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1. 人肝细胞株HL-7702在HBV-AFB1双暴露下的基因组、转录组特征识别及相关分子机制的初步探索

[学位论文] 王向坤广西医科大学 2021年博士导师: 彭涛共301页

摘要 : 本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功... 展开本文主要从以下几个部分展开论述：第一部分慢病毒介导过表达HBX基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株构建及体外功能实验目的:构建稳定过表达HBX（hepatitisBvirusX，HBX）基因于永生化人肝细胞株HL-7702的稳转细胞株并进行体外功能实验观察HBX基因功能。材料与方法:将HBX基因的质粒通过活化、筛选、扩增后提取质粒DNA，然后转染到293T细胞内，收集48h及72h病毒液浓缩，然后转染进HL-7702细胞株内，使用潮霉素B抗性筛选从而获得稳转细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及westernblot实验分别验证HL-7702细胞株HBX的表达水平。通过体外功能实验，包括MTT、Transwell、细胞划痕和平板克隆实验观察HBX基因在HL-7702细胞株内细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的变化。结果:1.实时荧光定量PCR及westernblot结果均证明HBX基因已转染进HL-7702细胞株，与空载质粒组和阴性对照组相比，差异达统计学显著性（所有p＜0.05），空载质粒组和阴性对照组组间差异未达到统计学显著性(p＞0.05)。 2.细胞划痕、Transwell、MTT和平板克隆实验结果提示HBX基因过表达对照组细胞的迁移、侵袭、增殖和克隆形成能力均显著高于HBX基因过表达组，差异均达到统计学显著性（所有p＜0.05）。结论:通过慢病毒转染方法已获得稳定表达HBX基因的HL-7702细胞株，HBX呈现出抑癌基因的作用。第二部分全转录组测序识别HBX基因稳转细胞株HL-7702转录组水平分子表达变化及相关机制的初步探索目的:通过全转录组测序识别过表达HBX基因的HL-7702细胞株转录组水平分子表达变化及其相关分子机制的初步探索。材料与方法:提取稳转细胞株RNA样本送公司进行全转录组测序。通过表达水平分析及差异显著性分析并获得差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA分子。将差异表达的miRNA、lncRNA和circRNA进行靶基因预测，通过差异表达mRNA分子和靶基因进行基因本体(geneontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路及反应组(Reactome)通路富集分析，探索这些差异表达分子可能通过何种途径介导HBX基因发挥作用。结果:1.全转录组测序发现的差异表达分子包括285个mRNA(101个上调，184个下调)，9个miRNA（4个上调，5个下调），78个lncRNA(39个上调，39个下调)，117个circRNA（56个上调，61个下调）。 2.差异表达RNA的GO结果主要包括上皮细胞和血管形态发生、血管发育、细胞外基质和结构组织、伤口愈合的调节等;KEGG通路结果主要包括细胞色素P450对异生物素的代谢、类固醇激素的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化等;Reactome通路包括细胞外基质组织、弹性纤维形成和Netrin-1信号等（所有padj≤0.05）。 3.LncRNA靶基因、circRNA靶基因、miRNA靶基因GO富集分析主要包括L-抗坏血酸代谢过程、血清素受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等;Reactome通路富集分析包括异生物素、生物氧化血小板脱粒、粘结蛋白聚糖相互作用等（所有padj≤0.05）。结论:测序结果提示HBX基因可能通过差异表达的RNA分子在上皮细胞和血管形态发生、细胞外基质组织、RNA转运等途径发挥功能。第三部分 HBV相关性差异表达分子的ceRNA网络构建及部分差异表达分子的初步验证目的:通过乙型肝炎病毒相关性差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA分子及分子靶向调节关系构建竞争性内源性RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)网络及通过RT-PCR初步验证部分差异表达的RNA分子。材料与方法:通过差异表达的4种RNA分子及相互调节关系分别构建lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。并且对前10个差异表达的mRNA、全部9个差异表达的miRNA、前5个差异表达的lncRNA分子通过RT-PCR方法进行验证。RNA的相对表达水平使用2-△△CT方法计算。结果:1.构建了lncRNA-miRNA-mRNA分子的包括LINC00670-205/PDCD11-207/-has-miR-3180-3P/has-miR-767-5P/-PDE7A/RPL29等分子在内的ceRNA网络。 2.构建了circRNA-miRNA-mRNA分子的包括has-circ-0007750/has-circ-000620-has-miR-3180-3P/has-miR-3180-RPL29/RPTOR等分子在内的ceRNA网络。 3.10个差异表达的mRNA(PSMD1表达上调，ACACA、GIPC1、ITPR3、MEMO1、PDE10A、PLCB1、PRL29、PTPRM及YES1均表达下调）;5个差异表达的lncRNA（LINC80表达下调，PTK7-215、LINC00511-274、MIR924HG-206、SLC2A3-205均表达上调）;8个差异表达的miRNA(hsa-miR-625-3p、hsa-miR-3615、hsa-miR-625-5p、hsa-miR-6842-3p表达上调，hsa-miR-1268a、hsa-miR-3180、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-767-5p均表达下调）与测序结果一致（所有p≤0.05），但PCR验证的hsa-miR-3180-3p的结果(HBX组高表达)与测序结果相反。结论:HBX基因可能通过差异表达RNA分子构建的ceRNA网络发挥其作用。第四部分 AFB1暴露下未干预组及HBX基因稳转组HL-7702细胞株的单/双暴露细胞株模型构建目的:在已构建HBX基因稳转株HL-7702基础上，构建H-BX和黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)慢性（干预周期≥3月）双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。材料与方法:使用AFB1+NADPH+肝微粒体建立AFB1暴露的细胞株干预体系，肝微粒体与NADPH的比例为0.5mg/ml∶1mmol/L，干预组别为①HL-7702(HBX)+AFB1;②HL-7702(control)+AFB1;（③HL-7702+AFB1，该体系干预细胞24小时后换用完全培养基继续培养24-48小时后再次干预。在HBX-AFB1双暴露及单一AFB1干预1、2、3月后分别提取细胞DNA进行TP53基因第249密码子测序，观察其是否发生突变。结果:1.本研究建立了AFB1干预浓度为0.05、0.02、0.01、0.005mmol/L的浓度梯度，构建了HBX-AFB1慢性双暴露及单一AFB1慢性暴露的细胞株模型。 2.在AFB10.05和0.02umol/1干预1月后，细胞株发生了第249密码子（第三位碱基）AGG＞AGT的常见突变。 3.本研究还发现TP53基因第249密码子AGG＞AGA和AGG＞AGC的突变，以及第247密码子AAC＞AGC突变和第250密码子CCC＞ACC突变。结论:本研究构建了HBX-AFB1双暴露及单一AFB1暴露的细胞株模型，此模型出现AFB1暴露引起TP53基因常见位点的突变。收起

