-IEFD-cho分别单独作用时能改善这种现象，死亡细胞相对较少；当两个抑制剂共同作用时能明显改善这种现象，细胞质出现微量小泡，核仁较多。电子显微镜下观察显示，Fas-AD作用24 h后，Bel-7402细胞出现典型的凋亡特征，细胞体积变小，胞质浓缩，胞浆内空泡增多，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，出现凋亡小体。SB203580组和Ac-IEFD-cho组可见细胞膜相结构完整，胞浆内空泡相对减少，染色质边缘聚集，线粒体肿胀。SB203580和Ac-IEFD-cho共同作用组，未出现明显的凋亡特征，胞浆可见少量小泡。 Annexin-V FITC/PI双标流式细胞术分析显示：Fas-AD作用24 h后，与对照组比较Fas-AD组能明显诱导Bel-7402细胞凋亡，凋亡率为50.55±3.25％，SB203580和Ac-IEFD-cho单独或共同作用都能明显的抑制Fas-AD诱导的凋亡。 3、Fas-AD能明显诱导Bel-7402细胞FasR表达。 Westem-bolt结果显示，Fas-AD诱导培养的Bel-7402细胞的FasR表达，并且FasR随Fas抗体浓度呈剂量依赖性增加，但当Fas抗体浓度为10 μM时，FasR表达增加量减缓。 4、P38MAPK与caspase-8参与Fas-AD凋亡途径，并且相互调节。 P38MAPK抑制剂SB203580和caspase-8抑制Ac-IEFD-cho阻碍FaS-AD诱导凋亡的作用明显显示，P38MAPK和caspase-8在Fas-AD诱导的凋亡中起重要作用。 5、在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中，通过抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho的作用发现P38MAPK和caspase-8调节Bcl-2、Rb的表达，P38MAPK和caspase-8能明显地降低BCl-2的表达，增加RB的表达。 6、P38MAPK和caspase-8调节caspase-3的表达。 Western-blot结果显示，Fas-AD诱导caspase-3表达并发生断裂激活，并且断裂片段表达随Fas抗体浓度增加呈剂量依赖性增加，而抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho能明显地抑制其表达和激活。 7、当Fas-AD作用Bel-7402细胞24 h时，在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中P38MAPK与caspase-3从细胞质转位到细胞核形成P38MAPK/caspase-3复合体，而抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho能明显地抑制他们的转位。 8、当Fas-AD作用Bel-7402细胞48 h时，caspase-3与RB相互作用并形成caspase-3/RB复合体。结论： 1、Fas-AD抑制Bel-7402细胞增殖，诱导Bel-7402细胞凋亡。 2、Fas-AID经P38MAPK、caspase-8信号通路诱导Bel-7402细胞凋亡。 3、在Fas-AID诱导Bel-7402细胞凋亡过程中，P38MAPK与caspase-8相互调节，不仅从蛋白总量而且还从激活(磷酸化形式或断裂形式)的表达上相互影响，再有从mRNA水平也相互调节。 4、Fas-AD通过激活P38MAPK、caspase-8从而引起caspase-3的激活，作用下游底物Bcl-2、RB调节其表达。 5、在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中，P38MAPK与easpase-3从细胞质转位到细胞核，短暂作用形成P38MAPK/easpase-3复合体，调节caspase-3的表达，当P38MAPK/caspase-3复合体分离后，easpase-3与RB形成复合体进而调节RB的表达，从而引起细胞凋亡。收起

