中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 廖锡文广西医科大学 2019年博士导师: 彭涛共379页

摘要 : 研究内容:本研究分为五部分进行研究:1.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查。2.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的候选单核苷酸多态性位点高尔基... 展开研究内容:本研究分为五部分进行研究:1.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查。2.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的候选单核苷酸多态性位点高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922的二期队列验证。3.基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究.4.乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析。5.GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT，AST的调控关系研究。第一部分乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT，AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查目的:本研究尝试通过GWAS方法对广西乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的全外显子单核苷酸多态性特征进行筛查，并分析其临床病理特征和预后。方法:收集49例在广西医科大学第一附属医院行肝切除术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者，且术后行TACE术。根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行分组，对这些患者癌组织进行全外显子芯片扫描并进行全外显子关联分析。结果:根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行全外显子关联分析，我们筛选了1247个P＜0.05的候选SNPs位点。通过ICSNPathway分析我们共鉴定出17个具有影响通路改变的SNPs位点(包括rs75387493，rs2271683, rs11768465, rs8207, rs28365927, rs1344642, rs1863704,rs10160013, rs4036, rs2235324, rs17183814, rs7973658, rs34550074,rs3740168，rs197922，rs3790525，rs41309181)，发现了4条SNP-Gene-Pathway的调控机制。通过生物信息学分析，利用GeneMANIA在线分析工具发现这些17个候选SNPs位点所在的基因与ALT和AST的编码基因具有共表达互作关系。通过GTEx数据库发现这17个SNPs中的高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922在肝脏等多个正常组织中具有表达数量性状基因座关系。结论:本研究筛选出17个潜在具有SNP-Gene-Pathway调控潜力的SNPs，其中GOSR2-rs197922位点可能参与调控血清ALT和AST。第二部分乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的候选单核苷酸多态性立点GOSR2-rs197922的二期队列验证目的:本研究通过收集独立于一期GWAS队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者进行全外显子关联分析结果的二期队列验证。材料方法:本研究收集于2014年至2017年在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除手术且术后行TACE术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织，通过Sanger法对这些患者进行高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922位点进行基因分型，分析候选位点与TACE术前术后血清ALT和AST变化的关系。结果:二期验证队列共纳入88例乙肝相关性原发性肝细胞癌接受肝切除术后行TACE治疗的患者，其中rs197922位点的基因型分布如下:AA基因型23例，AG基因型43例和GG基因型22例。通过卡方检验和Ligistic回归分析，我们未能观察到rs197922基因型分布与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者肝切除术后接受TACE治疗后血清ALT和AST的变化相关。结论:由于纳入二期验证队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者TACE化疗药物方案的改变，我们未能观察到rs197922位点的基因型与TACE术后ALT和AST水平变化显著相关。第三部分基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究目的:本研究的目的是基于GEO和TCGA数据库中原发性肝细胞癌的全基因组数据集对高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptorcomplex member2，GOSR2)基因的临床意义进行探索，及利用生物信息学方法对该基因在HCC中的分子机制进行分析。材料与方法:本研究分别纳入GSE14520和TCGA的212个和370个原发性肝细胞癌患者。通过诊断ROC和生存分析探索GOSR2基因的临床应用价值。随后基于全基因组数据对GOSR2进行差异表达基因、共表达基因和基因集富集分析等生物信息学方法探索其潜在的分子机制。结果:通过GSE14520和TCGA队列的验证，我们发现GOSR2基因在原发性肝细胞癌癌组织中表达量上调，高表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者具有较短的无复发生存时间和总生存时间。通过比较高、低表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者之间的全基因组表达谱数据，筛选两组之间的差异表达基因和进行基因集富集分析，以及GOSR2的共表达基因，以及通过生物信息学方法进行富集发现GSOR2可能通过调控细胞增殖、周期、NF-kB和Wnt等信号通路参与原发性肝细胞癌生物学行为的调控。结论:GOSR2可能具有作为原发性肝细胞癌诊断和预后生物标志物的潜力。其生物学功能可能涉及细胞增殖和周期等信号通路的调控。第四部分乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析目的:本研究通过评估高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAPreceptor complex member2，GOSR2)免疫组化表达量和rs197922的基因型分布探索他们作为乙肝相关性原发性肝细胞癌生物标志物的潜在临床应用价值，同时分析rs197922在乙肝相关性原发性肝细胞癌中的表达数量性状基因座(expression Quantitative Trait Loci,eQTL)特性。材料方法:本研究通过免疫组化方法对乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织进行GOSR2基因的免疫组化染色，以及对rs197922位点进行基因分型，比较不同GOSR2基因表达量和不同rs197922基因型患者之间的临床病理特征和预后差异。结果:本研究纳入342例广西乙肝相关性原发性肝细胞癌患者，通过多因素生存分析比较，我们发现GOSR2基因免疫组化阴性和阳性染色患者的无瘤生存和总体生存时间的差异未达到统计学显著性。但是，我们发现rs197922位点的基因型在非根治性切除等亚组的原发性肝细胞癌患者中与预后显著相关。结论:本研究中我们观察到GOSR2基因免疫组化表达水平与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者预后无关，但是我们发现到rs197922基因型分布在特定的乙肝相关性原发性肝细胞癌亚组中具有作为预后分子标志物的潜力。第五部分 GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT，AST的调控关系研究目的:本研究通过在肝癌细胞株中沉默高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)基因探索其在原发性肝细胞癌中的生物学功能，并探索其在正常肝细胞中在TACE化疗药干预的条件下与ALT和AST的调控关系。材料方法:利用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)技术在肝癌细胞株(MHCC-97H，Hep-G2和HCC-M)和正常肝细胞株(HL-7702)中沉默GOSR2基因，通过Westem Blot，RT-PCR，细胞划痕、增殖、侵袭等实验验证GOSR2生物学功能。通过化疗药物(5-氟尿嘧啶，吡柔比星，顺铂和洛铂)干预探索GOSR2在正常肝细胞株中与ALT和AST的调控关系。结果:通过WB，RT-PCR验证siRNA在细胞株中的沉默GOSR2的效果，并通过细胞划痕、增殖、侵袭等实验证实在肝癌细胞株中抑制GOSR2基因的表达可以显著抑制肝癌细胞的迁移、增殖和侵袭能力。在正常肝细胞株中沉默GOSR2基因表达，我们未观察到经化疗药物干预后正常肝细胞株分泌ALT和AST有明显变化。结论:本研究证实GOSR2基因在肝细胞癌中可能起着一个癌基因的角色，但本研究并未观察到其表达量的变化与ALT和AST在正常肝细胞株中经化疗药干预后存在显著的直接调控关系。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌经导管动脉化疗栓塞术谷丙转氨酶谷草转氨酶单核苷酸多态性

