中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 韦懿宸广西医科大学 2020年硕士导师: 冯振博共114页

摘要 : 背景目的：原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，危害着世界许多国家人民的健康。我国是世界上原发性肝癌发病率和死亡率最高的国家之一。肝细胞癌(HCC)是主要亚型。虽然近年来原发性HCC的诊断和治疗取得了很大进展，但多数患者诊断为中晚期，预后... 展开背景目的：原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，危害着世界许多国家人民的健康。我国是世界上原发性肝癌发病率和死亡率最高的国家之一。肝细胞癌(HCC)是主要亚型。虽然近年来原发性HCC的诊断和治疗取得了很大进展，但多数患者诊断为中晚期，预后无明显改善，5年生存率低于37%。主要原因是HCC早期没有明显的临床症状，没有简单、无创的早期诊断方法。因此，寻找一种无创、敏感、特异、简单易用的生物标志物，将有效提高HCC的早期诊断率和预后。环状RNA(Circular RNA, circRNA)是一类具有调控能力的内源性非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。它是由反向剪接形成的闭环结构，不易被RNA外切酶破坏，具有细胞外稳定性和进化保护，在调控基因表达中起重要作用。近年来的研究表明，circRNA与多种疾病的发生有关，有可能成为疾病诊断和预后的标志物。材料与方法：本研究采用三部分研究设计，第一部分，收集NCBIGEOHCC相关circRNA高通量芯片(GSE78520，GSE94508，GSE97332)，通过RobustRankAggreg的方法筛选HCC及其配对正常组织样本间差异表达的circRNA，筛选标准：表达量差异倍数(fold change，FC)≥1；组间比较p＜0.05。绘制热图，选择差异性大的候选circRNA；收集16对HCC和相邻正常组织样本通过实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)对候选circRNA进行表达水平检测验证。第二部分，选择两种肝细胞癌细胞系(Huh7、Hep3B)，构建circRNA过表达载体，转染至肝细胞癌细胞系Huh7、Hep3B中，观察其对细胞凋亡、细胞周期、增殖、迁移和侵袭的影响。第三部分，采用生物在线网站预测候选circRNA潜在结合的miRNA，运用双荧光素酶报告基因检测法验证结合位点，分析其潜在的作用机制。结果：1.通过RobustRankAggreg的方法整合三个HCC芯片数据集结果发现，共有6种环状RNA(2种上调的环状RNA,hsa_circRNA_103510和hsa_circRNA_100542和4种下调的环状RNA,hsa_circRNA_102166、hsa_circRNA_0002980、hsa_circRNA_105031和hsa_circrna_100291)，并且通过qPCR在16对人HCC组织标本中验证了hsa_circRNA_0002980在HCC组织中明显低表达于其配对的癌旁组织，p<0.05；2.体外细胞功能实验表明过表达hsa_circRNA_0002980能够显著促进肝癌细胞的增殖、增强癌细胞迁移和侵袭能力，并干扰细胞周期,致使DNA合成期(S期)细胞比例明显增多。3.生物信息学预测hsa-miR-1303、hsa-miR-877-5p、hsa-miR-142-5p均与hsa_circ_0002980存在保守的结合位点，且荟萃分析显示miR1303肝细胞癌中相对于正常肝组织具有更高的表达水平,合并的sROC曲面下面积达到0.81，具有较好的诊断肝细胞癌的价值。但是双荧光素酶报告基因检测不支持hsa-miR-1303与hsa_circ_0002980存在相互作用。结论：hsa_circ_0002980在肝细胞癌组织中相对于正常非癌肝脏组织显著低表达。体外细胞功能实验表明，过表达hsa_circ_0002980能显著促进肝癌细胞增殖，促进细胞迁移和侵袭，干扰细胞周期，导致DNA合成期(S期)细胞比例显著增加。hsa-miR-1303与hsa_circ_0002980可能不存在相互作用。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌环状RNA 微小RNA