关键词 : 诱导细胞凋亡

8. H<,2>O<,2>对仔猪支持细胞凋亡的影响及机制研究

[学位论文] 王满意西南大学 2008年硕士导师: 张家骅共53页

摘要 : Sertoli细胞在精子生成过程中具有十分重要的作用，其数量对于成年动物的精子生成量具有决定性意义，而且所有针对睾丸的毒物均将Sertoli细胞作为第一个作用对象。大量的研究表明，许多针对睾丸的药物其作用与氧化应激有密切关系。本研究以培养的仔猪... 展开 Sertoli细胞在精子生成过程中具有十分重要的作用，其数量对于成年动物的精子生成量具有决定性意义，而且所有针对睾丸的毒物均将Sertoli细胞作为第一个作用对象。大量的研究表明，许多针对睾丸的药物其作用与氧化应激有密切关系。本研究以培养的仔猪睾丸支持细胞为研究对象，利用H2O2模拟机体的氧化应激条件，研究了H2O2对Sertoli细胞凋亡的影响及可能机制，通过本研究为进一步认识精子生成过程中微环境稳定的调节机制，人工调控精子的发生奠定理论基础；而且也有利于阐明各种氧化应激引起Sertoli细胞受损,导致雄性不育疾病的发病机理，为治疗这类疾病提供新的思路。为了建立氧化应激引起体外培养Sertoli细胞的凋亡模型，本实验首先研究了不同浓度的H2O2对细胞活性的影响，结果发现随H2O2浓度的增加，Sertoli细胞呈现萎缩状，触角减少，折光性变弱，细胞的脂滴减少等明显变化，细胞的成活率明显下降。为了证明这一变化与H2O2作用的关系，本实验也检测了H2O2对Sertoli细胞内ROS水平的影响，结果发现随着H2O2浓度不断增大，Sertoli细胞的ROS水平也呈上升趋势，通过DHE染色发现超氧阴离子的水平在0-800μmol/LH2O2组逐渐上升，进一步证明了H2O2对细胞内ROS的影响。本实验还发现H2O2处理不同时间，在0～24h内，随着作用时间的延长，细胞活率呈下降趋势，48h时细胞活率与24h相比无明显变化。因此，在后面的实验中，H2O2作用浓度为600μmol/LH2O2，作用时间为24h。在研究H2O2对Sertoli细胞凋亡的影响时，光镜下发现细胞间隙不规则，密度分布不均匀的，折光性弱,出现空泡样变性，触角减少；电镜检查发现细胞连接消失，细胞膜皱缩，线粒体肿胀，形成凋亡小体等，表现出明显的凋亡特征。为了进一步研究H2O2对Sertoli细胞凋亡的影响，本实验也检测了Caspase3活性的变化，发现高浓度H2O2使活化的Caspase3表达量显著上升，这表明，H2O2通过Caspase3依赖性途径诱导了Sertoli细胞凋亡。为了进一步确定H2O2对Sertoli细胞凋亡的影响，本实验也检测了H2O2对Sertoli细胞分泌功能的影响，结果发现，H2O2使转铁蛋白表达量显著下降，这也表明H2O2在诱导细胞凋亡的同时，也降低了细胞的分泌的功能。为了研究H2O2诱导Sertoli细胞凋亡的机制，本实验还检测了H2O2对Sertoli细胞抗氧化能力的影响，结果发现H2O2使多种抗氧化物质如SOD、GSH、CAT等水平显著下降，因此，H2O2降低Sertoli细胞的抗氧化能力是引起细胞凋亡的重要原因。由于大量的研究表明，ROS诱导细胞凋亡可能与MAPK有关，本实验也检测了H2O2作用后Sertoli细胞内ERK1/2和P38的磷酸化的变化，结果发现ERK1/2和P38都被不同程度的激活，说明ERK1/2和P38参与了H2O2诱导Sertoli细胞凋亡。综上所述，本实验可以得到如下结论：(1)随着H2O2作用浓度的升高，Sertoli细胞内ROS水平显著升高，细胞内抗氧化能力下降，细胞活力显著下降，凋亡率显著上升。(2)H2O2使Sertoli细胞间隙不规则，密度分别不均，折光性减弱，呈现萎缩状，触角减少等结构变化，以及出现凋亡小体，胞质紧实，细胞器集中，核膜皱缩，特征的新月形核，线粒体肿胀，线粒体内嵴模糊等超微结构变化，同时降低了Sertoli细胞的分泌能力。(3)H2O2通过Casepase3依赖性途径诱导Sertoli细胞的凋亡，ERK和P38参与了H2O2诱导的Sertoli细胞凋亡。收起

