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1. α-微管蛋白1C链(TUBA1C)在胰腺癌中的表达和作用及其机制研究

[学位论文] Mugahed Abdullah Hasan Albahde 浙江大学 2020年硕士导师: 王伟林共224页

摘要 : 背景：胰腺癌的恶性程度很高，是致死率最高的恶性实体肿瘤之一。2016年，美国新增约5.3万例胰腺癌患者，其中4.2万人死亡。超过85%的患者确诊时已经处于肿瘤晚期，失去了进行根治性手术的机会，只能选择其他姑息治疗方式，如化疗。当前，针对胰... 展开背景：胰腺癌的恶性程度很高，是致死率最高的恶性实体肿瘤之一。2016年，美国新增约5.3万例胰腺癌患者，其中4.2万人死亡。超过85%的患者确诊时已经处于肿瘤晚期，失去了进行根治性手术的机会，只能选择其他姑息治疗方式，如化疗。当前，针对胰腺癌治疗的药物并非靶向治疗胰腺肿瘤，特异性很低，临床使用效果差。因此，深入研究胰腺癌发生发展的内在的分子机制，确定精准治疗的药物靶点是目前胰腺癌研究的紧迫目标。微管蛋白是一种多功能的细胞骨架蛋白，其具有多种类型，TUBA1C是α-微管蛋白的一种亚型，与微管结构的组织有关。最新研究表明，TUBA1C与体内多种肿瘤的细胞增殖和细胞周期存在密切关系。同时，多项研究提示TUBA1C在多种肿瘤中表达增高且发挥促癌作用，如TUBA1C在肝细胞肝癌中表达上调并导致患者预后较差。当前，有关TUBA1C在胰腺癌发生发展中的生物学功能和临床意义的研究尚处空白。本课题以TUBA1C为主要研究切入点，围绕TUBA1C在胰腺癌中的表达、在胰腺癌发生中的作用以及其分子机制等多个层面进行研究，从而评估TUBA1C作为胰腺癌分子诊断标记物和治疗靶点的潜在应用价值。另外，通过体内和体外实验探索针对微管的靶向抗肿瘤药物在抑制胰腺癌细胞增殖和细胞周期的发生发展中的作用，探究胰腺癌药物治疗的新靶点，为临床实践治疗胰腺癌提供参考。目的：研究胰腺癌组织和癌旁组织中TUBA1C基因的差异表达，通过体内、体外实验探讨TUBA1C在胰腺癌进展中的生物学机制及其在胰腺癌作为分子标记物的可能性。通过体内、体外实验探索BNC105对胰腺癌细胞的作用机制。方法：通过公开数据集(TCGA)和基因表达谱数据动态分析(GEPIA)，检测TUBA1C在胰腺癌中的mRNA水平及其与患者总生存率(OS)的关系。釆用免疫组织化学染色(IHC)检测配对组织中TUBA1C在蛋白水平上存在的表达差异。通过免疫蛋白印迹(western blot，WB)验证PDAC细胞系中TUBA1C的表达情况。通过edgeR软件包筛选TUBA1C高/低基因群中DEGs的生物信息学数据。通过KEGG探索TUBA1C相关通路的调控作用和相关基因。采用siRNA针对胰腺癌AsPC-1和BxPC-3细胞系，构建TUBA1C敲低的细胞模型。同时，在PANC-1细胞株中构建TUBA1C过表达的细胞模型。运用CCK-8、EDU、克隆形成实验、凋亡实验、周期实验、迁移和侵袭等实验，研究TUBA1C在体外水平对胰腺癌细胞周期、增殖、凋亡所产生的影响。通过WB探讨TUBA1C影响胰腺癌细胞内各种功能蛋白的变化。利用BxPC-3构建BALB/c裸鼠异种移植模型，研究TUBA1C敲低后对肿瘤生长产生的影响。体外实验中，细胞株AsPC-1和BxPC-3分别加入BNC105作为实验组和对照组。通过CCK8实验进行细胞IC50及活力检测。流式细胞仪和WB等实验方法检测BNC105对PDAC细胞周期和凋亡的影响。利用之前构建的动物模型观察BNC105对肿瘤生长的作用。通过HE染色观察胰腺癌细胞形态，并且对Ki-67进行IHC染色来确定BNC105抑制胰腺癌细胞增殖的作用。结果：利用TCGA和GEPIA进行生物信息分析，结果显示TUBA1C在胰腺癌组织的mRNA和蛋白质水平上均高于癌旁组织。本研究中，IHC染色显示TUBA1C蛋白的表达在胰腺癌组织中高于癌旁组织，并且TUBA1C高表达与p53基因的表达显著相关(P=0.008)，单因素分析显示患者OS与肿瘤分级(P=0.007)，N期(P=0.007)和TNM期(P=0.011)密切相关。 KEGG分析表明TUBA1C过表达主要与细胞周期信号通路密切相。TUBA1C通过细胞周期信号途径促进胰腺癌细胞体外增殖并抑制细胞凋亡。体外实验，在敲低TUBA1C表达的细胞系中胰腺癌细胞增殖受到抑制。同时，动物实验中TUBA1C低表达抑制了异种移植的裸鼠胰腺癌模型肿瘤细胞的生长增殖能力。 CCK8体外实验显示BNC105显著抑制胰腺癌细胞增殖，流式细胞术与WB结果显示BNC105可诱导AsPC-1和BxPC-3细胞株G2/M期阻滞，并能调节G2/M周期相关蛋白Cdc2/CyclinB1，Cdc7的表达。BNC105可诱导胰腺癌细胞调亡，并能提高PARP，caspase-3，caspase-7的表达水平。此外，BNC105体内实验显示其对胰腺癌有抑制作用。裸鼠肿瘤标本的Ki-67和HE结果显示BNC105显著促进胰腺癌细胞凋亡。结论： TUBA1C在胰腺癌组织中高表达，且这种高表达与胰腺癌患者的不良预后相关。TUBA1C是潜在的促胰腺癌基因，通过细胞周期信号通路，促进胰腺癌细胞的增殖，抑制胰腺癌细胞的凋亡。体内外实验证实BNC105对胰腺癌存在抑制作用，其作用机制为通过细胞周期G2/M期阻滞以及诱导细胞发生调亡。收起