2. 原发性肝癌切除术同期胆囊切除术必要性研究-广西医科大学第一附属医院真实世界研究（2013年-2016年）

[学位论文] 杨成昆广西医科大学 2020年博士导师: 彭涛共350页

摘要 : 关键:词原发性肝癌;胆囊病变;乙型肝炎病毒;肝切除术;复发研究内容:本研究分为下列4部分:1.围绕医疗大数据背景下探讨医院数据来源、系统分布及大数据分析存在的挑战;2.基于住院人群，探讨住院患者乙型肝炎流行趋势，并针对胆囊病变与临床因素、... 展开关键:词原发性肝癌;胆囊病变;乙型肝炎病毒;肝切除术;复发研究内容:本研究分为下列4部分:1.围绕医疗大数据背景下探讨医院数据来源、系统分布及大数据分析存在的挑战;2.基于住院人群，探讨住院患者乙型肝炎流行趋势，并针对胆囊病变与临床因素、手术、介入治疗、胆囊收缩功能、影像学漏诊率之间关联进行多维分析;3.依据真实世界研究方法鸟瞰肝细胞癌复发风险临床表观全景;4.利用跨平台数据库及全外显子关联分析初步窥探NM23在肝癌复发机制第一部分医院数据来源、系统分布及大数据分析存在的挑战目的:探讨广西医科大学第一附属医院信息流向、系统分布及数据优势，总结医疗大数据分析存在的困难和挑战。材料与方法:由计算机管理中心、病案信息科等多学科协助，了解医院信息管理构架、数据库归档差异。收集住院患者籍贯及住址信息绘制城市分布地图，饼图形式描述住院病人人数占比。统计各年度广西医科大学第一附属医院总住院人数、门急诊及医技科室年工作量。分析数字化医疗进程中需重视医疗大数据处理的困难和挑战。结果:广西医科大学第一附属医院门诊及住院患者信息流向各个不同系统，由计算机管理中心管理，影像系统缺乏身份辨识ID，早期电子化病历存在非实名制就诊给后期数据处理产生混淆。广西医科大学第一附属医院住院病例基本覆盖全区，南宁市内病例占比约50％。2013年-2018年各年度住院人数在2014年后超10万人次，2013年门急诊总人次突破300万，2014年-2016年门急诊总人次在330万左右且逐年增长，影像学每年数据量总和均在20万人次以上，而检验项目上则在2012年已超过3000万条数据，2016年检验总量达到4000万数据量。在保证数据安全性前提下，数据采集、质量控制及标准化处理需要跨领域多学科合作，以满足临床科研需求。结论:医院医疗资源丰富，满足开展医疗大数据分析的条件，但数据挖掘过程可能遇到的困难和挑战需要得到重视。第二部分基于住院人群肝炎流行、胆囊病变相关多维分析目的:基于广西医科大学第一附属医院住院病例数据探讨住院人群肝炎流行趋势、胆囊结石发生相关危险因素、HCC患者行肝切除术保留胆囊后胆囊病变发生率及发生时间差异。评价手术对胆囊收缩功能的影响并对临床实践中影像学胆囊结石漏诊率分析。材料与方法:1.收集广西医科大学第一附属医院2013年-2016年363199名行乙肝免疫学检测住院患者年龄、籍贯、肝炎检测、肝功能检查、抗病毒治疗病史进行统计描述;2.收集广西医科大学第一附属医院2013年-2016年253843人年龄大于18周岁住院病例的抽血检查项目（包括肝功能、血脂检查、空腹血葡萄糖等）及影像学报告、入院记录初步诊断与既往史。通过参数检验分析患有胆囊结石与未患胆囊结石的两组病例检验值差异，逻辑回归分析评估暴露因素与胆囊结石发生之间的关联强度。3.纳入行HCC切除术但胆囊保留者760例，追溯其首次行肝癌切除手术时影像学记录报告、现病史、既往史内容，逻辑回归分析评估相关因素与肝切保胆术后胆囊病变发生的关联强度，生存分析方法比较各因素亚组在肝切保胆术后胆囊病变发生时间差异及风险。4.对2018年7月-2019年12月广西医科大学第一附属医院肝胆外科228名住院治疗患者行胆囊收缩功能测定检查，收集脂餐前后胆囊径线，参数或非参数方法评估术前、术后胆囊收缩率差异。5.对2015年1月-2017年12月广西医科大学第一附属医院住院1695名行肝部分切除患者术前影像学再评估，分析影像学胆囊结石漏诊影响因素。结果:1.广西医科大学第一附属医院住院患者HBsAg阳性率为12.8％，HBsAg阳性住院病人主要来源于广西南宁市且主要在31周岁-70周岁年龄段，与中国CDC数据一致。所有HBsAg阳性住院病人中有22.7％病例正在使用或曾经使用抗病毒治疗，部分肝功能转氨酶异常者未进行抗病毒治疗。2.广西医科大学第一附属医院2013年-2016年住院病例胆囊结石阳性率为3.1％。校正年龄、性别、民族、吸烟饮酒史影响因素，多因素回归分析提示高血压病、超重、胆红素及肝功能酶谱升高、高空腹血糖、HBV感染为胆囊结石发生危险因素（P＜0.05）。3.行肝癌切除术但胆囊保留的HCC患者术前胆囊病变患病率12.6％，术后胆囊病变患病率36.6％。生存分析提示术前肝功能酶谱、总胆固醇异常的患者术后胆囊病变发生时间较短，为胆囊病变危险因素（P＜0.05）。对于术前已有非结石性胆囊病变的患者术后发生胆囊结石的时间缩短，胆囊结石风险明显升高（P＜0.05）。4.肝切除术时同期保留胆囊者在住院期间行B超检查胆囊泥沙样结石检出率14.3％，配对HCC患者术前与术后胆囊收缩率比较具有统计学差异，术后胆囊收缩率弱于术前，有胆囊病变的患者术前胆囊收缩率明显低于无胆囊病变的患者。5.对行肝切除术患者术前胆囊内胆囊结石影像学再评估，结果提示腹部B超及CT/MRI均有不同程度的胆囊结石漏诊，多种因素影响胆囊结石检出及报告。结论:1.广西地区HBV流行度较全国及部分城市高，30-60周岁人群为目前筛查及治疗重点人群，部分肝功能发生改变的HBsAg阳性患者需加强抗病毒治疗;2.住院患者胆囊结石发生可能与性别、年龄、BMI、民族、肝功能改变、血脂、空腹血糖及HBV感染相关，具有相关危险因素患者应重点随访;3.行肝肿瘤切除保留胆囊的HCC患者术后胆囊结石及胆囊病变比例及发生风险升高，临床医师在手术前应告知患者风险;4.肝切除术保留胆囊的患者术前与术后胆囊收缩率的比较有待进一步研究;5.人工智能手段可能有助于增强临床工作者提高影像学诊断能力，降低胆囊结石漏诊率。第三部分肝细胞癌复发风险临床全景分析-真实世界研究目的:利用真实世界研究方法描画HCC（Hepatocellularcarcinoma，肝细胞癌）复发相关危险因素临床表观全景。材料与方法:筛选入组2013年-2016年广西医科大学第一附属医院曾行HCC切除术的1814例住院患者，收集患者首次HCC切除手术术前、术中、术后指标，包括术前检验项目、影像学检查、手术记录、麻醉记录、术后并发症等。通过随访信息获取患者首次HCC复发部位、个数、治疗方式等信息。描述性分析入组病例各项指标占比及肿瘤在肝脏内分布信息，单因素生存分析用于比较各因素亚组复发时间及风险差异。结果:入组HCC病例中男女比例为6.4∶1，79％的病例血清HBsAg阳性，19.6％的病例有肝吸虫感染，705例(38.9％)患者AFP(Alphafetoprotein，甲胎蛋白)＜20ng/ml，Child-Pugh肝功能分级A级患者共1635例，大肝癌(≥10cm)315例，76.1％为单个肿瘤，BCLC分期0/A共1227例(67.6％)，术中出血低于500ml共936例(51.6％)，超过1/4的肝肿瘤切除手术时长短于3小时，76.2％为R0切除，经受过抗病毒治疗的患者有1228例。可查询发生术后并发症者855例，Clavien-Dindo分级Ⅲ级以上者230例，ISGLS肝功能不全、胆漏、术后出血B级以上发生率分别为1.8％、0.7％、1.9％，其他并发症以肺部感染、术后胸水居多。入组HCC病例中位随访时间为428天（四分位数间距为131天-1131天，平均值为750天），术后发生HCC肝内复发或肝外转移者961例(53.0％)，复发再手术271例(14.9％)。HCC患者原发灶位于/侵犯S7频次最高，单结节单肝段肿瘤S4占比最高(37.7％)，肿瘤首次复发肝段占比最高为S8(21.5％)，胆囊床旁(S4/5/6)复发病灶占比约为46％。生存分析提示不同BCLC、CNLC2017、HKLC分期中位复发时间存在差异，高AFP血清水平与MVI发生率在各分期越差则累积百分比越高。Cox生存分析提示术前异常检验指标、差的肝癌临床分期和病理检视、发生术后并发症等为影响HCC术后复发的危险因素，术中肝门阻断时间、手术总用时不影响术后复发。利用多因素与分层生存分析，结果提示胆囊切除并不是HCC患者肝切术后肿瘤复发的独立危险因素。结论:通过多种临床证据进行整合，描画HCC患者首次行肝肿瘤切除术后的临床表观全景分析，展示了术前、术中、术后各项可能影响HCC患者术后复发的危险因素，为HCC患者预后评估及后续治疗提供了方向。第四部分全外显子关联分析NM23在肝癌转移复发机制的初步探讨目的:利用公共数据库及全外显子关联分析探讨HCC组织中抗肿瘤转移基因NM23(NME/NM23nucleosidediphosphatekinase1，NME/NM23核苷二磷酸激酶1)表达水平和相关影响遗传因素。材料与方法:通过多平台表达谱数据库分析NM23在HCC组织癌和癌旁表达差异并评估其组织区分能力及预后价值。利用全基因组表达数据进行GSEA分析对NM23表达水平在HCC发生发展进程涉及基因、通路进行探索。纳入从2005年至2013年在广西医科大学第一附属医院住院治疗的424例行NM23免疫组织化学染色检查的HBV相关HCC患者，利用全外显子芯片扫描组织样本得到SNPs（singlenucleotidepolymorphismsites，单核苷酸多态性位点）信息，经关联分析及生物信息学处理质量控制后样本和SNPs获取影响NM23表达候选SNPs及母本基因。利用回归模型分析候选SNPs及单倍体探讨其与NM23表达水平的关联，生存分析评估候选SNPs、单倍体及母本基因在HBV相关HCC患者的预后价值。运用GTEx数据库对候选SNPs组织中的表达数量性状基因座进行定位及转录水平分析。结果:在28个HCC数据集中，26个数据集的HCC癌组织NM23表达水平高于癌旁组织，ROC曲线分析显示其中25个数据集NM23表达水平在诊断HCC癌组织具有高的区分度且有统计学差异（P＜0.05）。GSEA显示NM23对HCC转移抑制体现在RNA转录及蛋白翻译过程。对质量控制后筛选的候选样本及SNPs进行全外显子关联分析，确定了位于候选基因PSORS1C1基因6个位点和STARD3基因2个位点为候选SNPs。有序分类logistics回归分析结果提示候选SNPs及单倍体对NM23表达水平具有累积效应。候选基因PSORS1C1与NM23表达水平呈负相关，而STARD3与NM23表达水平为正相关关系（P＜0.05）。生存分析显示候选基因PSORS1C1上的SNP位点rs541820233、rs556285588、rs560052000和rs3095301与HBV相关HCC患者预后相关，不同基因型及单体型在总生存和无瘤生存中预后存在差异（P＜0.05）。经GTEx数据库筛选，候选SNPs位点rs1877031、rs3095302、rs3131003、rs11869286不同基因型在肝组织中具有表达数量性状基因座关系。结论:候选基因PSORS1C1和STARD3中的SNPs与HBV相关HCC患者的NM23表达水平和临床结局有关，这可能是HCC患者潜在的生物标志物和治疗靶点。收起

