摘要: 研究内容:本研究分为五部分进行研究:1.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查。2.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的候选单核苷酸多态性位点高尔基... 展开 研究内容:本研究分为五部分进行研究:1.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查。2.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的候选单核苷酸多态性位点高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922的二期队列验证。3.基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究.4.乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析。5.GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT，AST的调控关系研究。 第一部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT，AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查 目的:本研究尝试通过GWAS方法对广西乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT, AST变化的全外显子单核苷酸多态性特征进行筛查，并分析其临床病理特征和预后。 方法:收集49例在广西医科大学第一附属医院行肝切除术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者，且术后行TACE术。根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行分组，对这些患者癌组织进行全外显子芯片扫描并进行全外显子关联分析。 结果:根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行全外显子关联分析，我们筛选了1247个P＜0.05的候选SNPs位点。通过ICSNPathway分析我们共鉴定出17个具有影响通路改变的SNPs位点(包括rs75387493，rs2271683, rs11768465, rs8207, rs28365927, rs1344642, rs1863704,rs10160013, rs4036, rs2235324, rs17183814, rs7973658, rs34550074,rs3740168，rs197922，rs3790525，rs41309181)，发现了4条SNP-Gene-Pathway的调控机制。通过生物信息学分析，利用GeneMANIA在线分析工具发现这些17个候选SNPs位点所在的基因与ALT和AST的编码基因具有共表达互作关系。通过GTEx数据库发现这17个SNPs中的高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922在肝脏等多个正常组织中具有表达数量性状基因座关系。 结论:本研究筛选出17个潜在具有SNP-Gene-Pathway调控潜力的SNPs，其中GOSR2-rs197922位点可能参与调控血清ALT和AST。 第二部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的候选单核苷酸多态性立点GOSR2-rs197922的二期队列验证 目的:本研究通过收集独立于一期GWAS队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者进行全外显子关联分析结果的二期队列验证。 材料方法:本研究收集于2014年至2017年在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除手术且术后行TACE术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织，通过Sanger法对这些患者进行高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)-rs197922位点进行基因分型，分析候选位点与TACE术前术后血清ALT和AST变化的关系。 结果:二期验证队列共纳入88例乙肝相关性原发性肝细胞癌接受肝切除术后行TACE治疗的患者，其中rs197922位点的基因型分布如下:AA基因型23例，AG基因型43例和GG基因型22例。通过卡方检验和Ligistic回归分析，我们未能观察到rs197922基因型分布与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者肝切除术后接受TACE治疗后血清ALT和AST的变化相关。 结论:由于纳入二期验证队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者TACE化疗药物方案的改变，我们未能观察到rs197922位点的基因型与TACE术后ALT和AST水平变化显著相关。 第三部分 基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究 目的:本研究的目的是基于GEO和TCGA数据库中原发性肝细胞癌的全基因组数据集对高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptorcomplex member2，GOSR2)基因的临床意义进行探索，及利用生物信息学方法对该基因在HCC中的分子机制进行分析。 材料与方法:本研究分别纳入GSE14520和TCGA的212个和370个原发性肝细胞癌患者。通过诊断ROC和生存分析探索GOSR2基因的临床应用价值。随后基于全基因组数据对GOSR2进行差异表达基因、共表达基因和基因集富集分析等生物信息学方法探索其潜在的分子机制。 结果:通过GSE14520和TCGA队列的验证，我们发现GOSR2基因在原发性肝细胞癌癌组织中表达量上调，高表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者具有较短的无复发生存时间和总生存时间。通过比较高、低表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者之间的全基因组表达谱数据，筛选两组之间的差异表达基因和进行基因集富集分析，以及GOSR2的共表达基因，以及通过生物信息学方法进行富集发现GSOR2可能通过调控细胞增殖、周期、NF-kB和Wnt等信号通路参与原发性肝细胞癌生物学行为的调控。 结论:GOSR2可能具有作为原发性肝细胞癌诊断和预后生物标志物的潜力。其生物学功能可能涉及细胞增殖和周期等信号通路的调控。 第四部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析 目的:本研究通过评估高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAPreceptor complex member2，GOSR2)免疫组化表达量和rs197922的基因型分布探索他们作为乙肝相关性原发性肝细胞癌生物标志物的潜在临床应用价值，同时分析rs197922在乙肝相关性原发性肝细胞癌中的表达数量性状基因座(expression Quantitative Trait Loci,eQTL)特性。 材料方法:本研究通过免疫组化方法对乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织进行GOSR2基因的免疫组化染色，以及对rs197922位点进行基因分型，比较不同GOSR2基因表达量和不同rs197922基因型患者之间的临床病理特征和预后差异。 结果:本研究纳入342例广西乙肝相关性原发性肝细胞癌患者，通过多因素生存分析比较，我们发现GOSR2基因免疫组化阴性和阳性染色患者的无瘤生存和总体生存时间的差异未达到统计学显著性。但是，我们发现rs197922位点的基因型在非根治性切除等亚组的原发性肝细胞癌患者中与预后显著相关。 结论:本研究中我们观察到GOSR2基因免疫组化表达水平与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者预后无关，但是我们发现到rs197922基因型分布在特定的乙肝相关性原发性肝细胞癌亚组中具有作为预后分子标志物的潜力。 第五部分 GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT，AST的调控关系研究 目的:本研究通过在肝癌细胞株中沉默高尔基体SNAP受体复合物成员2(golgi SNAP receptor complex member2，GOSR2)基因探索其在原发性肝细胞癌中的生物学功能，并探索其在正常肝细胞中在TACE化疗药干预的条件下与ALT和AST的调控关系。 材料方法:利用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)技术在肝癌细胞株(MHCC-97H，Hep-G2和HCC-M)和正常肝细胞株(HL-7702)中沉默GOSR2基因，通过Westem Blot，RT-PCR，细胞划痕、增殖、侵袭等实验验证GOSR2生物学功能。通过化疗药物(5-氟尿嘧啶，吡柔比星，顺铂和洛铂)干预探索GOSR2在正常肝细胞株中与ALT和AST的调控关系。 结果:通过WB，RT-PCR验证siRNA在细胞株中的沉默GOSR2的效果，并通过细胞划痕、增殖、侵袭等实验证实在肝癌细胞株中抑制GOSR2基因的表达可以显著抑制肝癌细胞的迁移、增殖和侵袭能力。在正常肝细胞株中沉默GOSR2基因表达，我们未观察到经化疗药物干预后正常肝细胞株分泌ALT和AST有明显变化。 结论:本研究证实GOSR2基因在肝细胞癌中可能起着一个癌基因的角色，但本研究并未观察到其表达量的变化与ALT和AST在正常肝细胞株中经化疗药干预后存在显著的直接调控关系。 收起