关键词 : 胰腺癌 &alpha -微管蛋白1C链细胞周期细胞增殖

2. 微管蛋白β-2b链突变体真核表达载体的构建及对微管聚合的研究

[学位论文] 何天瑶吉林农业大学 2019年硕士导师: 赵福广共56页

摘要 : 微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成，微管蛋白β-2b链(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亚型基因，它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨... 展开微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成，微管蛋白β-2b链(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亚型基因，它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨酸会导致小鼠大脑皮质的损坏和异常发育，本文就TUBB2B突变基因TUBB2B(N247S)对微管聚合的影响展开分析。本实验以C57bl/6j小鼠总RNA为模板，反转录得到cDNA，通过与T载体连接构建了TUBB2B基因克隆载体，并通过点突变技术构建了TUBB2B(N247S)基因克隆载体。使用DNA限制性酶切技术构建了TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核表达载体，并在转染试剂的介导下，将真核重组表达载体及空载体转染至小鼠成纤维细胞L929中，设置空白组和对照组，对不同组的细胞进行微管蛋白的提取，通过Western-blot技术对α微管蛋白表达量进行分析，收集表达的突变蛋白并通过磁分离技术进行纯化，为了研究突变蛋白对微管骨架的影响，对纯化后的突变蛋白进行体外聚合实验分析，所得结果如下： 1.构建的TUBB2B以及TUBB2B(N247S)克隆载体经菌液PCR及DNA鉴定证明克隆载体构建正确。 2.目的片段与真核表达载体连接成功，并通过菌液PCR，双酶切及DNA测序结果鉴定，成功构建TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核重组表达载体。 3.成功转染L929细胞，以及成功表达突变蛋白，经过优化诱导表达条件，确定了以6孔板为准，最佳目的基因与转染试剂的比例为8∶1，且实现了TUBB2B基因在L929中的高效表达。 4.转染组与空白组及对照组进行比较，游离态的α微管蛋白显著高于对照组和空白组(P值分别为0.0001和0.0004)，聚合态的α微管蛋白显著低于对照组和空白组(P值分别为0.0004和0.0036)。 5.磁分离技术纯化可以得到较高浓度的目的蛋白。 6.TUBB2B(N247S)突变蛋白对微管蛋白体外聚合具有一定的抑制作用。收起

关键词 : 微管蛋白 &beta -2b链真核表达微管聚合磁分离技术

3. c-fos和c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的研究

[学位论文] 胡安根第三军医大学 2003年硕士导师: 黄跃生共57页

摘要 : 目的:探讨c-fos,c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用.方法:烧伤血清按照该研究所烧伤动物模型制备获得,按照分子克隆方法构建c-fo... 展开

关键词 : 细胞骨架 &beta -微管蛋白肌钙蛋白反义基因缺氧复合烧伤血清处理 c-fos c-jun 基因转染重组体

4. 猪或小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中PKC和MAPK信号通路的对话及γ-微管蛋白定位研究