关键词 : 肝细胞癌肝切除术真实世界研究临床分期

3. 人肝细胞株HL-7702在HBV-AFB1双暴露下的基因组、转录组特征识别及相关分子机制的初步探索

[学位论文] 王向坤广西医科大学 2021年博士导师: 彭涛共301页

摘要 : 本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功... 展开本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功能实验观察HBX基因功能。材料与方法:将HBX基因的质粒通过活化、筛选、扩增后提取质粒DNA，然后转染到293T细胞内，收集48h及72h病毒液浓缩，然后转染进HL-7702细胞株内，使用潮霉素B抗性筛选从而获得稳转细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及westernblot实验分别验证HL-7702细胞株HBX的表达水平。通过体外功能实验，包括MTT、Transwell、细胞划痕和平板克隆实验观察HBX基因在HL-7702细胞株内细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的变化。结果:1.实时荧光定量PCR及westernblot结果均证明HBX基因已转染进HL-7702细胞株，与空载质粒组和阴性对照组相比，差异达统计学显著性（所有p＜0.05），空载质粒组和阴性对照组组间差异未达到统计学显著性(p＞0.05)。 2.细胞划痕、Transwell、MTT和平板克隆实验结果提示HBX基因过表达对照组细胞的迁移、侵袭、增殖和克隆形成能力均显著高于HBX基因过表达组，差异均达到统计学显著性（所有p＜0.05）。结论:通过慢病毒转染方法已获得稳定表达HBX基因的HL-7702细胞株，HBX呈现出抑癌基因的作用。第二部分全转录组测序识别HBX基因稳转细胞株HL-7702转录组水平分子表达变化及相关机制的初步探索目的:通过全转录组测序识别过表达HBX基因的HL-7702细胞株转录组水平分子表达变化及其相关分子机制的初步探索。材料与方法:提取稳转细胞株RNA样本送公司进行全转录组测序。通过表达水平分析及差异显著性分析并获得差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA分子。将差异表达的miRNA、lncRNA和circRNA进行靶基因预测，通过差异表达mRNA分子和靶基因进行基因本体(geneontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路及反应组(Reactome)通路富集分析，探索这些差异表达分子可能通过何种途径介导HBX基因发挥作用。结果:1.全转录组测序发现的差异表达分子包括285个mRNA(101个上调，184个下调)，9个miRNA（4个上调，5个下调），78个lncRNA(39个上调，39个下调)，117个circRNA（56个上调，61个下调）。 2.差异表达RNA的GO结果主要包括上皮细胞和血管形态发生、血管发育、细胞外基质和结构组织、伤口愈合的调节等;KEGG通路结果主要包括细胞色素P450对异生物素的代谢、类固醇激素的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化等;Reactome通路包括细胞外基质组织、弹性纤维形成和Netrin-1信号等（所有padj≤0.05）。 3.LncRNA靶基因、circRNA靶基因、miRNA靶基因GO富集分析主要包括L-抗坏血酸代谢过程、血清素受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等;Reactome通路富集分析包括异生物素、生物氧化血小板脱粒、粘结蛋白聚糖相互作用等（所有padj≤0.05）。结论:测序结果提示HBX基因可能通过差异表达的RNA分子在上皮细胞和血管形态发生、细胞外基质组织、RNA转运等途径发挥功能。第三部分 HBV相关性差异表达分子的ceRNA网络构建及部分差异表达分子的初步验证目的:通过乙型肝炎病毒相关性差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA分子及分子靶向调节关系构建竞争性内源性RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)网络及通过RT-PCR初步验证部分差异表达的RNA分子。材料与方法:通过差异表达的4种RNA分子及相互调节关系分别构建lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。并且对前10个差异表达的mRNA、全部9个差异表达的miRNA、前5个差异表达的lncRNA分子通过RT-PCR方法进行验证。RNA的相对表达水平使用2-△△CT方法计算。结果:1.构建了lncRNA-miRNA-mRNA分子的包括LINC00670-205/PDCD11-207/-has-miR-3180-3P/has-miR-767-5P/-PDE7A/RPL29等分子在内的ceRNA网络。 2.构建了circRNA-miRNA-mRNA分子的包括has-circ-0007750/has-circ-000620-has-miR-3180-3P/has-miR-3180-RPL29/RPTOR等分子在内的ceRNA网络。 3.10个差异表达的mRNA(PSMD1表达上调，ACACA、GIPC1、ITPR3、MEMO1、PDE10A、PLCB1、PRL29、PTPRM及YES1均表达下调）;5个差异表达的lncRNA（LINC80表达下调，PTK7-215、LINC00511-274、MIR924HG-206、SLC2A3-205均表达上调）;8个差异表达的miRNA(hsa-miR-625-3p、hsa-miR-3615、hsa-miR-625-5p、hsa-miR-6842-3p表达上调，hsa-miR-1268a、hsa-miR-3180、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-767-5p均表达下调）与测序结果一致（所有p≤0.05），但PCR验证的hsa-miR-3180-3p的结果(HBX组高表达)与测序结果相反。结论:HBX基因可能通过差异表达RNA分子构建的ceRNA网络发挥其作用。第四部分 AFB1暴露下未干预组及HBX基因稳转组HL-7702细胞株的单/双暴露细胞株模型构建目的:在已构建HBX基因稳转株HL-7702基础上，构建H-BX和黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)慢性（干预周期≥3月）双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。材料与方法:使用AFB1+NADPH+肝微粒体建立AFB1暴露的细胞株干预体系，肝微粒体与NADPH的比例为0.5mg/ml∶1mmol/L，干预组别为①HL-7702(HBX)+AFB1;②HL-7702(control)+AFB1;（③HL-7702+AFB1，该体系干预细胞24小时后换用完全培养基继续培养24-48小时后再次干预。在HBX-AFB1双暴露及单一AFB1干预1、2、3月后分别提取细胞DNA进行TP53基因第249密码子测序，观察其是否发生突变。结果:1.本研究建立了AFB1干预浓度为0.05、0.02、0.01、0.005mmol/L的浓度梯度，构建了HBX-AFB1慢性双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。 2.在AFB10.05和0.02umol/1干预1月后，细胞株发生了第249密码子（第三位碱基）AGG＞AGT的常见突变。 3.本研究还发现TP53基因第249密码子AGG＞AGA和AGG＞AGC的突变，以及第247密码子AAC＞AGC突变和第250密码子CCC＞ACC突变。结论:本研究构建了HBX-AFB1双暴露及单一AFB1暴露的细胞株模型，此模型出现AFB1暴露引起TP53基因常见位点的突变。收起

关键词 : HL-7702细胞株 HBV-AFB1双暴露 HBX基因转录组特征识别分子机制

4. CK19参与调控广西HBV相关原发性肝细胞癌术后复发的相关分子机制研究

[学位论文] 苏浩广西医科大学 2019年博士导师: 彭涛共276页

摘要 : 研究内容:本研究分为三个部分:1、广西乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝细胞癌复发患者原发瘤及复发瘤癌组织中CK19相对表达量与临床病理特征及临床预后关联分析;2、利用小RNA干扰技术，沉默CK19基因后，分析CK19对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B的生物学行... 展开研究内容:本研究分为三个部分:1、广西乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝细胞癌复发患者原发瘤及复发瘤癌组织中CK19相对表达量与临床病理特征及临床预后关联分析;2、利用小RNA干扰技术，沉默CK19基因后，分析CK19对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B的生物学行为的影响。3、利用高通量测序技术从全转录水平分析CK19基因影响肝癌细胞株Hep-3B生物学行为的差异RNA表达（mRNA/miRAN/lncRNA/cirRNA），并构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络调控，从转录组组学层面探究CK19阳性表达HCC具有更高恶性生物学行为潜在分子机制。第一部分 CK19阳性表达与广西HBV相关原发性肝细胞癌术后复发瘤临床病理特征及临床预后关联分析目的:对比分析广西HBV相关原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)原发瘤与复发瘤之间细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19/KRT19）相对表达差异及临床病理特征与临床预后的关系。方法:收集2002年1月至2017年12月在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术的复发性HBV相关原发性肝细胞癌病例24例，对其HCC原发瘤及复发瘤癌组织进行CK19免疫组化染色，并分析24例HCC患者原发瘤及复发瘤的临床病理因素与CK19蛋白表达的关系及CK19阳性表达对HCC患者预后的影响。结果:24例HCC患者无论原发瘤或是复发瘤，CK19只在癌组织中表达，癌旁组织均未检测到CK19的表达。HCC复发瘤组织中CK19蛋白阳性表达细胞比例高于原发瘤（X2=8.545，P=0.003），差异有统计学显著性，且复发瘤的分化程度与原发瘤的分化程度的差异有统计学显著性(X2=4.128，P=0.047); HCC原发瘤CK19表达阳性的HCC病例其无瘤存活时间较短(P=0.05)。结论:在广西HBV相关HCCCK19阳性表达特殊亚型中，术后肿瘤再次复发时，原发瘤中CK19阳性表达细胞比例更高，原发瘤CK19表达阳性的HCC病例其无瘤存活时间较短，这提示CK19阳性表达可能是肿瘤复发的高危因素。第二部分 CK19对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA沉默CK19基因后对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的影响。方法:将siRNA-CK19片段转染至人肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中沉默CK19基因，然后利用Real-time PCR、Western Blot、细胞免疫组化、流式细胞仪、CCK8、划痕实验、Transwell小室实验检测沉默CK19后对肝癌细胞株增殖、迁移、侵袭、细胞周期与凋亡的影响。结果:转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B经Real-time PCR和Western Blot技术检测后，我们发现针对CK19基因的si-RNA3沉默效果最好。在si-RNA3转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中，沉默CK19基因后，肝癌细胞CK19基因及蛋白表达降低，在肝癌细胞株MHCC-97H中，其垂直、水平迁移及侵袭能力减弱，肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中G2期的细胞含量百分比有增加趋势，且细胞凋亡百分率显著升高。结论:siRNA靶向沉默肝癌细胞株MHCC-97H和Hep-3B中CK19基因后，能显著降低细胞株CK19基因和蛋白的表达，使得G2期的细胞含量及细胞凋亡百分比增加，提示沉默CK19基因后HCC细胞的迁移及侵袭能力显著减弱，并可诱导肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B的细胞周期停滞在G2-M期从而抑制HCC增殖。第三部分基于转录组测序的CK19阳性肝癌细胞株Hep-3B竞争性内源RNA调控网络的构建目的:利用高通量测序技术从全转录水平分析CK19基因影响肝癌细胞株Hep-3B生物学行为的差异RNA表达（mRNA/miRNA/lncRNA/circRNA）,并构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络调控，从转录组学层面探究CK19阳性表达HCC具有更高恶性生物学行为的潜在分子机制。方法:本研究通过在转染siRNA的方法沉默肝癌细胞株Hep-3B细胞CK19基因表达，采用Illumina HiSeq2500平台进行全转录组测序。并利用edgeR、R包clusterProfiler等软件进行相关生物信息学功能注释与富集分析。结果:每个样品完成与参考基因组序列比对，以及lncRNA，circRNA，miRNA以及基因预测。共识别到20066个lncRNA，其中14704个新的lncRNA;3704个miRNA，其中有1806个已知miRNA，1898个新的miRNA;25846个gene，其中有6199个新的gene;并预测得到1668个新的circRNA。对每种RNA进行表达定量并进行差异筛选分析，筛选出1099个lncRNA(601个上调，498个下调)，10个circRNA（4个上调，6个下调），281个miRNA（178个上调，103个下调）和779个mRNA（393个上调，386个下调），并对差异表达的mRNA、circRNA的来源基因、lncRNA的靶基因、miRNA的靶基因进行功能注释和富集分析后构建了基于ceRNA网络的差异lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控关系对。结论:我们通过CK19沉默的肝癌细胞株进行转录组测序分析，发现了潜在的CK19调控肝癌细胞株增殖、细胞周期、凋亡相关的差异表达基因，并构建了相应的ceRNA调控网络，为阐明CK19影响HBV相关原发性肝细胞癌术后复发的相关分子机制提供了方向及策略。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌术后复发病理机制 CK19基因基因表达细胞凋亡