2. 类泛素蛋白FAT10激活自噬导致肝癌细胞索拉非尼耐药的机制研究

[学位论文] 陈磊峰南昌大学(医学院) 2020年博士导师: 邵江华共104页

摘要 : 研究背景和目的：多靶点、多激酶抑制剂索拉非尼是第一个被FDA批准用于晚期肝癌患者治疗的靶向药物，但是索拉非尼耐药是导致晚期肝癌患者预后不良的主要原因。自噬(autophagy)是不同于凋亡的一种细胞死亡编程，大量的研究证实细胞自噬的发生与... 展开研究背景和目的：多靶点、多激酶抑制剂索拉非尼是第一个被FDA批准用于晚期肝癌患者治疗的靶向药物，但是索拉非尼耐药是导致晚期肝癌患者预后不良的主要原因。自噬(autophagy)是不同于凋亡的一种细胞死亡编程，大量的研究证实细胞自噬的发生与肿瘤的药物敏感性密切相关。最近大量的研究证实蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物学功能的关键步骤，是蛋白质动态平衡和相互作用的重要分子基础，几乎参与了细胞所有的生理活动过程。类泛素蛋白FAT10(Human HLA-F adjacent transcript 10)目前认为是蛋白质翻译后修饰过程中最重要的蛋白之一。研究表明FAT10在多种恶性肿瘤的的发生发展中起关键的作用，我们前期大量的研究证实FAT10在肝癌组织中呈现高表达，降低FAT10的表达可以显著抑制肝癌的增殖和侵袭转移，然而FAT10和自噬在肝癌索拉非尼耐药中的关系以及FAT10与自噬的关系尚不清楚。本研究拟先通过构建索拉非尼耐药的肝癌细胞株观察FAT10对索拉非尼耐药的关系；其次通过体内和体外实验明确FAT10是否调控自噬进而影响肝癌的索拉非尼耐药；最后探索FAT10调控自噬的具体分子生物学机制。方法： 1、首先构建索拉非尼的耐药的肝癌细胞株，观察索拉非尼耐药细胞中FAT10表达情况；进一步我们将shFAT10干扰质粒稳定转染到索拉非尼耐药的肝癌细胞中，荧光定量PCR和Westernblot检测索拉非尼耐药的肝癌细胞中FAT10蛋白表达变化；利用流式细胞分析及Westernblot等方法观察降低FAT10表达后肝癌细胞对索拉非尼敏感性的变化；通过裸鼠荷瘤模型和免疫组化观察降低索拉非尼耐药的肝癌细胞株中FAT10的表达对索拉非尼敏感性的影响。2、通过Westernblot、免疫荧光和电镜等实验观察在索拉非尼耐药的肝癌细胞中自噬水平的变化以及改变FAT10表达后索拉非尼耐药细胞株自噬水平的变化，同时通过免疫组化观察裸鼠荷瘤模型中瘤体组织中自噬水平的变化。3、通过芯片技术检测在索拉非尼耐药的肝癌细胞中降低FAT10表达后与自噬相关的PTEN/AKT信号通路的表达变化，然后进一步采用Westernblot实验明确PTEN/AKT信号通路中关键蛋白的变化；最后通过Westernblot和细胞免疫荧光实验检测在索拉非尼耐药的肝癌细胞下调FAT10表达后索拉非尼耐药细胞株中PTEN/AKT信号通路中关键蛋白和自噬水平的变化。4、通过免疫共沉淀、体外泛素化实验、免疫荧光等实验探索FAT10调控PTEN/AKT信号通路的具体的分子生物学机制。结果： 1、通过在体外构建了索拉非尼耐药的肝癌细胞，发现在索拉非尼耐药的肝癌细胞株中，FAT10的mRNA和蛋白表达水平显著增加。下调索拉非尼耐药的肝癌细胞株中FAT10表达后，流式细胞分析结果显示耐药细胞株的凋亡水平显著的增加，且Westernblot结果发现耐药细胞株中的凋亡相关蛋白显著增加。进一步通过构建裸鼠皮下荷瘤模型也发现降低shFAT10+索拉非尼组瘤体体积和重量显著下降，而且Tunel结果也证实shFAT10+索拉非尼组的瘤体组织凋亡显著增加。 2、通过免疫荧光和电镜发现索拉非尼耐药肝癌细胞经索拉非尼处理后，细胞自噬水平显著的增加。