[学位论文] 孟小倩山东师范大学 2004年硕士导师: 李云龙;孙青原共42页

摘要 : 在体内,哺乳动物卵母细胞的发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期.在周期性激素的诱导下,一部分卵母细胞发生生发泡破裂,恢复减数分裂.在这一过程中,卵丘细胞中的蛋白激酶(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在卵丘包裹的卵母细胞减数分裂过程中具有重要... 展开在体内,哺乳动物卵母细胞的发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期.在周期性激素的诱导下,一部分卵母细胞发生生发泡破裂,恢复减数分裂.在这一过程中,卵丘细胞中的蛋白激酶(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在卵丘包裹的卵母细胞减数分裂过程中具有重要作用,但是它们之间的相互调节及相互作用关系并不清楚.该实验主要研究了1)卵丘细胞中MAPK是否参与了PKC激活的减数分裂恢复;2)在激素诱导的减数分裂恢复过程中PKC对MAPK活性的调节作用;3)卵丘细胞中PKC和MAPK诱导减数分裂恢复的可能作用模式.体内卵母细胞减数分裂的恢复由于受到卵泡内抑制性微环境的影响而发生阻滞,激素的作用打破这一阻滞而重新启动减数分裂.该实验应用一种体外诱导模型模拟这一过程.将从卵巢中取出的猪卵母细胞培养在含有减数分裂恢复抑制剂的培养液中,然后用PKC的激活剂和激素诱导猪卵母细胞的减数分裂恢复,用蛋白质免疫印迹检测MAPK的活性.我们的结果表明PKC的激活剂,豆蔻酰佛波醇乙脂(PMA)可以诱导猪卵母细胞减数分裂恢复,同时激活卵丘和卵母细胞中的MAPK活性,而这一过程可被PKC的抑制剂chelerythrine和calphostin C所抑制.同时,MAPK上游激酶MEK的抑制剂U0126也可以抑制PMA诱导的卵母细胞减数分裂恢复和卵丘细胞中的MAPK活性,这说明PKC诱导的卵母细胞减数分裂恢复可能是通过激活卵丘细胞中MAPK的活性实现的.γ-微管蛋白是微管蛋白家族的成员之一,在微管的晶核起始过程中具有重要作用.该研究应用激光共聚焦显微术研究了小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精及早期胚胎发育过程中γ-微管蛋白的动态变化,以及在第一次减数分裂纺锤体形成过程中α-微管蛋白和γ-微管蛋白的共定位情况.结果表明,γ-微管蛋白均匀地分布在生发泡期(GV期)小鼠卵母细胞中;生发泡破裂(GVBD),γ-微管蛋白呈星点状分布于卵胞质及凝集的染色体周围,至前中期,则迁移至纺锤体的两极;后期至末期,γ-微管蛋白逐渐解凝集,定位于分开的染色体之间.γ-微管蛋白在第二次减数分裂及受精后的定位与第一次减数分裂过程相似.与GV期卵母细胞不同的是,在早期胚胎的间期卵裂球中,γ-微管蛋白呈星点状分布.另外,第一次减数分裂纺锤体组装过程中,在卵胞质中检测到定位几乎完全重叠的点状分布的α-微管蛋白和γ-微管蛋白,而在凝集的染色体的位置可见α-微管蛋白以γ-微管蛋白为中心向四周辐射,随着γ-微管蛋白向纺锤体两极迁移,α-微管逐渐组织形成中期纺锤体.以上结果表明,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精、及早期胚胎发育过程中,γ-微管蛋白在微管晶核起始及纺锤体形成过程中起重要作用. 收起