关键词 : HL-7702细胞株 HBV-AFB1双暴露 HBX基因转录组特征识别分子机制

2. 海浪和尾流感应电磁场数值模拟

[学位论文] 王向坤中国海洋大学 2020年硕士导师: 李予国共90页

摘要 : 海洋电磁技术是根据不同介质的电导率差异研究海底岩石电学性质及其分布特征的一种海洋地球物理勘探方法。将海洋电磁法与人工地震方法以及相关地质资料结合应用，可以有效提高海洋深部构造解释精度，有利于矿产资源勘探与评价，提高海底油气资源钻探... 展开海洋电磁技术是根据不同介质的电导率差异研究海底岩石电学性质及其分布特征的一种海洋地球物理勘探方法。将海洋电磁法与人工地震方法以及相关地质资料结合应用，可以有效提高海洋深部构造解释精度，有利于矿产资源勘探与评价，提高海底油气资源钻探的成功率。在地球引力、海气相互作用和人文活动的影响下，海水始终处于不停的运动状态之中，包括风浪、涌浪、内波，大洋环流、潮汐，以及船舶、水下航行器在海水中航行时所产生的尾流。海水具有较高的导电性，海水运动切割地磁场会产生可观测的感应电磁场。在海洋电磁勘探应用过程中，船舶通常作为载体，用于接收机的释放、回收及发射源的拖曳等，船舶在海水中运动会产生尾流，海面也伴生海浪运动，因此实测的海洋电磁数据会受到海浪和尾流感应电磁场噪声干扰，忽略此类噪声可能会对后续的数据处理和解释工作产生较大影响，会导致反演结果的偏差或者造成多解性问题，无法获得真实的地下电性结构。在海洋电磁学研究中，船舶尾流感应电磁场是一种干扰噪声，而在船体特征信号识别中，船舶尾流感应电磁场作为一种有效信号逐渐受到重视。随着现代科技的发展，消磁、消电、静音和弹性减振等隐身技术得到广泛应用，使船舶本身的特征信号越来越难以捕捉，船舶尾流由于其难以消除性成为一种新的船舶信号源。船舶在海面航行时必然会引起尾流运动，而且这种运动无法人工消除，只能在重力等作用下自然消失。海浪和尾流都属于表面重力波，海浪是船舶尾流信号的主要干扰源，因此研究和分析海浪和船舶感应电磁场及其特征，对于船舶信号识别具有指导意义。目前，单一频率下三维海浪感应电磁场的研究工作已趋于成熟，而多频率三维海浪感应电磁场模拟及其特征分析的研究尚不完善。在船舶尾流感应电磁场研究中，为了简化起见，往往只考虑边界面上磁场切向分量的连续性，而忽视了电场切向分量在边界处的连续性。这会导致电场模拟结果在不同介质分界面处不连续，以及产生较大误差等。本文重点模拟海浪和船舶尾流感应电磁场，根据三维速度场，通过麦克斯韦方程组推导出感应电磁场偏微分方程，利用电磁场在不同介质分界面处的连续条件求解待定系数，得到感应电磁场表达式。在海浪运动感应电磁场模拟中，考虑到海浪的多频性和随机性，采用了海浪多频线性叠加和加入随机相位的方式。在船舶尾流感应电磁场模拟中，在求解偏微分方程待定系数时将电场在分界面处连续条件考虑在内，并给出了这些系数的具体计算表达式。本文模拟无限水深和有限水深两种情况下海浪和尾流感应电磁场，然后对两种海水运动感应电磁场特征进行分析，算例结果表明感应磁场可达数nT，感应电场可达102μV/m；感应电磁场特征与地电模型参数有关；海浪和船舶尾流运动感应磁场形态在水平方向上具有较大差异，而在深度方向上两者传播特征相似；在频谱特性上，尾流感应磁场为稳定的窄带低频信号，且其主频随船速增大而向低频移动，而海浪感应磁场则表现为相对宽频信号。收起

