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摘要 : 本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功... 展开本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功能实验观察HBX基因功能。材料与方法:将HBX基因的质粒通过活化、筛选、扩增后提取质粒DNA，然后转染到293T细胞内，收集48h及72h病毒液浓缩，然后转染进HL-7702细胞株内，使用潮霉素B抗性筛选从而获得稳转细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及westernblot实验分别验证HL-7702细胞株HBX的表达水平。通过体外功能实验，包括MTT、Transwell、细胞划痕和平板克隆实验观察HBX基因在HL-7702细胞株内细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的变化。结果:1.实时荧光定量PCR及westernblot结果均证明HBX基因已转染进HL-7702细胞株，与空载质粒组和阴性对照组相比，差异达统计学显著性（所有p＜0.05），空载质粒组和阴性对照组组间差异未达到统计学显著性(p＞0.05)。 2.细胞划痕、Transwell、MTT和平板克隆实验结果提示HBX基因过表达对照组细胞的迁移、侵袭、增殖和克隆形成能力均显著高于HBX基因过表达组，差异均达到统计学显著性（所有p＜0.05）。结论:通过慢病毒转染方法已获得稳定表达HBX基因的HL-7702细胞株，HBX呈现出抑癌基因的作用。第二部分全转录组测序识别HBX基因稳转细胞株HL-7702转录组水平分子表达变化及相关机制的初步探索目的:通过全转录组测序识别过表达HBX基因的HL-7702细胞株转录组水平分子表达变化及其相关分子机制的初步探索。材料与方法:提取稳转细胞株RNA样本送公司进行全转录组测序。通过表达水平分析及差异显著性分析并获得差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA分子。将差异表达的miRNA、lncRNA和circRNA进行靶基因预测，通过差异表达mRNA分子和靶基因进行基因本体(geneontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路及反应组(Reactome)通路富集分析，探索这些差异表达分子可能通过何种途径介导HBX基因发挥作用。结果:1.全转录组测序发现的差异表达分子包括285个mRNA(101个上调，184个下调)，9个miRNA（4个上调，5个下调），78个lncRNA(39个上调，39个下调)，117个circRNA（56个上调，61个下调）。 2.差异表达RNA的GO结果主要包括上皮细胞和血管形态发生、血管发育、细胞外基质和结构组织、伤口愈合的调节等;KEGG通路结果主要包括细胞色素P450对异生物素的代谢、类固醇激素的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化等;Reactome通路包括细胞外基质组织、弹性纤维形成和Netrin-1信号等（所有padj≤0.05）。 3.LncRNA靶基因、circRNA靶基因、miRNA靶基因GO富集分析主要包括L-抗坏血酸代谢过程、血清素受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等;Reactome通路富集分析包括异生物素、生物氧化血小板脱粒、粘结蛋白聚糖相互作用等（所有padj≤0.05）。结论:测序结果提示HBX基因可能通过差异表达的RNA分子在上皮细胞和血管形态发生、细胞外基质组织、RNA转运等途径发挥功能。第三部分 HBV相关性差异表达分子的ceRNA网络构建及部分差异表达分子的初步验证目的:通过乙型肝炎病毒相关性差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA分子及分子靶向调节关系构建竞争性内源性RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)网络及通过RT-PCR初步验证部分差异表达的RNA分子。材料与方法:通过差异表达的4种RNA分子及相互调节关系分别构建lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。并且对前10个差异表达的mRNA、全部9个差异表达的miRNA、前5个差异表达的lncRNA分子通过RT-PCR方法进行验证。RNA的相对表达水平使用2-△△CT方法计算。结果:1.构建了lncRNA-miRNA-mRNA分子的包括LINC00670-205/PDCD11-207/-has-miR-3180-3P/has-miR-767-5P/-PDE7A/RPL29等分子在内的ceRNA网络。 2.构建了circRNA-miRNA-mRNA分子的包括has-circ-0007750/has-circ-000620-has-miR-3180-3P/has-miR-3180-RPL29/RPTOR等分子在内的ceRNA网络。 3.10个差异表达的mRNA(PSMD1表达上调，ACACA、GIPC1、ITPR3、MEMO1、PDE10A、PLCB1、PRL29、PTPRM及YES1均表达下调）;5个差异表达的lncRNA（LINC80表达下调，PTK7-215、LINC00511-274、MIR924HG-206、SLC2A3-205均表达上调）;8个差异表达的miRNA(hsa-miR-625-3p、hsa-miR-3615、hsa-miR-625-5p、hsa-miR-6842-3p表达上调，hsa-miR-1268a、hsa-miR-3180、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-767-5p均表达下调）与测序结果一致（所有p≤0.05），但PCR验证的hsa-miR-3180-3p的结果(HBX组高表达)与测序结果相反。结论:HBX基因可能通过差异表达RNA分子构建的ceRNA网络发挥其作用。第四部分 AFB1暴露下未干预组及HBX基因稳转组HL-7702细胞株的单/双暴露细胞株模型构建目的:在已构建HBX基因稳转株HL-7702基础上，构建H-BX和黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)慢性（干预周期≥3月）双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。材料与方法:使用AFB1+NADPH+肝微粒体建立AFB1暴露的细胞株干预体系，肝微粒体与NADPH的比例为0.5mg/ml∶1mmol/L，干预组别为①HL-7702(HBX)+AFB1;②HL-7702(control)+AFB1;（③HL-7702+AFB1，该体系干预细胞24小时后换用完全培养基继续培养24-48小时后再次干预。在HBX-AFB1双暴露及单一AFB1干预1、2、3月后分别提取细胞DNA进行TP53基因第249密码子测序，观察其是否发生突变。结果:1.本研究建立了AFB1干预浓度为0.05、0.02、0.01、0.005mmol/L的浓度梯度，构建了HBX-AFB1慢性双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。 2.在AFB10.05和0.02umol/1干预1月后，细胞株发生了第249密码子（第三位碱基）AGG＞AGT的常见突变。 3.本研究还发现TP53基因第249密码子AGG＞AGA和AGG＞AGC的突变，以及第247密码子AAC＞AGC突变和第250密码子CCC＞ACC突变。结论:本研究构建了HBX-AFB1双暴露及单一AFB1暴露的细胞株模型，此模型出现AFB1暴露引起TP53基因常见位点的突变。收起

关键词 : HL-7702细胞株 HBV-AFB1双暴露 HBX基因转录组特征识别分子机制

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