关键词 : 仔猪细胞凋亡

9. H<,2>O<,2>诱导PC12细胞凋亡中miR-122a及N-myc表达变化

[学位论文] 陈鹏业中山大学 2008年硕士导师: 李朝晖共41页

摘要 : 颅脑损伤是法医实际工作中常见的损伤，其致死率、致残率很高，一直是医学研究的重点和难点。研究表明，脑缺血再灌注可诱发神经细胞损伤，研究证实脑缺血后选择性迟发性神经元死亡的主要形式是凋亡。脑缺血再灌注损伤后引起能量衰竭和酸中毒，产生大... 展开颅脑损伤是法医实际工作中常见的损伤，其致死率、致残率很高，一直是医学研究的重点和难点。研究表明，脑缺血再灌注可诱发神经细胞损伤，研究证实脑缺血后选择性迟发性神经元死亡的主要形式是凋亡。脑缺血再灌注损伤后引起能量衰竭和酸中毒，产生大量的自由基、兴奋性氨基酸，磷脂代谢异常、积聚，并引起离子自稳机制破坏，导致细胞内钙超载，最终引起某些原癌基因的表达，诱导凋亡的发生。微小RNA(microRNA)是一种长度约为18～25nt的非编码RNA，这些miRNA可以通过与特定mRNA结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因表达。目前人类基因组中已确认的有几百个，可能参与30％人类蛋白质的表达调控，从而在机体的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢过程中发挥着重要调节作用。先前表明，过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞凋亡后，基因芯片检测miR-122a表达明显下调，提示此凋亡过程中可能存在miR-122a的调节。本实验在此基础上，以H2O2诱导PC12细胞损伤作为神经细胞氧化应激损伤的模型，通过实时荧光定量PCR检测miR-122a表达，westen blot检测其调控蛋白N-myc表达，探讨miR-122a在凋亡过程中的作用，有望为脑缺血再灌注损伤中神经元凋亡机制提供新的研究思路。目的: 探讨miR-122a、N-myc蛋白在H2O2诱导PC12细胞凋亡中的作用及机制，为脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制和治疗的研究提供理论依据和新的研究思路。方法: 1.细胞培养及处理以0浓度组作为对照，分别用30nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理PC12细胞12h。 2.流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡率收集已处理好的50ml培养瓶中细胞，1000r／min离心5min，弃去培养液，5ml PBS洗2次，离心，去PBS，加入70％乙醇固定24h，流式细胞仪检测细胞凋亡率。 3.实时荧光定量PCR技术检测miR-122a表达分别提取0浓度H2O2对照组和30、50、100、200、300、400nmol／L的H2O2处理组PC12细胞的总RNA和小RNA，使用样品miR-122a合成cDNA，进行实时定量PCR反应检测miR-122a表达。 4.westen blot检测N-myc蛋白表达分别提取0浓度H2O2对照组和30、50、100、200、300、400nmol／L的H2O2处理组PC12细胞的总蛋白，westen blot检测N-myc蛋白表达。结果: 1.流式细胞术分析细胞凋亡率 0、30nmol／L、50nmol／L、100nmo1／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理的PC12细胞凋亡率分别为1．2％、1．5％、9．8％、21．8％、37.9％, 36．3％。 2.实时定量PCR技术检测miR-122a表达结果 30、50、100 nmol／L H2O2处理组miR-122a表达较对照组分别增加11％、22％、16％；200、300、400 nmol／L H2O2处理组miR-122a表达较对照组明显减少，分别为37％／、32％／、34％。 3.N-myc蛋白表达 30、50、100nmol／L H2O2处理组与对照组比较，N-myc表达与对照组比较无显著性差异；200、300、400nmol／L H2O2处理12h后，N-myc表达与对照组比较显著增加。结论: miR-122a在不同浓度的过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞凋亡中，具有双重作用；N-myc蛋百表达增加可能成为衡量H2O2诱导PC12细胞损伤严重程度的一个指标。通过对miR-122a功能的探讨，为脑缺血再灌注损伤中神经元凋亡机制提供新的研究思路。收起