关键词 : 海洋电磁学尾流感应磁场三维海浪电场切向分量

3. 桁架机器人静动态特性分析与优化改进

[学位论文] 王向坤浙江大学 2021年硕士导师: 王进;陈燕智共79页

摘要 : 桁架机器人具有工作空间大、节拍可调、工作平稳性高等优点，在金属加工、零部件装配、仓储搬运等行业应用广泛。重载桁架机器人由于负载大于几百公斤，行程较长，如何保证机器人在高精度、高负载、高强度工作条件下的工作性能将成为制约其应用的关键... 展开桁架机器人具有工作空间大、节拍可调、工作平稳性高等优点，在金属加工、零部件装配、仓储搬运等行业应用广泛。重载桁架机器人由于负载大于几百公斤，行程较长，如何保证机器人在高精度、高负载、高强度工作条件下的工作性能将成为制约其应用的关键因素，因此对桁架机器人进行静态特性分析、动态响应与变形特性分析、结构优化与动态定位误差补偿十分重要。针对上述关键问题，本文进行了以下研究：基于柔性体的桁架机器人静动力学特性综合分析与实验对比。针对产品设计过程中较少涉及综合静动力学特性分析与实验对比问题，利用有限元方法，引入了桁架机器人主要结构以及整机结构的柔性体仿真分析流程，进行了综合静动力学特性分析。探讨了仿真分析时不同单元划分方法对仿真结果的影响。引入了理论计算和实验验证的对比分析方法，验证了仿真结果的准确性。通过对桁架机器人进行综合仿真分析以及验证对比，校核了整机结构的安全性与仿真模型的准确性。静力学分析结果表明：在主要梁结构中，横梁结构的总变形量较大，约为0.586mm。基于响应面拟合与MOGA优选的桁架机器人结构尺寸优化。针对传统的结构尺寸优化设计方法在试验点选取时较难反映尺寸空间信息，导致响应面模型构建质量不佳、优化结果较差等问题。提出了基于中心复合设计(CCD)/最佳填充空间设计(OSF)方法构建响应面模型与多目标遗传算法(MOGA)对解集空间进行优选的机器人结构尺寸优化方法。通过试验设计方法的使用，响应面模型的拟合效果进一步得到改善，可以更全面的反映尺寸空间信息，同时进行了不同试验设计方法的优化效果对比。基于MOGA算法与拟定的优选方向，对响应面模型进行了目标样本点的快速优选，提高了优化设计效率。优化后横梁结构在总变形量降低了18.41%的同时，重量降低了1.47%，实现了结构的轻量化设计。基于GE-BDE模型的桁架机器人动态定位误差特性分析与补偿。针对机器人动态定位精度较低与误差补偿方法较少应用于桁架机器人问题，提出了基于GE-BDE模型的误差补偿方法。通过对机器人综合误差进行分类，将机器人综合误差分为几何误差（GE）、梁变形误差（BDE）以及残余误差三种，并进行了以几何误差与梁变形误差为主的识别分析。基于线性插值的方法，获得不同负载重量下的补偿曲线。利用逆变换，分别补偿由不同因素影响所造成机器人末端执行器产生的微量偏移量，提高桁架机器人的定位精度。误差补偿效果表明：在Y向运行状态下，X向的动态定位精度最大提高了约90%。收起