关键词 : 蛋白激酶C 丝裂原活化蛋白激酶信号通路 &gamma -微管蛋白减数分裂

5. 非受体酪氨酸激酶c-Abl调节细胞骨架的机理研究

[学位论文] 顾晶安徽大学 2013年硕士导师: 曹诚；刘萱共58页

摘要 : 非受体酪氨酸激酶c-abl基因位于人的9号染色体上，是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳动物细胞内的同源基因，其编码的蛋白c-Abl通过与多种底物相互作用，在细胞增殖与分化、细胞周期调控、细胞黏附与迁移、氧化应激、DNA损伤修复以及机体免疫... 展开非受体酪氨酸激酶c-abl基因位于人的9号染色体上，是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳动物细胞内的同源基因，其编码的蛋白c-Abl通过与多种底物相互作用，在细胞增殖与分化、细胞周期调控、细胞黏附与迁移、氧化应激、DNA损伤修复以及机体免疫调节等生命活动中发挥重要作用。真核生物细胞骨架由微丝、微管及中间纤维组成，其中，微管主要由α/β-微管蛋白(α/β-tubulin)异二聚体聚合而成，具有高度的动态性，γ-微管蛋白(γ-tubulin)不是微管组成成分，主要位于微管组织中心(microtubule-organizingcenter,MTOC)，与多种其他蛋白形成微管成核复合物，参与微管的成核。中间纤维分为5种类型，分布于不同种类的细胞，为每种细胞提供独特的细胞骨架网络结构。三种细胞骨架各有特点但彼此相互联系，共同参与调节细胞迁移、细胞分裂、细胞形态维持等重要过程。已有研究表明，c-Abl具有肌动蛋白结合结构域(G/F-actinbindingdomain)，可与微丝相关重塑蛋白相互作用进而调节微丝骨架动态平衡，在细胞黏附、细胞迁移以及伪足形成等过程中发挥重要作用。本实验室前期研究结果提示c-Abl对微管骨架也具有调节作用，但其调控机理尚不明确。本研究首先利用免疫沉淀和免疫印迹方法证实，c-Abl激酶与α/β/γ-tubulin存在相互作用，且与γ-tubulin的相互作用最为显著，H2O2介导c-Abl激酶活化能显著增强其与γ-tubulin的相互作用。运用原位检测蛋白质相互作用技术（Duolink技术）发现，c-Abl与γ-tubullin的相互作用受细胞周期调节。进一步研究发现，c-Abl激酶可使α/γ-tubulin酪氨酸磷酸化，且γ-tubulin的酪氨酸磷酸化依赖于c-Abl激酶活性。运用细胞周期同步化方法发现，γ-tubulin酪氨酸磷酸化水平随细胞周期改变。利用LC-MS/MS串联质谱技术鉴定出γ-tubulin存在5个酪氨酸磷酸化修饰位点，即Tyr60、Tyr82、Tyr92、Tyr366及Tyr443。此外，我们还发现c-Abl可提高γ-tubulin的表达水平并抑制其泛素化降解，增强γ-tubulin的稳定性。为了研究c-Abl是否通过γ-tubullin磷酸化修饰调节细胞微管骨架的形成，我们从细胞中分离了聚合和解离状态的α-tubulin，发现在c-Abl激酶敲低的细胞中解离态的微管蛋白所占比例升高，提示c-Abl激酶可抑制微管解聚。同时，利用微管解聚药物nocodazole处理细胞，经免疫荧光染色观察微管结构发现，c-Abl激酶敲低的细胞对微管解聚药物敏感性增加，同样表明c-Abl激酶可抑制微管解聚，稳定微管骨架。由于γ-tubulin位于微管组织中心，参与微管成核，因此，我们推测c-Abl激酶对微管细胞骨架的调节作用可能与其对γ-tubulin的磷酸化修饰有关。此外，质谱鉴定提示，氧化应激可调节c-Abl与中间纤维蛋白vimentin及cytokeratin间的相互作用。进一步研究发现，c-Abl可使cytokeratin酪氨酸磷酸化。c-Abl可影响vimentin在细胞内的表达，当c-Abl表达敲低或激酶活性被抑制，vimentin的表达均下降。由于vimentin的表达水平与某些肿瘤细胞的侵袭能力正相关，且细胞侵袭实验也表明，c-Abl缺失或活性抑制可降低SW480或A549细胞的侵袭能力，据此推测该过程可能与c-Abl对vimentin表达水平的调节有关。综上所述，本研究发现c-Abl激酶能与微管蛋白相互作用并使γ-tubulin酪氨酸磷酸化，提示γ-tubulin在微管组织中心的功能受c-Abl激酶调节，为c-Abl对微管骨架调节机理的阐明提供了思路。c-Abl对中间纤维蛋白vimentin及cytokeratin的影响，为探索c-Abl对中间纤维骨架的动态调节以及肿瘤细胞侵袭的影响提供了线索。收起