5. 广西乙肝相关原发性肝细胞癌CK7、CK19表达调控相关分子机制的研究

[学位论文] 朱广志广西医科大学 2018年博士导师: 彭涛共265页

摘要 : 本研究分为四个部分:1、广西医科大学单中心乙肝表面抗原阳性的肝细胞癌患者癌组织CK7，CK19表达相关的临床病理特征及预后分析;2、基于GEO数据库GSE14520数据集的肝细胞癌全基因组表达谱数据，对CK7、CK19进行临床病理特征、预后、表达调控和差异性基... 展开本研究分为四个部分:1、广西医科大学单中心乙肝表面抗原阳性的肝细胞癌患者癌组织CK7，CK19表达相关的临床病理特征及预后分析;2、基于GEO数据库GSE14520数据集的肝细胞癌全基因组表达谱数据，对CK7、CK19进行临床病理特征、预后、表达调控和差异性基因分析。3、根据CK7、CK19免疫组化的表达情况，基于全外显子关联分析策略，对CK7、CK19进行遗传变异分析;4、利用小RNA干扰技术，分析MHCC-97H、SMMC-7721对肝癌细胞株中的CK7、CK19的生物学功能。第一部分广西乙肝相关性肝细胞癌CK7、CK19表达的临床病理特征及预后分析目的:调查细胞角蛋白7（CK7/KRT7）和细胞角蛋白19（CK19/KRT19）在乙肝相关性肝细胞癌中表达的临床病理特征及预后分析。材料与方法:研究收集2001年至2013年在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术的病例394例，对癌组织进行CK7、CK19免疫组化染色。分别按总394例、CK7、CK19、CK7/CK19表达分析临床因素对其表达的影响，将CK7、CK19表达情况与随访资料结合起来在上述4组中分析其对预后的影响。结果:394例肝癌组织免疫组化染色CK7表达阳性43例，CK19表达阳性70例。1、在总394例中，CK7、CK19表达与AFP水平相关，CK7阳性表达2年内复发率高于阴性表达者，CK7/CK19双阳表达较双阴表达患者具有差的2年、5年和长期的生存时间和无瘤生存时间。2、在CK7表达情况进行倾向评分匹配(1∶3)分析中，CK7表达与AFP水平相关，CK7阳性表达2年内复发率高于阴性表达者。3、在CK19表达情况进行倾向评分匹配(1∶3)分析中，CK19表达与AFP水平相关，CK19阴、阳表达在2年、5年和长期的生存时间和无瘤生存时间差异无统计学显著性。4、在CK7/CK19表达情况进行倾向评分匹配(1∶3)分析中，CK7/CK19双阳表达较双阴表达患者具有差的2年、5年和长期的生存时间和无瘤生存时间。结论:在乙肝相关性肝细胞癌中，与CK7/CK19表达双阴性的肝细胞癌患者相比，双阳性患者预后较差且复发时间更短，提示CK7/CK19可能是一种是潜在临床预后预测指标。第二部分基于GEO数据库GSE14520数据集的CK7、CK19表达的肝细胞癌全基因组表达谱数据分析目的:通过分析GEO数据库GSE14520全基因组表达谱芯片数据集，从转录水平探索CK7、CK19在HCC中潜在的分子调控机制。材料与方法:通过核对GSE14520数据集中患者的临床资料，212例具有乙肝背景的肝细胞癌患者纳入本研究，对CK7和CK19分别按本研究第一部分阳性率(by rate)和表达谱的中位数(by median)分组进行分析，我们将下载的芯片矩阵数据进行处理，与对照组进行聚类分析，筛选不同分组之间的差异表达基因，进行基因功能富集分析、信号通路富集分析、构建基因间相互作用网络，同时将CK7、CK19表达情况与随访资料结合起来在上述2组中分析其对预后的作用。结果:根据不同分组，我们对GSE14520数据集挖掘CK7和CK19高、低表达时的差异表达基因，发现在基因、蛋白互作网络中，这些差异性基因与CK7、CK19存在着复杂的相互作用关系。在CK7、CK19表达按第一部分阳性率(by rate)分组分析中，CK19表达与AFP水平相关，CK19表达与BCLC stage相关，CK7和CK19阴、阳表达在2年、5年和长期的生存时间和无瘤生存时间差异均无统计学显著性。在CK7、CK19表达按中位数(by median)分组分析中，CK19表达与AFP水平相关，CK19表达与BCLC stage相关，单因素分析CK19的高表达患者相对于低表达者具有差的生存时间和无瘤生存时间。多因素分析CK7和CK19阴、阳表达在2年无瘤生存时间差异均有统计学显著性。结论:我们挖掘出CK7和CK19高、低表达（不同分组）时的差异表达基因，在基因、蛋白互作网络中，这些差异性基因与CK7、CK19存在着复杂的相互作用和共表达关系。第三部分影响乙肝表面抗原阳性的肝细胞癌患者CK7、CK19表达的全外显子遗传多态性关联分析目的:分析CK7、CK19表达不同状态下广西乙肝表面抗原阳性肝细胞癌全外显子多态性及对临床预后影响。材料与方法:对394例乙肝表面抗原阳性肝细胞癌患者全外显子单核甘酸多态性(SNP)基因分型芯片扫描，按CK7、CK19和CK7/CK19进行全外显子关联分析，选取MAF＞0.1，P＜0.001的SNPs位点行临床预后分析，同时将这些SNPs位点所在的基因在GSE14520数据集中按中位数分组进行临床预后分析。结果:在按CK7分组分析显示:rs6930740位点多态性与CK7的表达和生存时间相关。rs1816392位点多态性患者的长期无瘤生存时间相关。在按CK19分组分析显示:rs2288419、rs7516332、rs239259、rs3829868、rs2602381、rs4381746多态性与患者的长期生存时间相关。rs239259多态性与患者的长期无瘤生存时间相关。在按CK7/CK19分组分析显示:rs3781684多态性与患者的长期无瘤生存时间相关。我们将这些SNPs位点所在的基因在GSE14520数据集中按中位数分组进行临床预后分析显示:rs2602381位点所在UGT1A10基因高表达较低表达患者具有长的生存时间。在GSE14520数据集中UGT1A10基因的低、高表达与患者的长期生存，高表达组比低表达组具更长的生存时间相关。结论:我们通过全外显子数据分析发现不同CK7、CK19表达状态的肝癌存在着差异单核苷酸遗传多态性分布和差异表达基因。虽然以上候选SNPs位点遗传多态性与我们的研究人群的预后存在显著的关联，但仍有待于我们进一步的验证。第四部分 MHCC-97H、SMMC-7721肝癌细胞株中CK7和CK19基因的功能研究目的:探讨siRNA沉默CK7、CK19基因后对肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721的基因表达、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的影响。方法:用分别针对CK7、CK19基因的三种siRNA片段转染至人肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721中，用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测分别检测各细胞株中三种siRNA片段中沉默CK7、CK19基因效果最好的siRNA片段。再分别以该siRNA片段转染至人肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721中，48小时后用实时荧光定量PCR技术检测CK7、CK19基因表达水平，72小时后用Western Blot技术检测CK7、CK19蛋白表达水平，并同时检测基质胶侵袭实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力、流式细胞技术检测细胞周期及凋亡率的变化。结果:实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术分别检测转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721，发现针对CK7基因的si-CK7-C沉默效果最好，针对CK19基因的si-CK19-A沉默效果最好。以这两种片段进行后续实验，在转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721株中，沉默CK7基因后，肝癌细胞CK7基因表达降低、在肝癌细胞株MHCC-97H迁移能力减弱、在SMMC-7721肝癌细胞株中细胞有丝分裂停滞。沉默CK19基因后，肝癌细胞CK19基因表达降低、在肝癌细胞株MHCC-97H迁移能力减弱。沉默CK7和CK19后，肝癌MHCC-97H、SMMC-7721细胞株癌细胞侵袭能力减弱。信号通路分析发现在肝癌细胞株SMMC-7721、MHCC-97H中，通过RT-PCR检测通路中22个基因的相对表达量处于低表达或者失表达状态。结论:siRNA靶向沉默CK7、CK19基因后，能降低CK7、CK19基因的表达。沉默CK7基因后，在MHCC-97H细胞株中细胞迁移减弱、SMMC-7721肝癌细胞株中细胞有丝分裂停滞;沉默CK19基因后在MHCC-97H细胞株中细胞迁移减弱。沉默CK7和CK19后，肝癌MHCC-97H、SMMC-7721细胞株癌细胞侵袭能力减弱。在肝癌SMMC-7721、MHCC-97H细胞株中对影响CK19表达的信号通路分析显示:通路中基因在肝癌MHCC-97H、SMMC-7721细胞株中处于低表达或者失表达状态，这有待于我们进一步寻找合适的肝癌细胞株对影响CK19表达的信号通路的分析。因此CK7和CK19可能是一个在肝细胞癌中有潜在治疗价值的分子靶点。收起