关键词 : 桁架机器人刚柔耦合静动态特性分析结构优化误差补偿

4. 基于BT/BDT基团三元聚合物给体材料厚活性层太阳能电池性能优化研究

[学位论文] 王向坤太原理工大学 2018年硕士导师: 李战峰共79页

摘要 : 本体异质结聚合物太阳能电池具有质量轻、柔性、低成本等优点，最近几年被公认为最有前景的下一代新能源之一。越来越多的科研人员致力于提升有机聚合物太阳能电池的能量转化效率，目前基于共轭聚合物给体和富勒烯衍生物受体体系的单结和多结聚合物太... 展开本体异质结聚合物太阳能电池具有质量轻、柔性、低成本等优点，最近几年被公认为最有前景的下一代新能源之一。越来越多的科研人员致力于提升有机聚合物太阳能电池的能量转化效率，目前基于共轭聚合物给体和富勒烯衍生物受体体系的单结和多结聚合物太阳能电池器件的能量转化效率已超过12%。通过合理的选择和优化富电子给体单元和缺电子受体单元的组成和比例，共轭聚合物的光带隙、分子能级和光吸收性能可以优化。通常，无规共聚物可以用于拓宽材料对可见光的吸收范围，其组成是基于两种不同的富电子单元和一种缺点子单元或者一种富电子单元和两种不同的缺电子单元。通过调整不同共轭单元间的摩尔比可以简单高效、低成本地合成高性能共轭聚合物。我们采用两种含不同官能团的苯并噻二唑（BT）缺电子单元（2FBT的修饰基团为对称的氟原子，2ORBT的修饰基团为对称的十二烷氧基直链）作为受体单元，采用2-乙基己基噻吩基团修饰的苯并噻吩（BDT）富电子单元作为给体单元合成了三种新的无规共聚物P2FBT-25 和P2FBT-50，P2FBT-75。在共聚物骨架中，两种不同受体单元的摩尔比（2FBT：2ORBT）分别为1:3，1:1，3:1。在苯并噻二唑（BT）单元上两个对称的直链烷氧基基团的引入既能增加材料的溶解性，又能优化活性层的界面形态。因此，BDT和2FBT这两种单元与2ORBT单元的结合，有望增强聚合物链间相互作用，并获得较高的器件性能。这三种新的无规共聚物P2FBT-25 和P2FBT-50，P2FBT-75在300-750nm波长范围内具有互补的、较宽的光吸收。基于P2FBT-75:PC71BM体系的聚合物太阳能电池器件，活性层界面经氯仿热蒸发处理30 s，获得了最大的能量转化效率为5.71%，相应的开路电压值为 0.89 V，短路电流密度为 11.38 mA cm?2，填充因子为 0.56，这应该归因于聚合物宽的吸光范围和平衡的空穴电子迁移率（μh:μe=1）。值得注意的是，这三种无规共聚物虽然组成上有差异，却都具有较高的光电转化效率，表明利用无规共聚的方法经给受体单元的合理调配可制备高性能聚合物给体材料。更重要的是，在共聚物P2FBT-75:PC71BM体系中，当本体异质结厚度超过250 nm时，能量转化效率保持在4.5%以上，这对工业化、大面积、低成本R2R技术生产大面积聚合物太阳能电池具有指导意义。其次，基于共聚物P2FBT-75:PC71BM体系，我们分别制备了正置结构和倒置结构亚微米厚活性层聚合物太阳能电池。研究发现，当活性层厚度为200~300 nm时，电池的光电转化效率保持基本不变。正置结构电池，当活性层厚度达到270 nm，PCE ≥4.5%。而倒置结构电池，当活性层厚度达到270 nm，PCE ≥2.5%。相比之下，正置结构电池光伏性能更优，稳定性更好。收起