关键词 : 非受体酪氨酸激酶c-Abl 细胞骨架调节机理 &gamma -微管蛋白酪氨酸磷酸化

6. c-FLIP和TGF-β<,1>在喉鳞癌组织中的表达及其临床相关性研究

[学位论文] 沈楚东南大学 2006年硕士导师: 黄志纯共69页

摘要 : 目的：探讨c-FLIP和TGF-β<,1>在喉鳞癌组织中的表达与肿瘤病理学分级和患者临床分型、分期及颈淋巴结转移之间的相关性以及两种细胞因子在喉鳞癌组织中表达的相关性。方法：选取2001年至2005年间在东南大学附属中大医院耳鼻咽喉科接受手术治疗的喉... 展开目的：探讨c-FLIP和TGF-β<,1>在喉鳞癌组织中的表达与肿瘤病理学分级和患者临床分型、分期及颈淋巴结转移之间的相关性以及两种细胞因子在喉鳞癌组织中表达的相关性。方法：选取2001年至2005年间在东南大学附属中大医院耳鼻咽喉科接受手术治疗的喉鳞癌患者30例，年龄33～75岁，平均年龄57岁，均为男性病例，所有患者术前均未接受放疗，选取患者肿瘤组织及其相应喉部正常组织分别构成实验组和对照组，对两组标本均采用RT-PCR法测定组织中c-FLIPmRNA的表达情况，同时采用免疫组化法分别测定两组中c-FLIP和TGF-β<,1>这两种细胞因子的表达情况。结果：1、实验组中，c-FLIPmRNA表达阳性者有18例，而在对照组中，仅3例表达阳性，两组表达差异经统计学分析具有显著性，且喉鳞癌组织中c-FLIPmRNA的表达水平与肿瘤的病理学分级和患者的临床分期成正相关，在伴颈淋巴结转移组中的表达量要明显高于非转移组，而在喉鳞癌患者临床各型中的表达量未见显著性差异。2、c-FLIP在实验组中表达阳性者有23例，其阳性细胞平均表达率约为44.87％，而相应对照组中仅5例表达阳性，阳性细胞平均表达率约为8.63％；TGF-β<,1>在实验组中表达阳性者有25例，其阳性细胞平均表达率约为48.56％，而其对照组中仅6例表达阳性，阳性细胞平均表达率约为8.25％，两因子在两组中的表达差异均具有显著性，并且两因子在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤的病理学分级和患者的临床分期成J下相关，且它们在伴颈淋巴结转移组中的表达水平要明显高于非转移组，而它们在喉鳞癌患者临床各型中的表达水平未见显著性差异。结论：1、c-FLIP基因和蛋白、rGF-β<,1>在喉鳞癌组织中高表达而在喉部正常组织中低表达。2、c-FLIP、TGF-β<,1>这两种细胞因子在喉鳞癌组织中的表达水平与喉鳞癌患者的临床分期、颈淋巴结转移和肿瘤病理学分级之间存在相关性。3、c-FLIP和TGF-β<,1>这两种细胞因子在喉鳞癌组织中的表达存在着相关性，它们可能共同参与了喉鳞癌的发生、发展。收起