关键词 : 诱导细胞凋亡

10. As<,2>O<,3>和/或TGF-β1诱导NB4细胞凋亡P27<'Kip1>、cyclinE、TGF-β1的变化及其意义

[学位论文] 梁颖中国医科大学 2007年硕士导师: 李艳共37页

摘要 : 急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。NB4细胞为APL细胞株，具有急性早幼粒细胞白血病的形态学特征和生物学特性... 展开急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。NB4细胞为APL细胞株，具有急性早幼粒细胞白血病的形态学特征和生物学特性。抑癌基因P27kipl作为细胞周期的负调控因子，是一种多功CDKI(cyclin dependent kinase inhibitor)，可通过与cyclinE-CDK2复合物结合而抑制其活性，阻止细胞进入S期，使细胞停滞于G1期。癌基因cyclinE作为细胞周期正调控因子，也被证实是细胞进入S期的关键性调节基因。本实验研究了AS2O3和/或TGF-β1作用于NB4细胞后的细胞周期分布情况、凋亡情况、P27kipl、cyclinE、TGF-β1水平的变化，希望能为阐明白血病的发病机制及寻找更好的治疗策略和揭示临床预后提供一些线索。实验方法： 1、MTT法检测As2O3对NB4细胞的细胞毒性及IC50。将8×104/ml细胞0.1ml接种于96孔板。加入AS2O30.1ml，浓度分别为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L。放入培养箱中培养24h、48h、72h后取出，每孔加入20μl MTT继续培养4h、取出后离心1000rpm 10min，扣板，每孔再加入150μl DMSO震荡后酶标仪570nm检测各孔吸光度，以空白对照孔为零，绘制NB4细胞生长抑制曲线，取得IC50。抑制百分率=(实验孔吸收值/对照孔吸收值)×100。 2、AS2O3和/或TGF-β1处理NB4细胞以含10％胎牛血清RPMI1640培养液，37℃、5％CO2条件下培养NB4细胞，取对数生长期的细胞，显微镜下计数，调整NB4细胞浓度为5×105/ml，以5μmol/L AS2O3 和/或5ng/ml TGF-βl处理，于不同时间搜集细胞。 3、台盼蓝拒染实验检测细胞生长抑制率分别于培养的24、48、72小时搜集5μmol/L．As2O3 和/或5ng/ml TGF-βl处理的NB4细胞及对照组细胞，取一滴细胞悬液，加入两滴2％台盼蓝，2分钟后显微镜下记数活细胞百分率。 4、瑞氏-吉姆萨染色观察凋亡形态学的变化取5μmol/L AS2O3和/或5ng/ml TGF-βl处理48小时的NB4细胞，用细胞涂片离心机制成涂片，加一滴瑞氏工作液染色1分钟，再加一滴吉姆萨工作液染色15分钟后流水冲洗自然风干，光镜下观察细胞的凋亡情况。 5、流式细胞术检测细胞周期和凋亡将各种药物处理的不同作用时间的NB4细胞搜集至离心管中，1000r/min离心5分钟，洗涤两次，加入80％乙醇1ml，4℃冰箱中过夜。1000r/min离心5分钟，洗去固定液，加入PI染液，4℃避光染色30分钟后流式细胞仪(FACS Calibur，BD，美国，细胞周期分析软件为ModFit LT3.0)进行测试。记录激发波长488nm处的红色荧光。 6、半定量RT-PCR检测P27Kipl、cyclinE及内源性TGF-β1的mRNA水平 (1)细胞总RNA提取及半定量收集细胞于灭菌的1.5ml 塑料离心管中，用Trizol法提取RNA。用DEPC处理高压消毒的双蒸水6-15ul溶解RNA沉淀。取1μl溶解的RNA加入79μl DEPC处理高压消毒的双蒸水中，测量260、280 OD值。紫外分光光度计定量，取2.0≥OD260／OD280≥1.8的RNA，将其浓度稀释为3μg/μl。 (2)RT-PCR逆转录体系为RNA 3μl、5×Buffer 4μl、dH2O 8μl、dNTP 2μ1、随机引物1.5μl、MLV 1μl、HPR-I 0.5μ1。扩增体系包括逆转录反应产物cDNA 3μl、10×PCR缓冲液2.5μl、dNTP 1.5μl、TaqDNA聚合酶0.2μ1、dH2O 15.8μl、上下游目的引物各1μl。以β-actin作为内部对照。按照程序进行逆转录及扩增后，将13μl扩增产物加入含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的2％琼脂糖胶中跑电泳。