关键词 : 聚合物太阳能电池厚活性层溶剂热蒸发三元聚合物光伏性能

5. 基于HPS的中学化学教学设计研究与实践

[学位论文] 王向坤湖南师范大学 2014年硕士导师: 耿淑玲;谢如良共66页

摘要 : HPS(History,PhilosophyandSociologyofScience)，是近年来西方一些科学教育专家们以建构主义为指导思想，倡导的一种新型的教育理念。HPS教学模式旨在将科学史、科学哲学、科学社会学的相关内容融入中学理科教学，其主要优点是全面的提高学生的科学素... 展开 HPS(History,PhilosophyandSociologyofScience)，是近年来西方一些科学教育专家们以建构主义为指导思想，倡导的一种新型的教育理念。HPS教学模式旨在将科学史、科学哲学、科学社会学的相关内容融入中学理科教学，其主要优点是全面的提高学生的科学素养。目前，我国对于HPS及其教学模式的研究主要集中两个方面:一、关于HPS教育内涵与价值的讨论，但这些研究并没有系统的实证性研究作为依托;二、针对物理、化学、生物三个学科中的教学内容进行个别的教学设计，很少有关某一具体学科的系统教学设计。根据当前HPS教育及其教学模式的研究现状，本研究旨在探究将HPS教学模式运用于中学化学教学的价值和策略。通过设计一系列完整的基于HPS的中学化学教学设计，并将其应用于化学课堂教学，考察其在中学化学教学中的适应性和有效性。具体研究工作包括教学设计与实践研究两部分。教学设计:运用HPS教学模式对高中化学必修1的教学内容进行系统设计，内容涉及基本概念与基本理论和元素化合物两部分知识，文中以离子反应、氨为例进行教学设计;此外，本研究初次尝试对HPS的“补充功能”进行研究，归纳和设计出“HPS补充科学模式”，并以化学必修2中乙醇一节为例，应用该模式进行教学设计。实践研究:在系统教学设计的基础上，我们选择兰州市第二中学高一年级两个基础相当的班级进行一学期的对比教学，实验班采用HPS教学模式教学，对照班实施普通教学。最终通过分析两个班的期中、期末和三次月考成绩以及问卷调查结果，从实践上对HPS教育的价值予以诠释并探索出其实施策略。研究结果表明:HPS教学模式能够与中学化学教学内容很好的相融合，在完成教学内容的同时丰富学生的视野，提高知识之间的相互运用能力，是达到新课程三维目标的的绝佳载体;在两个班的多次成绩分析对比中，实验班的化学成绩明显优于对照班，尤其是在第2、3次月考中存在显著性差异(P＜0.05）。因此，将HPS教学模式应用于中学化学教学对于提升学生的学习成绩具有一定的促进作用，特别是对“基本概念和原理”及“元素化合物”两部分知识学习，有明显地提升作用。此外，HPS的补充科学模式也在化学教学中得到了初步应用，但该教学模式需要教师精心地选取适当的教学素材，且适用于体系化知识传授中小问题的探究，不适宜普遍教学，具有一定的局限性。收起

关键词 : HPS思想教学设计科学素养中学化学