关键词 : c-FLIP TGF&beta 1 逆转录聚合酶链免疫组化喉鳞癌

7. 糖基转移酶β3Gn-T8与转录因子c-Jun的相关性及其与胃癌侵袭的关系

[学位论文] 姜智苏州大学 2012年博士导师: 吴士良共113页

摘要 : 目的: 根据已有文献报道:当细胞癌变时，细胞糖复合物上的糖链结构常发生变化，而这种变化来源于合成该糖链的相应糖基转移酶表达的改变。β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(β3Gn-Ts)家族是糖基转移酶的重要成员，β3Gn-Ts家族参与合成其产物中的β... 展开目的: 根据已有文献报道:当细胞癌变时，细胞糖复合物上的糖链结构常发生变化，而这种变化来源于合成该糖链的相应糖基转移酶表达的改变。β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(β3Gn-Ts)家族是糖基转移酶的重要成员，β3Gn-Ts家族参与合成其产物中的β1，3-乙酰氨基葡萄糖连接键，其成员β3Gn-T8参与合成糖蛋白上N-连接型糖链中的多聚乳糖胺结构。本课题组先前研究证明，β3Gn-T8与胃癌的增殖侵袭转移密切相关，可能通过对基质金属蛋白酶MMP-2表达的调控促进胃癌的侵袭作用，因此，对MMP-2表达的调控通路有望作为控制胃癌侵袭转移的新靶点。本研究分析β3Gn-T8上游调控序列启动子区，发现β3Gn-T8启动子有五个c-Jun和一个Ets-1和结合位点。为了进一步阐明β3 Gn-T8与胃癌的侵袭转移的相关性，本研究以体外培养的人胃癌SGC7901细胞株为研究对象，探讨胃癌SGC7901细胞株中转录因子c-Jun对糖基转移酶β3Gn-T8的转录调控;c-Jun基因沉默后对β3Gn-T8的表达以及对胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响。同时在由10例临床标本制作成的组织芯片上检测c-Jun、CD147和多聚乳糖胺糖链的表达，对在临床胃癌标本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖链和CD147的表达相关性进行探讨，以期为胃癌的治疗提供新的途径。方法: 1.RT-PCR检测c-Jun和β3Gn-T8在SGC7901等六种肿瘤细胞株中的表达情况。 2.采用c-Jun中等量表达和β3Gn-T8高表达的人胃癌SGC7901细胞株为研究对象。应用三种生物信息学软件对β3Gn-T8启动子区的转录因子c-Jun基因的结合位点进行预测，根据预测结果构建β3Gn-T8启动子区系列截短体，并构建c-Jun基因的正义表达载体，经酶切、测序鉴定重组质粒的序列;应用双荧光素酶报告基因技术分析β3Gn-T8启动子区系列截短体的转录激活活性;并进一步采用染色质免疫沉淀( ChIP)检测分析c-Jun蛋白与β3Gn-T8基因DNA的结合。 3.设计并构建4条针对c-Jun mRNA靶点的siRNA真核表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同时设计shRNA-无关序列作为阴性对照(negative control，NC)，并构建表达载体;培养SGC7901细胞，以脂质体法转染细胞，荧光显微镜观察以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则，优化转染条件，根据优化的条件将pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒转染胃癌SGC7901细胞，应用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测四组pGPU6/GFP/Neo-shRNA对c-Jun基因表达的抑制作用，筛选出干扰效果最好的一组表达载体用于后续实验;设计空白对照组(Blank组，SGC7901细胞株)、阴性对照组(NC组，pGPU6/GFP/NC质粒转染的SGC7901细胞)、c-Jun-shRNA组(pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA质粒转染的SGC7901细胞)为研究对象，经G418筛选，获得稳定转染表达载体pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA的SGC7901细胞;应用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测c-Jun基因沉默后β3Gn-T8的表达;应用CCK-8试剂盒检测三组细胞的增殖能力;应用凝集素细胞免疫荧光和FITC标志的凝集素流式细胞术检测三组细胞多聚乳糖胺糖链的表达。 4.通过免疫组织化学方法检测c-Jun、CD147和多聚乳糖胺糖链在由10例人胃癌组织和10例癌旁非肿瘤胃组织制作而成的组织芯片上的表达，以对在临床胃癌标本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖链及与CD147和MMP-2表达相关性进行探讨。结果: 1.C-Jun和β3Gn-T8在肿瘤细胞株中的表达:我们检测了胃癌细胞株SGC7901及AGS、恶性脑胶质瘤细胞株U87及LN229、乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231中均有不同程度的表达，其中，胃癌SGC7901细胞株中c-Jun呈中等表达水平，β3Gn-T8呈高表达。 2.生物信息学分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三种在线软件预测结果分析β3Gn-T8启动子区存在着c-Jun基因的多个结合位点;双荧光素酶报告基因显示c-Jun对β3Gn-T8启动子区具有转录激活作用，其中启动子区-561/+8片段的转录活性最高，且对c-Jun呈剂量依赖性;ChIP检测发现:活化的c-Jun蛋白与β3Gn-T8基因的DNA片段有相互结合。 3.shRNA表达载体的构建及其对胃癌生物学行为的影响:靶向c-Jun mRNA的四个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组质粒表达载体经酶切、测序鉴定，证实载体构建成功;重组质粒表达载体通过脂质体介导转染人胃癌SGC7901细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光，RT-PCR和 western blot结果证实pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949对c-Jun表达抑制的效果最好，因此，选择该shRNA载体，构建后续对c-Jun稳定下调的稳定细胞株;RT-PCR和western blot方法检测鉴定c-Jun基因沉默后SGC7901细胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平表达均下降;CCK-8实验结果显示c-Jun基因沉默后SGC7901细胞增殖能力明显下降;凝集素细胞免疫荧光和流式细胞术检测结果显示c-Jun基因沉默后β3Gn-T8表达下降导致细胞上多聚乳糖胺糖链的表达量降低。 4.C-Jun、CD147和多聚乳糖胺链在胃癌组织的表达:结果显示c-Jun在胃癌组织的表达显著高于癌旁非肿瘤胃组织;CD147在胃癌组织高表达，而在癌旁非肿瘤胃组织几乎无表达;凝集素结合的多聚乳糖胺糖链表达在胃癌细胞和胃粘膜上皮细胞的胞浆中，棕黄色颗粒状。在弥漫型胃癌中的表达呈深棕色，而在肠型胃癌的表达为浅棕色，在某些肠型胃癌的癌细胞腺腔侧的胞浆及胞膜中呈深棕色颗粒状强阳性表达。在肠型胃癌的腺腔中和印戒细胞癌的粘液池中有强阳性颗粒。而在癌旁非肿瘤胃组织上皮细胞中的着色强度及范围明显弱于胃癌细胞。此外，在低分化腺癌中表达较高，而在高分化腺癌中表达较低。结论: 1.C-Jun和β3Gn-T8在六种肿瘤细胞株中均有表达，胃癌SGC7901细胞株中c-Jun呈中等表达量，β3Gn-T8呈高表达; 2.生物信息学软件预测结果显示β3Gn-T8启动子区存在着转录因子c-Jun的多个结合位点;双荧光素酶报告基因结果显示c-Jun对β3Gn-T8启动子区具有转录激活作用，启动子区-561/+8片段的转录活性最高，且对c-Jun呈剂量依赖性;ChIP结果显示c-Jun蛋白结合至β3Gn-T8基因的DNA片段。因此，c-Jun参与了胃癌SGC7901细胞株中β3Gn-T8基因的表达调控，至少是调控因素之一。且呈正性调控作用。 3.针对c-Jun基因的pGPU6/GFP/Neo-c-Jun-shRNA表达载体构建成功，经过检验，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949对SGC7901细胞中c-Jun抑制效果最明显;并稳定转染SGC7901细胞株，获得c-Jun稳定下调的SGC7901细胞株，下调c-Jun基因表达后可降低胃癌SGC7901细胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达;进而抑制胃癌SGC7901细胞的增殖能力以及细胞多聚乳糖胺糖链的合成。 4.C-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖链结构在人胃癌组织的表达较癌旁非肿瘤胃组织显著增加。在弥漫型胃癌中多聚乳糖胺糖链结构的表达要强于肠型胃癌。综上所述，转录因子c-Jun对胃癌SGC7901细胞株中糖基转移酶β3Gn-T8的启动子区有转录调控作用，且呈正性调控作用;c-Jun基因沉默后能够抑制胃癌SGC7901细胞株中糖基转移酶β3Gn-T8的表达，抑制胃癌细胞的增值能力，并且降低胃癌细胞上多聚乳糖胺糖链的合成，从而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力;在10例胃癌病例的癌组织标本中，c-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖链结构均明显高表达，其趋势与胃癌细胞SGC7901呈完全一致表现。综合本课题组相关研究结果，推导β3Gn-T8可能通过调控HG-CD147的表达，进一步调控MMP的表达而参与肿瘤的侵袭和转移，从而为β3Gn-T8作为胃癌的新兴标志物及基因治疗靶点奠定了一定的理论基础。收起