紫外透射分析仪(UVP)观察分析结果。 7、统计学分析所得结果采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验结果： 1、不同浓度As2O3和/或TGF-β1对NB4细胞生长的抑制作用 As2O3和/或TGF-β1均能明显抑制NB4细胞的生长，促进NB4细胞的凋亡。As2O3对NB4细胞的抑制及促凋亡作用呈剂量-时间依赖关系，24h时IC50约为12μmol/L，48h约为5μmol/L，72h约为3μmol/L。 2、NB4细胞凋亡情况及细胞周期分布的改变随着As2O3浓度的增加可见NB4凋亡小体数量增加。单用TGF-β1(5ng/ml)也使NB4细胞产生凋亡，但细胞形态改变没有As2O3(5μmol/L)处理组明显。联合处理组的NB4细胞凋亡比例明显大于单用As2O3、TGF-β1处理组。As2O3和/或TGF-β1均可使NB4细胞出现细胞周期阻滞，5μmol/L As2O3使NB4细胞阻滞在G2/M期，5ng/ml TGF-β1使NB4细胞阻滞在G1期，联合处理组主要为S期阻滞。 3、As2O3和/或TGF-β1作用于NB4细胞后P27Kip1、cyclinE、内源性TGF-β1以及bcl-2 mRNA表达水平的改变 As2O3处理组随其药物浓度的增加，P27KIP1及内源性TGF-β1的mRNA表达上调而cyclinE、bcl-2的mRNA表达下调；TGF-β1单独处理NB4细胞后P27KIP1、cyclinE、bcl-2的mRNA表达改变与As2O3处理组一致；联合处理组结果显示TGF-β1可增强As2O3上述作用。外源性TGF-β1浓度<5ng/ml时，内源性TGF-β1的mRNA表达上调，外源性TGF-β1浓度为10ng/ml时，内源性TGF-β1的mRNA表达下调。讨论： As2O3是中药砒霜的主要有效成分，70年代发现可有效治疗APL。国内陈元仲等[11]发现As203诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1表达上调并伴有bcl-2表达下调。TGF-β1作为已知的最强的血细胞增殖抑制因子，其主要通过引起细胞周期阻滞而导致细胞凋亡。本实验结果显示，当As2O3药物浓度≥5μmol/L时，NB4细胞出现了明显的G2/M期细胞周期阻滞，其原因可能是As2O3作用于NB4细胞后，G2/M期细胞内的活性氧水平超过了细胞可耐受的范围，细胞不能进行正常的有丝分裂而阻滞于G2/M期，并引发凋亡。TGF-β1也有促进NB4细胞凋亡的作用。且联合应用As2O3和TGF-β1诱导NB4细胞凋亡的作用强于As2O3单药应用，并出现S期细胞周期阻滞，可见外源性TGF-β1可加强As2O3诱导NB4细胞凋亡的作用。以上实验结果提示二者在诱导细胞凋亡机制中可能存在交叉通路。本实验结果表明，As2O3和TGF-β1调节P27Kip1、cyclinE、bcl-2基因表达趋势的功能是一致的。As2O3可能通过上调TGF-β1促进NB4细胞的凋亡。P27Kip1是TGF-β1信号传导途径的下游分子，是细胞增殖的负调节因子。cyclinE是细胞周期中期的正调节因子，P27Kip1和cyclinE两者相互作用以维持G1/S限制点的正负调控物的稳态。TGF-β1可能直接抑制了cyclinE的表达，或者通过调高的P27Kip1,表达而抑制cyclinE的活性，从而导致细胞周期阻滞。本研究结果还提示，当作用于NB4细胞的外源性TGF-β1浓度<5ng/ml时，NB4细胞产生的内源性TGF-β1的mRNA表达上调；当外源性TGF-β1浓度为10ng/ml时，NB4细胞产生的内源性TGF-βl的mRNA表达下调。可见作用于NB4细胞的外源性TGF-β1浓度过强时可能拮抗内源性TGF-β1的表达，或与受体靶点过饱和有关。因此对未来TGF-β1应用于临床治疗白血病可能具有指导意义。结论： 1、As2O3及TGF-β1均可诱导NB4细胞凋亡及细胞周期分布异常。 2、As2O3及外源性TGF-β1可能通过上调TGF-β1增加细胞凋亡,TGF-β1可能直接抑制了cyclinE的表达，或者通过调高的P27Kip1表达而抑制cyclinE的活性，从而导致细胞周期阻滞。 3、高浓度的外源性TGF-β1可拮抗内源性TGF-β1表达，可能存在TGF-β1受体靶点过饱和现象 4、P27Kip1的基因表达升高时，与之拮抗的cyclinE的基因表达急剧下调，进一步证明P27Kip1、cyclinE可能是As2O3和TGF-β1引起NB4细胞周期阻滞的关键中间效应物。收起

关键词 : 诱导细胞凋亡