然后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后经索拉非尼处理，通过免疫荧光和电镜发现耐药细胞自噬水平显著下降；Westernblot结果发现凋亡及自噬相关蛋白表达下降；同时体内实验同样证实下调FAT10的表达后经索拉非尼处理，耐药肝癌细胞自噬水平增加。最后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10表达的同时加入雷帕霉素进行处理，Westernblot实验发现加入雷帕霉素凋亡可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬及凋亡相关蛋白表达的增加，免疫荧光结果同样显示细胞内自噬水平较雷帕霉素处理前下降。 3、采用Westernblot实验检测索拉菲尼耐药肝癌细胞株经索拉非尼处理后PTEN/AKT信号通路中关键蛋白的表达变化，发现耐药细胞中PTEN蛋白表达下降，p-AKT表达增加，总的AKT蛋白没有变化，提示PTEN/AKT信号通路调控自噬参与了索拉非尼的耐药。然后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后经索拉非尼处理，Westernblot实验结果显示PTEN蛋白表达下降，p-AKT、凋亡相关蛋白表达增加，总的AKT表达没变化。最后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达，加入AKT信号激活剂SC79以及在下调FAT10表达的同时加入SC79，Westernblot实验结果发现加入AKT信号激活剂SC79后耐药细胞自噬和凋亡相关蛋白表达显著减少，p-AKT表达增加；在下调FAT10表达的同时加入SC79可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬水平的下降和凋亡相关相关蛋白的增加，免疫荧光结果同样显示细胞内自噬水平较SC79处理前增加。 4、通过免疫共沉淀结果发现在索拉非尼耐药肝癌细胞中FAT10蛋白与PTEN蛋白不结合，但是FAT10蛋白与PTEN蛋白的E3泛素连接酶NEDD4存在相互结合。在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后，Westernblot实验结果发现NEDD4蛋白表达下降，PTEN蛋白表达增加，p-AKT和自噬及凋亡相关蛋白表达下降，总的AKT表达没变化。在索拉非尼耐药肝癌细胞中转染His-NEDD4质粒后检测相关蛋白表达变化，发现NEDD4蛋白表达增加，PTEN表达下降，p-AKT表达增加，总的AKT表达没变化，自噬及凋亡相关蛋白表达下降，且细胞免疫荧光实验发现细胞内自噬水平降低。在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10表达的同时转染His-NEDD4质粒后检测相关蛋白表达变化，结果发现NEDD4蛋白表达下降，PTEN表达增加，p-AKT表达下降，转染NEDD4可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬及凋亡相关相关蛋白的增加且细胞免疫荧光实验也发现细胞内自噬水平较shFAT10组降低。 5、通过蛋白质降解速率实验发现在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后可促进NEDD4蛋白酶体降解，且抑制PTEN蛋白酶体降解。最后通过泛素化实验证实FAT10通过抑制NEDD4的泛素化水平从而稳定NEDD4蛋白表达。结论： FAT10通过稳定NEDD4蛋白进而调控PTEN/AKT信号通路诱发自噬，最终导致肝癌细胞对索拉非尼耐药。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌 FAT10蛋白索拉非尼