关键词 : 糖基转移酶&beta 3Gn-T8 侵袭转移多聚乳糖胺糖链转录因子c-Jun 胃癌

8. 芳基乙烯与链醚的C(sp3)-H键官能团化反应研究

[学位论文] 严瞻西北大学 2019年硕士导师: 李剑利;王乃兴共83页

摘要 : 比较传统的有机合成方法，碳氢官能团化反应具有原子利用率高、步骤简单、环境友好等优点。芳基乙烯是来源广泛的煤化工及石油化工中的大宗产品，它的高值转化和利用具有重要应用前景和学术研究价值。苯乙烯作为不饱和烯烃中的典型分子，其双官能团化... 展开

关键词 : 芳基乙烯链醚类化合物 C(sp3)-H键官能团有机反应高值转化

9. 哮喘中IL-5、IL-10、C-FOS基因表达及其相关性实验研究

[学位论文] 罗百灵中南大学 1999年博士导师: 吴鄂生共69页

摘要 : 支气管哮喘(哮喘)是一种多发病、常见病,对人类健康构成了很大威胁.支气管哮喘发病机制非常复杂,涉及到多种细胞、细胞因子及炎症介质.细胞因子在哮喘发病中的作用是目前研究热点.现已公认白介素-5(IL-5)是哮喘发病中最突出的炎症细胞因子,白介素-10(... 展开支气管哮喘(哮喘)是一种多发病、常见病,对人类健康构成了很大威胁.支气管哮喘发病机制非常复杂,涉及到多种细胞、细胞因子及炎症介质.细胞因子在哮喘发病中的作用是目前研究热点.现已公认白介素-5(IL-5)是哮喘发病中最突出的炎症细胞因子,白介素-10(IL-10)虽与IL-5同属TH<,2>细胞分泌的细胞因子,但作用相反,是一种多效性细胞因子的合成抑制因子;而C-fos基因直接作用活化气道上皮细胞,与哮喘发病关系密切.研究它们在哮喘发病中的表达状况及IL-5与IL-10、C-fos基因表达间的相互关系具有极为重要意义.一.豚鼠哮喘模型支气管组织IL-5 mRNA表达研究,目的:了解哮喘豚鼠BALF中嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润及支气管组织IL-5 mRNA表达变化.了解BALF中嗜酸粒细胞浸润程度与支气管组织IL-5 mRNA表达量的相关性.结论:哮喘组豚鼠支气管组织IL-5 mRNA表达明显增强交伴有嗜酸粒细胞增加.哮喘鼠支气管组织IL-5 mRNA表达理与嗜酸粒细胞百分比成正相关参与哮喘发病.激素可抑制支气管组织IL-5 mRNA表达及EOS浸润,这可能是其治疗哮喘的机制之一.二.IL-10、C-fos基因与哮喘的关系及与IL-5的相关性研究,目的:了解哮喘豚鼠支气管组织IL-10 mRNA表达量变化及支氢气管上皮细胞表达C-fos蛋白水平变化.了解二者与IL-5相关性.结论:哮喘组鼠支气管组织IL-10 mRNA表达减弱,而支气管上皮C-fos蛋白表达增加.哮喘发作鼠支气管组织IL-5 mRNA表达量成负相关,与支气管上皮细胞C-fos蛋白表达水平成正相关.提高IL-10、降低IL-5及C-fos表达水平可能是激素治疗哮喘又一作用机制.三.外周血单个核细胞(PBMC)与支气管组织IL-5表达相关性研究.目的:观察外周血WBC、嗜酸粒细胞及白细胞分类与BALF细胞成份变化有无一致性,了解PBMC IL-5 mRNA表达量在各组豚鼠中的变化,以及与支气管组织IL-5 mRNA表达相关性.结论:哮喘组豚鼠PBMC IL-5 mRNA表达升高.哮喘发作鼠PBMC IL-5 mRNA表达量与外周血嗜酸性粒细胞数量及支气管组织IL-5 mRNA表达量成正相关.说明PBMC IL-5 mRNA表达量可望成为一种及时了解哮喘病情程度及对激素治疗反应的检测方法. 收起