关键词 : 乙肝相关原发性肝细胞癌 CK7基因 CK19基因发病机制

6. 影响广西防城港地区男性人群谷丙转氨酶水平的遗传变异及其在永生化肝细胞株中的验证

[学位论文] 刘征涛广西医科大学 2014年博士导师: 彭涛共265页

摘要 : 第一章第一部分影响广西防城港地区男性人群谷丙转氨酶水平的流行病学因素及其相互作用分析目的：在普通人群中，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)升高通常提示显著的或者潜在的肝脏疾病，甚至会累计对全身健康造成威胁。因此，基于... 展开第一章第一部分影响广西防城港地区男性人群谷丙转氨酶水平的流行病学因素及其相互作用分析目的：在普通人群中，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)升高通常提示显著的或者潜在的肝脏疾病，甚至会累计对全身健康造成威胁。因此，基于广西防城港地区男性人群健康调查( The Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey，FAMHES)的结果，我们评估了影响该地区成年男性人群血清中ALT水平的流行病学因素以及他们之间的相互作用。方法：在4304例受试者中，我们总共纳入了2119例在2009年9月至2009年12月完成了完整的体格检查，实验室检查，肝脏超声检查以及调查问卷的符合纳入标准的受试者数据。结果：在纳入人群中，非酒精性脂肪肝( non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)和代谢综合征(metabolic syndrome，MetS)的患病率显著相关于ALT水平的升高（P＜0.05）。NAFLD和MetS的患病率密切相关（r=0.991，P=0.009）不正常的MetS各组分比例随着ALT水平的升高成比例的明显增加（P＜0.01）。在随后进行的多元线性回归分析中，腹部肥胖指标体重指数(body mass index，BMI)和高脂血症和ALT水平显著相关（P＜0.01）。在乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)和MetS的交互作用研究中，我们并未发现其对于ALT水平有明显交互作用。HBsAg和MetS之间对ALT影响的协同作用系数(synergy index，ST)为0.74，95%可信区间(confidence interval，CI)：0.71-0.80。结论：在防城港地区男性人群中，NAFLD和MetS的患病率显著相关于ALT水平。腹部肥胖和高脂血症是导致ALT水平升高的独立危险因素。这一发现提示在这一地区男性人群中，有必要在检测ALT水平的过程中校正这些可能导致ALT水平升高的危险因素。第一章第二部分针对前瞻性研究的循证医学研究发现谷丙转氨酶水平升高显著相关于代谢综合征的发生目的：代谢综合征(metabolic syndrome，MetS)的发病率在世界范围内显著升高且与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活动水平紧密联系。但是，ALT活动水平对MetS发生率的影响在已发表文献中的报道并不一致。因此，我们针对前瞻性队列研究通过荟萃分析的方法估算了ALT活动水平升高和MetS发生率之间的关系。方法：收集所有已发表在Pubmed，Embase，和ISI数据库中的研究ALT活动水平和MetS发生率之间关系的前瞻性队列研究（文献发表在2014年1月10日之前）。包括研究的国别，性别组成，纳入人群的年龄，随访时间，MetS定义，校正因素，相对危险度(relative risk，RR)等具体指标直接或间接从最终纳入文献中提取或计算。我们将分别估计二分类变量的合并RR值及其95%可信区间(confidence interval，CI)（RR定义为高ALT水平组人群MetS发生率／低ALT水平组人群MetS发生率）和连续变量的合并RR值及95%CI (RR走义为ALT水平每升高5单位每升[unit per liter，U/l]人群中MetS发生率变化的比值)。如果组间异质性不明显（P值＞0. 05以及I2＜50%），在计算合并RR值的过程中则采用固定效应模型；如果组间有显著的差异性(P值≤0.05或I2≥50%)，则采用随机效应模型。结果：总共七篇前瞻性队列研究，包含了31545例受试者和2873例在随访期间发生MetS的病例被纳入本次研究。在比较高值ALT水平和低值ALT水平人群MetS发生率的差异中，合并估计的RR值为1.81 (95%CI：1.49-2. 14)。而在剂量一反应计算估计ALT水平每升高5 U/l导致人群MetS发生率的变化中，合并估计的RR值为1.13(95%CI：1.11-1.16)。亚组分析发现性别差异可能是整个研究中异质性的主要来源。在以性别为标准的亚组分析中，亚组之间剂量一反应（每5 U/l）估算的合并RR值比较P=0.007。女性有比男性更高的剂量反应RR (1.38，95%CI：1.20-1.55)。进一步的，敏感度分析证实了结果的可靠性。本次荟萃分析并未发现显著的发表偏倚。结论：目前基于前瞻性研究的循证医学证据支持ALT水平升高增加MetS发生风险的观点。且这种关联在女性人群中表现得更加紧密，一致性更好。这一关系有待更多的研究证实。同时ALT水平升高对MetS发生的潜在机制研究也有待进一步探索。第二章全基因组关联研究发现新的影响广西防城港地区男性人群中血清谷丙转氨酶水平的单核苷酸多态性位点及其生物信息学意义分析目的：谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)是评估肝脏疾病和全身健康的重要的生物标志物。ALT水平受到环境因素和遗传因素的共同影响。因此我们实施了一项全基因组关联研究( genome-wide association studies，GWAS)，结合前期防城港地区男性健康调查 (Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey, FAMHES)结果，找出影响防城港地区男性健康人群的ALT水平的常见遗传学变异及其与环境因素的交互作用。方法：采集研究人群的外周静脉血检测血清提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)样本。在前期FAMHES纳入的人群中，总共1999例健康男性的外周血样进行全基因组单核苷酸多态性( Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)检测，平台为Illumina Omni One。在全基因组SNPs分型的基础之上，采用校正了年龄，体重指数(body mass index，BMI)，甘油三酯(triglycerides，TG)变量的多元线性回归模型，寻找可能影响该地区男性人群ALT水平的常见遗传变异标志。进一步地，全基因组关联分析在以乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)为分类标准的亚组中进行比较。全基因组关联分析统计学检验显著性水平的检验标准为P＜1*10-5，在乙肝表面抗原( hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性人群中的统计学检验显著性水平的检验标准为P＜0.05。基因分型的质量控制标准：满足哈一温平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE检验P＞0.001）;最小等位基因频率＞0.01；基因分型成功率(call rate)＞0.95。采用非参数检验(Mann-Whitney Test)的方法比较以HBsAg和MetS分类的亚组中不同SNP基因型之间的ALT值。最后，采用交互作用的流行病学模型，结合潜在遗传变异和常见的影响ALT水平的表型因素（包括代谢综合征[metabolic syndrome，MetS]和乙肝病毒[hepatitis B virus，HBV]感染），评估遗传变异和表型因素之间的交互作用。结果：本次GWAS总共发现位于5个基因区域的7个SNPs经全基因组关联分析统计学检验后，显著性水平P＜1*10-5，包括：位于SLC35F3基因lq42.2上的rs10157061 (P=7.46*10-7),rs10752781 (P=1.29*10-6),rs1878544 (P=2.16*10-6)；位于 CUX2 基因 12q24. 12 上的rs4766453(P=1.11*10-6)；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847(P3.26*10-6)；位于wwox基因上16q23.3上的rs2010020 (P=7. 73*10-6)；位于CYPIA2基因15q24.1的rs3743484（P=8.20*10-6）。其中位于2个基因区域的4个SNPs（位于SLC35F3基因lq42.2上的rs10157061，rs10752781，rs1878544；位于CUX2基因12q24. 12上的rs4766453)经全基因组关联分析统计学检验后显著性水平P＜3*10-6。在HBsAg阳性人群中，位于SLC35F3基因lq42.2上的rs10157061，rs10752781，rs1878544；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020;位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484同时达到在HBsAg阳性人群中的统计学效力（P＜0.05）。在结合SNP基因型和MetS，HBsAg表型分组的的亚组分析中，各亚组间人群ALT值仍然SNP基因型的变化而有所差异（P＜0.05）。我们发现潜在意义较大(P＜3*10-6)的候选SNPs（包括位于SLC35F3基因lq42.2上的rs10157061， rs10752781，rs1878544;位于CUX2基因12q24. 12上的rs4766453）和阳性HBsAg之间对ALT水平的影响的协同效应系数[synergy index，SI]及其95%可行区间(confidence interval，CI)均大于1。结论：因此，一项针对防城港地区成年男性人群的GWAS发现了新的影响人群血清中ALT水平的常见遗传变异标记。其中SLC35F3和CUX2可能是影响该地区成年男性血清ALT水平的易感基因。但是这种效应可能因为人群的肝炎病毒感染背景不同而有所不同。SNPs对人群ALT水平的影响可能会在HBV感染的背景下扩大。候选SNPs及其所在基因区域为个体化医学诊断和治疗提供了潜在的遗传学标记。同时为下一步的验证ALT水平的遗传学机制提供了有意义的靶点。潜在SNPs及其所在基因区域对ALT水平的影响机制有待进一步研究证实。第三章第一部分全基因组关联研究发现的新的影响防城港地区男性人群血清谷丙转氨酶水平的单核苷酸多态性位点在永生化肝细胞株中的验证目的：基于前期针对防城港地区男性健康调查( Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey，FAMHES)人群全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)的结果，我们发现了新的影响防城港地区健康男性血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。但是GWAS发现的SNPs与表型特征之间可能存在假关联。因此，我们选取永生化肝细胞株为研究对象其中候选SNPs与其上清液ALT水平之间的关联关系。同时对SNPs坐落的基因，GPT基因（肝脏ALT编码基因）及其编码蛋白表达水平进行检测，在细胞株层面探讨候选SNPs坐落基因及其编码蛋白的表达水平与GPT基因及编码蛋白表达水平及各细胞株表型（即各细胞株上清液ALT水平）之间存在的关系。方法：选取BEL-7402，BEL-7404，HL-7702，SMMC-7721，Hep-G2，MHCC-97H，MHCC-97L共7株永生化肝细胞株作为研究对象，通过细胞培养繁殖，消化贴壁细胞后提取细胞用做以下实验：1．提取细胞脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)，针对目的SNPs设计普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物，通过P 收起

关键词 : 男性人群谷丙转氨酶遗传变异永生化肝细胞株

7. Ⅰ.肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用；Ⅱ.丙型肝炎病毒永生化树鼩肝细胞培养系统构建初探