3. 原发性肝细胞癌合并微血管侵犯的危险因素及预后分析

[学位论文] 唐郑一吉林大学 2020年硕士导师: 杨岚岚共61页

摘要 : 目的：回顾性分析2016年1月至2017年12月吉林大学附属医院收治的行根治性肝切除术的原发性肝细胞癌患者的临床及病理资料，对原发性肝细胞癌合并微血管侵犯的临床危险因素进行分析；并进一步探讨微血管侵犯对单发≤2cm原发性肝细胞癌患者预后的... 展开目的：回顾性分析2016年1月至2017年12月吉林大学附属医院收治的行根治性肝切除术的原发性肝细胞癌患者的临床及病理资料，对原发性肝细胞癌合并微血管侵犯的临床危险因素进行分析；并进一步探讨微血管侵犯对单发≤2cm原发性肝细胞癌患者预后的影响。以期指导临床医生综合评估患者病情，制定最佳治疗方案，降低术后早期复发率，提高总生存率，实现肝癌临床个体化精准治疗，使患者获益最大化。方法：本研究收集吉林大学附属医院2016年1月至2017年12月收治的行根治性肝切除术的原发性肝细胞癌患者的临床及病理资料，共计326例，经纳入标准、排除标准进行筛选后，进入本研究的患者共计191例，其中单发≤2cm的肝细胞癌患者62例。（一）统计191例患者术前临床资料和术后病理资料，根据术后病理是否存在微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）将患者分为A组：MVI阳性；B组：MVI阴性，分析原发性肝细胞癌合并MVI的相关危险因素。（二）统计62例患者的一般临床资料、术后病理资料及随访信息，根据术后病理是否存在MVI将患者分为C组（MVI阳性）和D组（MVI阴性），明确MVI对单发≤2cm原发性肝细胞癌预后的影响。建立完善研究资料登记表并逐一记录，整理归纳各变量特征。所有数据资料均采用SPSS25.0统计软件进行分析处理，对原发性肝细胞癌患者的相关资料进行单因素分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态计量资料采用中位数（四分卫间距）表示，比较用T检验或Mann-Whitney U检验；计数资料比较用卡方检验或非参数检验或Fisher确切概率法。将有统计意义的危险因素纳入二元Logistic回归模型进行分析。应用Kaplan-Meier法及Log-Rank检验分析患者术后生存时间，以上均以P<0.05认为有统计学意义。结果： 1.共收集行根治性手术切除的原发性肝细胞癌病例资料191例，据术后病理是否存在MVI分为A组：MVI阳性；B组：MVI阴性，其中A组91例（47.6%），B组100例（52.4%）；男性患者153例（80.1%），女性患者38例（19.9%），平均年龄（57.07±8.79）岁。对原发性肝细胞癌患者相关临床及病理参数进行单因素分析显示，两组患者的性别、年龄、乙肝病史、丙肝病史、肝硬化病史、肝功能Child-Puch分级、ALT、AST、TB、ALB、ALP、GGT、PLT、PT、乙肝病毒DNA定量、谷草转氨酶-血小板比值（aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index，APRI）、卫星结节及肿瘤数目，差异均无统计学意义（P＞0.05）；而在AFP（P=0.004）、中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）（P=0.011）、血小板-淋巴细胞比值（platelet-to-lymphocyte ratio，PLR）（P=0.019）、肿瘤大小（P=0.002）、肿瘤分化程度（P=0.014），差异具有统计学意义（P＜0.05）。将具有统计学意义的指标纳入二元Logistic回归分析显示，术前血清AFP（P=0.004)和肿瘤大小(P=0.018)是原发性肝细胞癌合并MVI的独立危险因素。进一步对AFP和肿瘤大小进行ROC曲线分析显示，AFP和肿瘤大小的受试者工作特征曲线下面积(area under the curve of ROC,AUC)分别为0.676和0.630，最佳截断值分别为213.6ug/L（灵敏度和特异度分别为65.9%和69%）和4.25cm（灵敏度和特异度分别为61.5%和63%），表明两者预测原发性肝细胞癌MVI发生均具有一定价值，但诊断准确性稍欠佳，而将两项指标联合起来进行ROC曲线分析时，AUC为0.735(P＜0.05)，高于单个指标的AUC，表明两项指标联合预测MVI发生的效能高于单个指标。 2.共收集行根治性手术切除的单发≤2cm原发性肝细胞癌病例62例，据术后病理是否存在MVI分为C组：MVI阳性,共21例（33.9%）;D组：MVI阴性,共41例（66.1%）。其中男性42例（67.7%）、女性20例（32.3%），平均年龄（57.08±7.48）岁，年龄范围：38-72岁；有肝炎（乙/丙肝）病史55例（88.71%），无肝炎患者7例(11.29%)；有肝硬化患者58例(93.55%)，无肝硬化患者4例(6.45%)；肝功能Child-Puch A级59例(95.16%)，B级3例(4.84%)；AFP≤20ug/L的患者34例(54.8%)，20ug/L＜AFP≤400ug/L的患者19例(30.6%)，AFP＞400ug/L的患者9例(14.5%)；根据随访患者有无术后治疗分为有术后治疗者共29例(46.77%)，无术后治疗者共33例(53.23%)。上述临床及病理资料两组患者间均无统计学差异（P＞0.05）。随访时间截止至2019年12月31日，C组平均总生存时间为（30.86±7.81）个月，D组的平均总生存时间为（34.54±5.63）个月，两组间差异具有统计学意义（P=0.037）；C组平均无瘤生存时间为（22.02±11.62）个月，D组的平均无瘤生存时间为（29.65±9.42）个月，两组间差异具有统计学意义（P=0.007）。Kaplan-Meier生存分析显示C、D两组1、2、3年累计生存率相比分别为95.2%vs100%,84.4%vs97.6%,和73.9%vs92.7%，两组差异具有统计学意义（P=0.043）；C、D两组1、2、3年累计无瘤生存率相比分别为71.4%vs90.2%，46.6%vs78%，和38.8%vs65%，两组差异具有统计学意义（P=0.019）。结论： 1.术前血清AFP，炎症间接比值指标：NLR、PLR，肿瘤大小及肿瘤分化程度与原发性肝细胞癌MVI发生相关，其中术前血清AFP和肿瘤大小为原发性肝细胞癌合并MVI的独立危险因素。两者预测原发性肝细胞癌MVI的发生均具有一定价值，但诊断准确性稍欠佳，而两者联合预测MVI发生风险的效能高于单个指标。 2.单发≤2cm肝细胞癌存在MVI提示预后不良，MVI阳性患者累计无瘤生存时间和累计总生存时间均小于MVI阴性患者，所以临床上对此类患者我们仍需考虑是否存在MVI，以作出最佳治疗决策，实现肝癌临床个体化精准治疗。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌微血管侵犯临床预后