关键词 : 支气管哮喘白介素-10 白介素-5 C-fos基因嗜酸粒细胞豚鼠逆转录-聚合酶链式反应

10. 非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的检测与鉴定

[学位论文] 杨洋华中科技大学 2010年博士导师: 王建军共30页

摘要 : 第一部分：非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的检测目的：检测非小细胞肺癌血清蛋白质组，筛选特异性的蛋白质标记物，构建可用于非小细胞肺癌早期检测和诊断的判别模型。方法：应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检... 展开第一部分：非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的检测目的：检测非小细胞肺癌血清蛋白质组，筛选特异性的蛋白质标记物，构建可用于非小细胞肺癌早期检测和诊断的判别模型。方法：应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检测112例非小细胞肺癌和123例对照血清样本的蛋白质质谱，并结合支持向量机（SVM）对数据进行分析。结果：经检测及生物信息学分析处理，发现P＜0.01的差异性m/z峰22个。从差异性显著的蛋白质峰的任意组合中，运用SVM筛选出预测值Youden指数最高的组合模型，获得m/z峰值位于6628、9191和11412的蛋白质标记物3个。与正常健康组相比，m/z峰值位于6628的蛋白质在非小细胞肺癌中明显低表达，而峰值位于9191和11412的蛋白质呈明显高表达，且表达强度与分期也有一定的相关性。盲法测试结果显示，联合3种潜在蛋白质标记物，该判别模型区分非小细胞肺癌和对照组的敏感性为96.56%，特异性为94.79%，阳性预测值为95.0%。结论：m/z峰值位于6628、9191和11412的蛋白质可以作为非小细胞肺癌潜在的生物学标记物。SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术为非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的检测提供了有效的手段。第二部分：非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的鉴定目的：结合蛋白组学技术对m/z峰值位于6628、9191、11412的蛋白质标记物进行结构鉴定。方法：运用HPLC对3种蛋白质标记物进行分离纯化，随后采用MALDI-TOF-MS质谱技术对分离后的不同时间点的蛋白质纯化液进行检测，以跟踪目标蛋白质所在的样本。最后，对纯化后的蛋白质标记物进行酶解，并应用nano-LC-ESI-MS/MS进行测序。结果：m/z峰值位于6628的蛋白质经鉴定为载脂蛋白C-I；m/z峰值位于9191、11412的蛋白质分别为触珠蛋白α1链、S100A4蛋白。结论：联合运用HPLC、MALDI-TOF-MS和nano-LC-ESI-MS/MS等蛋白组学技术，可有效地对肿瘤蛋白质标记物进行结构鉴定。M/z峰值位于6628、9191和11412的蛋白质分别被鉴定为载脂蛋白C-I，触珠蛋白α1链和S100A4蛋白。第三部分：非小细胞肺癌血清蛋白质标记物的验证目的：运用抗体芯片技术对鉴定出的载脂蛋白C-I、触珠蛋白α1链和S100A4蛋白质进行免疫学检测，以验证鉴定结果的可靠性。方法：分别运用螯合有抗人载脂蛋白C-I抗体、抗人触珠蛋白α抗体和抗人S100A4抗体的蛋白质芯片对非小细胞肺癌患者和对照血清样本进行检测。结果：m/z峰值位于6628的蛋白质可被偶联有抗载脂蛋白C-I抗体的芯片捕获，而m/z峰值位于9191和11412的蛋白质可分别与偶联有抗触珠蛋白α抗体和抗S100A4抗体的芯片相结合。结论：3种蛋白质均可被抗体芯片特异性捕获，证明了前期鉴定结果的可靠性。载脂蛋白C-I、触珠蛋白α1链和S100A4蛋白在非小细胞肺癌患者和对照组血清中存在显著的差异性表达，三者联合应用对非小细胞肺癌的早期检测和诊断具有良好的应用价值和广阔的发展前景。收起

关键词 : 非小细胞肺癌蛋白质标记物 SELDI-TOF-MS 支持向量机HPLC 载脂蛋白C-I 触珠蛋白&alpha 1链 S100A4 抗体芯片