[学位论文] 李新磊中国科学院大学 2013年博士导师: 彭涛共224页

摘要 : Ⅰ.肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用研究丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的慢性传染性疾病。HCV的生活周期与宿主脂代谢密切相关，尤其是HCV病毒颗粒包装进入极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprote... 展开 Ⅰ.肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用研究丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的慢性传染性疾病。HCV的生活周期与宿主脂代谢密切相关，尤其是HCV病毒颗粒包装进入极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)颗粒中，通过胞吐作用释放至胞外。肝细胞核因子-4α(hepatocyte nuclear factor-4α，HNF4α)属于核因子超家族成员，是表达量最高的肝富集转录因子(liver-enriched transcription factor,LETF)，在成熟肝细胞内HNF4α主要参与宿主的脂代谢调控，尤其是VLDL的合成和分泌。但HNF4α是否参与了HCV的生活周期尚不清楚。本篇文章对HNF4α在HCV生活周期中的作用进行了详细研究。我们首先发现HCV复制可以上调HNF4α的表达，而HNF4α过表达可以增加感染性HCV的产生。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导的HNF4α敲低表达可抑制HCV的包装和释放而不影响HCV的进入和RNA复制过程。HNF4α的抑制剂苯扎贝特（bezafibrate）也可以显著抑制HCV的包装和释放。故HNF4α是HCV病毒颗粒包装和释放必需的胞内因子。我们进一步发现HNF4α的下游因子分泌型磷脂酶A2 GXIIB(PLA2GXIIB)在HCV生活周期中发挥作用。HCV感染可以在转录水平上调PLA2GXIIB的表达，HNF4α介导了这种上调作用。敲低PLA2GXIIB后HCV的释放过程受抑制，而过表达PLA2GXIIB可以增加感染性HCV的分泌，故PLA2GXIIB是HCV病毒释放必需的因子。进一步研究发现HNF4α对HCV滴度的调节是通过下游的PLA2GXIIB和微粒体甘油三酯转运蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTP)共同实现的。敲低HNF4α后胞内脂滴的数目降低，体积变大，这种细胞器结构的改变可能是HNF4α影响HCV病毒产生的机制之一。本研究发现了HNF4α在HCV包装和释放过程中的重要作用，进一步证实了宿主VLDL通路与HCV生活周期的密切关系。我们的结果显示HNF4α可能是HCV挟持宿主VLDL代谢通路的关键调控因子。HNF4α和PLA2GXIIB等与宿主VLDL合成和释放相关的因子可以成为HCV治疗药物的候选靶点，为进一步优化抗HCV疗法提供借鉴。 Ⅱ.丙型肝炎病毒永生化树鼩肝细胞培养系统的构建初探自1989年发现HCV基因组以来，HCV研究的主要障碍在于缺乏合适的细胞培养系统以及小动物模型。HCV小鼠模型是目前研究的重点，敲除了天然免疫通路相关因子的小鼠中表达人源HCV受体基因可以支持HCV的感染、复制、病毒颗粒的释放。但由于天然免疫通路缺损，该小鼠并非真正意义上的免疫正常的小鼠。HCV不能在该小鼠中建立慢性感染。此外，HCV对该小鼠的感染效率非常低，感染后血清中HCV的滴度也非常低，这说明真正实用的HCV小动物模型仍没有完全建立。树鼩(tupaia belangeris，Tree Shrew)分类上接近灵长目动物。研究表明我国特有的树鼩品种——中国树鼩（tupaia belangeri chinensis）可以支持HCV的感染:血清或细胞培养的HCV病毒感染树鼩可建立长期感染，并可检测到肝脏组织病变;原代树鼩肝细胞(Primay Tupaia Hepatocytes，PTHs)接种了血清来源的或细胞培养来源的HCV病毒后可产生有感染力的病毒颗粒。树鼩由于是HCV的天然宿主，且免疫系统正常，所以是非常有潜力的HCV小动物模型。HCV对树鼩的感染效率比较低，原因可能与宿主的偏好性有关。由于HCV基因组的高度变异性，可以通过体外筛选的方法构建树鼩偏好的HCV毒株。原代树鼩肝细胞虽然可以支持HCV的整个生活周期，但原代树鼩肝细胞在体外不能传代增殖限制了它的应用。我们将分离的PTH通过慢病毒载体介导的基因转移，将猿猴空泡病毒SV40大T抗原(SV40LT)基因和人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)转入细胞，经筛选得到了永生化树鼩肝细胞系(ImmortalizedTupaia Hepatocytes，ITHs)。我们对ITH细胞的形态、生长曲线、致瘤性、核型、肝细胞特异的分子标记等进行了研究，确证了ITH细胞的肝细胞属性。ITH细胞可以支持HCVpp感染，并且表达CD81、B类Ⅰ型清道夫蛋白受体(scarvengerreceptor class B,typeⅠ,SR-BI)、claudin-1(CLDN1)、occludin(OCLN)、低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)、转铁蛋白受体1(transferrinreceptor1，TfR1)、C型1类Niemann-Pick样蛋白1(Niemann-Pick C1-like1，NPC1L1)等HCV受体。我们克隆得到了树鼩来源的CD81、SR-BI、CLDN1、OCLN，测序表明它们与人源的蛋白有很高的序列相似性。ITH细胞可以支持HCV RNA的翻译起始过程，但不能有效支持HCV RNA的复制。ITH细胞内小RNA-122(microRNA-122，miR-122)的表达量很低，这可能限制了ITH细胞内HCV RNA的复制效率。树鼩来源的载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)分子支持HCV的包装和释放，发挥与人源的ApoE相当的功能。我们目前没有成功构建ITH细胞来源的HCV培养系统，但我们的研究为成功完成这一目标奠定了基础。除此之外，ITH细胞可以支持HSV，HBV的感染，表明ITH也可以称为潜在的其他病毒的培养系统。收起

关键词 : 肝细胞核因子丙型肝炎病毒极低密度脂蛋白分泌型磷脂酶病毒释放载脂蛋白E

8. 财政分权的宏观经济效应研究

[学位论文] 刘洵西南财经大学 2022年博士导师: 彭涛共213页

摘要 : 改革开放以来，中国经济创造了前所未有的“增长奇迹”，传统经济学将其归因于物质和人力资本积累、资源禀赋、技术革新等，但这并不能充分有效地解释中国经济增长的“奇迹”。然而，制度变迁的引入，为解释中国的“增长奇迹”提供了新的研究方向，经... 展开改革开放以来，中国经济创造了前所未有的“增长奇迹”，传统经济学将其归因于物质和人力资本积累、资源禀赋、技术革新等，但这并不能充分有效地解释中国经济增长的“奇迹”。然而，制度变迁的引入，为解释中国的“增长奇迹”提供了新的研究方向，经济增长是经济环境中个体最优化决策的结果。因而，在经济高速增长表象的背后，必然有与之相适应的制度安排来激励经济社会中个体的行为。但是，中国的制度模式明显区别于西方经济增长研究中的传统制度范式。因此，探寻中国独特的制度因素已成为解释中国经济增长“奇迹”的重要方向。中央和地方政府之间的财政关系是涵盖国家政体和经济社会整体发展的一个重要方面。其中，以财政分权为主的财税体制改革是中国财政体制改革的一个关键环节，中央与地方政府之间的财政关系作为改革过程中的关键点，引起了政府和社会各界的广泛关注。自十八届三中全会以来，在预算制度、税收制度、财政体制三个方面构建的现代财政制度框架下，以处理好中央和地方政府之间的财政关系为核心的财政体制改革成为首要任务。因此，构建一个多级政府框架，该框架能够更好地呈现财政分权的特征、中央与地方政府财政支出的异质性，反映出不同财政支出结构的理论模型，成为涉及中央与地方政府之间的财政关系理论研究的重要内容。本文共有7章内容，基于以经验事实说明问题、构建模型分析问题和提出政策建议解决问题的思路，研究财政分权对产业结构、经济波动和环境政策的影响及传导机制，并且通过反事实分析和福利分析评价政策效果。第一章为绪论。阐述了本文的研究背景和研究意义，描述了本文的主要研究内容，概括了本文所使用的主要研究方法，总结了本文的创新点与不足之处。第二章为文献综述。首先，梳理了财政分权理论的发展。其次，概述了国内外财政分权的宏观经济效应研究现状。最后，对现有相关文献进行述评，总结现有相关文献的缺陷或者需要改进之处，以此突出本文的研究价值。第三章为中国财政分权理论的实践。简单地介绍了新中国成立至改革开放时期实行的高度集中财政体制、改革开放初期的分级包干财政体制和1994年至今的分税制财政体制，并且深入分析了各阶段财政体制的影响。第四章为城乡异质性与财政分权的宏观经济效应。首先，通过SVAR模型分析政府城镇投资支出和政府农村投资支出的宏观经济效应经验事实，为政府投资支出对总产出的正外部性这一关键性假设提供经验事实支撑。其次，在新凯恩斯DSGE模型的基础上，充分考虑了中国城乡二元经济结构特征，在模型中嵌入了企业异质性特征，即将厂商划分为城镇厂商和农村厂商，并且在城镇部门和农村部门的生产函数中分别引入了政府投资支出对总产出的正外部性，依据分税制特征，考察了中央和地方政府财权与事权的“分成”比例，由此构建了一个简单的多级政府新凯恩斯DSGE模型。第五章为财政分权、地方政府行为与政府支出乘数。首先，通过SVAR模型分析政府投资支出和政府消费支出的宏观经济效应经验事实，为政府投资支出对总产出的正外部性和政府消费支出与居民消费之间存在互补关系这两个关键性假设提供经验事实支撑。其次，在第四章的多级政府新凯恩斯DSGE模型的基础上，进一步在代表性家庭的效用函数中引入了政府消费支出与居民消费之间存在互补关系，在地方政府的目标函数中引入了地方政府对追求经济增长和政府部门自身消费的偏好，并引入了多级政府财政支出和税收扭曲对债务规模的内生反应机制，该模型较好地刻画了财政收入分权和财政支出分权特征。第六章为财政分权、地方政府行为与环境政策的宏观经济效应。首先，在第四章多级政府新凯恩斯DSGE模型的基础上，引入环境污染对代表性家庭效用的负向影响，政府环境治理以外的支出对总产出的正外部性，财政收入分权和财政支出分权等特征，在地方政府的目标函数中引入地方政府对追求经济增长和环境治理的双重偏好。其次，利用1996年第1季度至2021年第4季度的相关数据，运用贝叶斯极大似然估计模型参数，深入分析地方政府财政支出偏好于非环境治理支出背后的动机和环境政策的宏观经济效应。最后，在基准模型的基础上，进一步讨论财政支出分权度和财政收入分权度变化的反事实分析以及福利分析。第七章为研究结论、政策启示和展望。概括本文的研究结论，为现代财政制度的建立提供政策参考，展望未来的研究重点。本文得到如下研究结论：第一，财政分权、地方政府行为与政府支出乘数的研究发现：（1）政府投资支出对总产出具有显著的正外部性，同时对居民消费和居民投资产生“挤入”效应，但地方政府投资支出的正外部性大于中央政府投资支出的正外部性。政府投资所产生的总供给效应可以有效地抑制通货膨胀。政府消费支出在短期内对居民消费产生“挤入”效应；而在长期，负的财富效应会完全“挤出”居民消费。政府消费支出的增加有益于刺激经济增长，但值得注意的是政府消费支出会“挤出”居民投资，从而不利于资本存量的增长。在不完全竞争和价格粘性的市场特征下，政府消费支出的暂时性增加扩张了总需求，导致价格水平上升，因此通货膨胀率在短期上涨。此外，居民投资的减少引起资本收益率的提高，从而边际成本上升，也会导致在短期出现通货膨胀。（2）深化财政分权使得多级政府支出结构冲击对宏观经济变量在短期的波动幅度更大，总产出、居民消费和投资将会进一步增加。第二，城乡异质性与财政分权的宏观经济效应研究发现：（1）在财政分权体制下，政府农村投资支出的正外部性比城镇投资支出的正外部性更大。地方政府投资支出对于刺激经济增长和拉动就业的效果比中央政府投资支出对于刺激经济增长和拉动就业的效果更加明显。政府城镇投资支出的增加会恶化产业结构失衡，而农村投资支出增加则有益于缓解产业结构失衡。（2）深化财政分权后，政府投资支出的正外部性将进一步增强，总产出、城镇部门产出和农村部门产出会持续增长。然而，政府城镇投资支出所产生的负财富效应也会更大，居民消费和居民投资在短期的下降幅度更大，而劳动供给在短期增加。第三，财政分权、地方政府行为与环境政策的宏观经济效应研究发现：（1）地方政府环境治理以外支出对产出的正外部性在短期略大于中央政府环境治理以外支出对产出的正外部性。征收碳排放税使得厂商面临边际成本增加，生产意愿下降，从而导致产出下滑。政府支出增加会造成环境污染，主要是由于总产出的增加导致碳排放增加。地方政府环境治理以外支出对环境的污染程度大于中央政府环境治理以外支出对环境的污染程度，但中央政府环境治理支出对环境污染的改善作用要强于地方政府环境治理支出对环境污染的改善作用。征收碳排放税有益于环境污染程度的改善，主要是因为征收碳排放税会导致产出水平下降，从而碳排放量也会随着产出水平的下降而降低。（2）深化财政支出分权强化了地方政府财政支出冲击对总产出的正向作用，但抑制了中央政府财政支出冲击对总产出的正向作用。碳排放税冲击对产出的负向影响会随着财政支出分权度的增加而进一步增加。本文的研究结论意味着如下政策含义：第一，基于对财政分权的宏观经济效应研究，本文认为当前的财政分权体制和以GDP为主的政绩观是导致地方政府支出更加偏好于投资支出以追求地区经济增长最主要的动机。因而，进一步完善政绩考核机制，适当提高环境治理、生态保护等民生指标在官员晋升考核体系中的比重极为重要。第二，多级政府财政支出乘数的结果表明，尽管地方政府财政支出效果优于中央政府财政支出效果，但地方政府将大量的财政资金用于投资支出所滋生的重复建设、腐败和生态环境等问题也值得去思考。第三，更进一步厘清中央和地方政府财权和事权范围，激励地方政府调整支出结构，兼顾经济与民生协调发展，规范地方政府非税收入，使中央和地方政府财权与事权相匹配，是构建现代财政制度的一个重要突破口。第四，加大农村财政支出力度，为乡村振兴战略的实施提供更有力的财力保障，不断完善农村基础设施建设，逐渐消除城乡二元经济结构。第五，制定合理的排污收费标准，加强排污监测与管理，逐步完善环境规制。在强化财政分权对促进地区经济增长的同时，逐步削弱财政分权所造成的环境负效应。本文存在如下三个方面的创新点：第一，本文以财政分权为视角，基于DSGE分析框架，考虑中央政府对地方政府的晋升激励和经济激励进而影响地方政府的财政支出结构，深入分析多级政府部门财政支出结构和税收扭曲对主要宏观经济变量的动态效应。同时，通过定义多级政府部门的财政支出乘数，定量分析多级政府部门的政府投资支出和政府消费支出的乘数大小。第二，本文以财政分权为视角，基于DSGE分析框架，考虑了中国典型的城乡异质性特征，研究多级政府部门投资性财政支出作用于农村部门和城镇部门时，主要宏观经济变量的动态特征。同时，通过定义总量支出乘数和结构性支出乘数，定量分析政府支出对各部门及总产出受到的影响。第三，本文通过构建一个多级政府新凯恩斯E-DSGE模型，该模型包含环境污染对代表性家庭效用的负向影响、政府环境治理以外的支出对产出正外部性、财政收入分权和财政支出分权等特征，在地方政府的目标函数中引入地方政府对追求经济增长和环境治理的双重偏好。以此探索在财政分权制度背景下，中央政府如何影响地方政府行为和地方政府财政支出偏好于环境治理以外支出背后的动机和环境政策的宏观经济效应。收起

关键词 : 财政分权制度支出结构城乡异质性宏观经济效应

9. 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究

[学位论文] 余廷东广西医科大学 2019年博士导师: 彭涛共204页

摘要 : 本文主要从以下几方面展开论述：第一部分黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究目的:研究黄曲霉毒素B1(AFB1)在肝微粒体代谢后的次级代谢产物对肝细胞株HL-7702的影响方法:AFB1+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体(1.... 展开本文主要从以下几方面展开论述：第一部分黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究目的:研究黄曲霉毒素B1(AFB1)在肝微粒体代谢后的次级代谢产物对肝细胞株HL-7702的影响方法:AFB1+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体(1.5mg/mL最终浓度)与PBS混合，放入37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育30分钟，获得AFB1在肝微粒体代谢后的次级代谢产物混合液。将上述混合液干预人肝细胞株HL-7702，培养箱中孵育30分钟，PBS清洗三遍后加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养液继续培养。用MTT法检测24小时至96小时不同浓度AFB1对细胞株HL-7702的生长活性的影响。用流式细胞仪检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株周期和凋亡情况。酶联免疫法检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)变化。Sanger法对AFB1干预后96小时的HL-7702细胞株进行TP53R249S突变检测。数据统计和计算采用SPSS22.0软件包，作图使用GraphPadPrism6.0软件。符合正态分布的计量资料的描述使用均数土标准差进行描述。用t检验对正态分布的计量资料分组之间进行比较。P＜0.05为统计学差异达到显著性。结果:1.MTT结果显示:HL-7702细胞在AFB1处理后24小时和48小时，实验组(AFB1浓度为:0.001μM，0.005μM.0.025μM，0.125μM，0.625μM，1.25μM和2.5μM)、阳性对照组及空白对照组之间细胞增殖活性无显著性差异，于AFB1处理后72小时至96小时，各组细胞增殖活性出现显著差异，不同浓度的AFB1处理的HL-7702细胞增殖活性均有不同程度降低，AFB1浓度越大，细胞增殖活性越低。细胞培养至96小时，正常细胞组、对照组和AFB1浓度为0.001μM组间细胞增殖活性差异统计学无显著性(P＞0.05)，其余各组之间细胞增殖活性差异有显著性(P＜0.05)。 2.流式细胞技术检测浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞G1-G0期或G2-M期比例与浓度为0.02μM组比较均有显著差异(P＜0.05)。而浓度为0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组比较，无显著差异。结论:AFB1在肝微粒体代谢后的产物抑制人正常肝细胞株HL-7702生长活性并导致G2/M细胞周期停滞，并呈浓度相关性;但AFB1在2μM及以下浓度短期干预未引起HL-7702细胞早期凋亡。 AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53R249S第三位碱基G突变成T 第二部分黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析目的:用全转录组测序技术检测AFB1对肝细胞株HL-7702影响的全转录组变化情况，并进行显著差异表达的转录组进行分析。方法:实验组用AFB1(0.2μM)+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度），对照组用肝微粒体+NADPH，放入恒温培养箱中孵育30分钟，孵育后混合液干预HL-7702细胞30分钟，PBS清洗三遍，然后加入完全培养液继续培养48小时。胰酶消化，收集细胞，标注标签，液氮速冻，干冰运输至检测公司进行全转录组测序和测序数据分析。结果:通过全转录组测序，发现AFB1影响肝细胞株HL-7702以下转录组显著差异表达: 1.1027基因mRNA显著差异表达，其中上调432个，下调595个，GO富集分析显示，AFB1引起mRNA显著差异表达的基因主要参与了调控细胞周期、增殖、凋亡、粘附、代谢、细胞化学刺激反应、DNA损伤修复和血管生成等生物学进程。KEGG通路分析提示AFB1可能影响TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK信号通路等。 2.显著差异表达lncRNA共29个，其中上调15个，下调14个。结论: AFB1显著影响肝细胞株HL-7702的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的表达，对其显著差异表达的基因进行富集分析显示:差异基因参与了细胞周期、增殖、凋亡、粘附和DNA损伤修复等生物学进程。并可能参与调控TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK等信号通路。第三部分黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析目的:在转录组水平探索AFB1对肝细胞株HL-7702影响的各转录组变化之间的关联性及其可能的相互调控机制。方法:分析材料来源于论文第二部分全转录组测序数据。使用Novofinder（诺禾致源）、miRanda-3.3a、PITA、RNAhybrid、psRobot、GOSeq-topGO:Release2.12、KOBAS: version2.0、 Cytoscape等软件对显著差异表达的全转录组数据进行关联分析，并构建ceRNA调控网络。结果:1.AFB1影响细胞株HL-7702显著差异表达的29个lncRNA和mRNA显著差异表达的757个基因之间有共存或共表达的关系。其中lncRNAs上调，伴随mRNA上调的靶基因有234个;lncRNAs下调，伴随mRNA下调的靶基因有439个。功能富集分析提示这些差异基因和细胞周期的调节、分化、细胞代谢、DNA重组及损伤修复有关，并和P53信号通路、癌症相关信号通路相关。 2.AFB1可能影响HL-7702细胞以下lncRNA与miRNA之间的调控:CDKN2B-AS1与hsa-miR-122-5p和hsa-miR-455-3p，CTD-3014M21.1与hsa-miR-411-5p和hsa-miR-3591-3p,LINC00162与hsa-miR-3591-3p和hsa-miR-494-3p,PP7080与hsa-miR-122-5p和hsa-miR-3690,PSMA3-AS1与hsa-miR-455-3p和hsa-miR-411-5p,RP11-658F2.8和hsa-miR-31-5p,SBF2-AS1与hsa-miR-411-5p, SCARNA9与hsa-miR-379-5p。结论:全转录组关联分析提示AFB1影响HL-7702细胞的lncRNA，miRNA，circRNA和mRNA之间存在相互调节关系。用显着差异表达的miRNA(hsa-miR-455-3p,hsa-miR-411-5p,hsa-miR-31-5p; hsa-miR-122-5p,hsa-miR-3690，hsa-miR-3591-3p)构建出六个lncRNA-miRNA-基因调控网络。第四部分黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证目的:利用论文第二部分全转录组差异表达数据和TCGA数据库TP53R249S突变与不突变的HCC显著差异的表达谱进行联合分析，挖掘AFB1与TP53 R249S突变HCC具有共同作用的分子标志物。研究它们在HCC中TP53 R249S突变的作用，探索AFB1在其相关性HCC的发生及疾病进展的机制。方法:从TCGA数据库获取HCC的表达谱(mRNA、lncRNA和miRNA)、临床病理及预后资料，以TP53 R249S突变与否进行分组，获取显著差异的表达谱信息，然后与论文第二部分差异表达的全转录测序数据进行联合分析，取交集获得候选差异表达谱信息。并在本中心已完成TP53 R249S突变测序的HCC样本进行验证，分析其与临床病理及预后之间的关系。利用GO和KEGG进行分子生物学功能及相关通路机制预测。TCGA原发性肝癌表达谱数据表达差异分析采用EdgeR软件包处理。结果:1.AFB1干预后HL-7702细胞株的全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显著差异表达的基因，包括上调基因:CTXN1、CDCP1、CALB2;下调基因:CRYAB、ENO3、GPRC5A。未发现有共同显著差异表达的lncRNA或miRNA。 2.独立样本验证中发现CDCP1、CALB2、CRYAB、ENO3和GPRC5A5个基因在癌组织中mRNA表达水平低于癌旁组织(P＜0.05)，在TP53 R249S突变的癌组织中CALB2、CRYAB和GPRC5A的mRNA表达水平要高于TP53非突变的癌组织(P＜0.05)。结论:全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显著差异表达的基因，包括CTXN1、CDCP1、CALB2、 CRYAB、ENO3、GPRC5A。其中CALB2、CRYAB和GPRC5A可能参与TP53基因调控以及与TP53 R249S突变相关。TP53R249S突变与HCC患者不良预后有关。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌发病机制黄曲霉毒素B1 TP53基因基因突变转录组学

10. Ⅰ.转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究；Ⅱ.丙型肝炎病毒Vero细胞培养系统建立初步研究

[学位论文] 蔡华中国科学院大学 2014年博士导师: 彭涛共193页

摘要 : Ⅰ.转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究正链RNA病毒与宿主脂代谢密切相关。HCV是正链RNA病毒黄病毒科一个成员，HCV利用宿主脂代谢促进自身感染并造成代谢相关的疾病。HCV利用宿主极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）通... 展开 Ⅰ.转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究正链RNA病毒与宿主脂代谢密切相关。HCV是正链RNA病毒黄病毒科一个成员，HCV利用宿主脂代谢促进自身感染并造成代谢相关的疾病。HCV利用宿主极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）通路进行自身的包装与释放。转录共激活子PGC-1α(Peroxisome prolif-erator-activated receptor gamma coactivator1-alpha)是细胞能量代谢的中枢分子，能够与肝细胞核因子HNF4α(hepatocyte nuclear lipoprotein)等结合调控细胞的能量代谢和脂代谢，尤其是VLDL通路。但是PGC-1α与HCV的关系还不清楚。本论文第一部分对PGC-1α与HCV关系进行系统性的研究。第一章中我们阐明PGC-1α对HCV生命周期的影响及其机制;第二章中我们深入探索HCV调控PGC-1α的机制。在第一章研究中，首先我们发现PGC-1α可以调控HCV病毒的产生。其次，我们发现PGC-1α可以与HNF4α结合，协同调控HCV的生命周期。再次，我们发现PGC-1α和HNF4α共同的下游的细胞凋亡诱导效应因子B(cell death-inducing DFFA-like effector b，CiDeB)参与了HCV生命周期，具体是HCV的复制和包装阶段。更深入的研究发现，CiDeB影响HCV是通过与HCV的NS5A和NS2蛋白相互作用实现的。我们利用酵母双杂交确定CiDeB N端与NS5A DⅡ区域对二者的相互作用是必需的。此外，对其他正链RNA病毒分析发现，CiDeB也能对黄病毒科的另一个成员登革热病毒的生命周期亦有调控作用。第二章的研究我们发现HCV感染可以上调WT/L PGC-1α的表达，并且是HCV RNA复制依赖的。进一步分析，我们发现启动子上的CREB结合区对PGC-1α启动子的表达是至关重要的。更深入分析，我们发现HCV感染，特别是HCVRNA复制诱发的内质网应激(ER stress)介导了CREB的磷酸化，进而上调PGC-1α的表达。此外，HCV复制还能通过ER stress非依赖的去磷酸化FoxO1调控L-PGC-1α的表达。结合第一章的研究结论，揭示HCV通过ERstress诱导了PGC-1α的表达，从而转录调节下游因子CiDeB的表达，从而影响了HCV的生命周期。本研究，首次系统性的评价PGC-1α与HCV的关系。在PGC-1α的下游发现新的影响HCV生命周期的宿主因子CiDeB及其具体的作用机制。以及发现HCV调节PGC-1α的具体机制。提出一个理论假设:HCV是通过调节PGC-1α这个能量代谢中枢分子，从而调控宿主的脂代谢，从而促进HCV的感染并造成代谢性相关的疾病。为解释正链RNA病毒中与脂代谢关系最密切的HCV是如何调控脂代谢通路提供一种解释。提出几个CiDeB具体影响HCV生命周期的模型，这些模型的证明将丰富HCV复制和包装的具体机制。同时PGC-1α，HNF4α，CiDeB以及ER Stress等，可作为抗HCV治疗或者治疗HCV相关疾病的药物靶标。通过HCV与脂代谢的研究也为黄病毒科的其他病毒与脂代谢的关系提供线索。 Ⅱ.丙型肝炎病毒Vero细胞培养系统建立初步研究HCV病毒体外细胞培养是HCV整个领域的研究基础也是整个HCV领域的重大难题。HCV体外培养系统难以建立其中一个原因是HCV在体外细胞感染低效。所以，HCV细胞培养系统的建立采用的是渐进式的改造细胞以及/或HCV病毒以获得最终支持HCV入侵，复制，包装和释放整个HCV生命周期的细胞。从2005年第一个HCV Huh7细胞培养系统的建立到目前，HCV细胞培养系统得到一些发展。在一系列人肝细胞和鼠肝细胞建立了HCV培养系统，但是几乎所有的Huh7细胞以外的HCV细胞培养系统，产生的病毒有限，难以用于进一步分析。到目前为止没有一个非人非肝的HCV细胞培养系统。建立一个非人非肝的细胞培养系统对于回答HCV的宿主特异性以及肝细胞嗜性是非常重要的。HCV全病毒疫苗研究也受限于HCV培养系统，到目前为止没有一个在疫苗制备株细胞上建立完整的HCV培养系统。筛选得到动物适应性的HCV病毒是HCV动物模型建立的一个策略。但是现阶段还没有任何一种HCV动物模型的适应性HCV病毒。本部分的研究选择疫苗制备常用的非洲绿猴肾细胞Vero细胞作为潜在的HCV细胞培养系统。首先我们发现Vero细胞，不能有效的支持HCV的感染和复制。具体表现为入侵效率低下，复制效率不高，难以产生HCV病毒。其次我们通过在Vero细胞过表达人的四种HCV受体CD81，OCLN，CLDN1以及SRBI，发现能够有效的促进HCV感染Vero细胞。表明决定HCV入侵Vero细胞的宿主特异因子主要是四种人的HCV受体。再次，我们发现Vero细胞可以长期低效率支持HCV的复制，表明HCV RNA可以在Vero细胞中复制并产生适应性突变。通过带有neo抗性基因的HCV复制子筛选支持HCV复制的Vero细胞，我们得到了若干个含有HCV复制子(replicon)的Vero细胞。分析复制子上的适应性突变将获得Vero细胞偏好的HCV复制子，从而一定程度解决HCV在Vero细胞中复制效率低的原因。本部分研究初步解决HCV Vero细胞培养系统中关键的HCV入侵和复制生命周期，接下来需要构建稳定表达HCV受体的HCV复制子干扰素消除(IFN cured)后的Vero细胞以及含有Vero细胞适应性突变的HCV复制子克隆，探索改造的Vero细胞对HCV病毒的包装和释放的支持情况。本部分研究为建立支持完整HCV生命周期的Vero细胞培养系统的建立奠定基础。HCV Vero细胞培养系统的建立将有助于发现HCV嗜肝性和宿主特异性的原因并为HCV全病毒疫苗的制备提供基础。HCV Vero细胞培养模型的建立，将为筛选猴适应性的HCV病毒提供重要的基础，从而最终为HCV猴动物模型的建立提供基础。收起

关键词 : 丙型肝炎病毒细胞凋亡诱导效应因子内质网应激脂代谢转录共激活子细胞培养系统