4. 原发性肝细胞癌的微血管病理形态学研究及临床意义

[学位论文] 邓海智四川大学 1997年硕士导师: 何生共44页

关键词 : 原发性肝细胞癌微血管病理学

5. miR-372调控ATAD2基因影响肝细胞癌侵袭转移的分子作用

[学位论文] 何辉中国医科大学 2013年博士导师: 刘永锋共86页

摘要 : 原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)以下简称肝癌，是严重影响人类生存率的常见恶性肿瘤之一，发病率占恶性肿瘤的第五位，病死率占癌肿死因的第三位，每年新发病例大约60万人，大约55％来自于中国，是排在我国第二位的癌症杀手，已经严重... 展开原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)以下简称肝癌，是严重影响人类生存率的常见恶性肿瘤之一，发病率占恶性肿瘤的第五位，病死率占癌肿死因的第三位，每年新发病例大约60万人，大约55％来自于中国，是排在我国第二位的癌症杀手，已经严重威胁我国人民生命健康。对于肝癌的治疗手段比较多样，包括外科手术、肝移植、介入治疗和射频消融等，目前外科手术仍然作为肝癌病人获取长期生存率的主要手段，但是，肝癌术后5年复发率高达70％，其中80％的复发病灶发生在肝脏（肝内转移），主要是由于原发病灶在术前已出现微小转移未被发现，或术中挤压发生播散所致，导致其成为肝癌病人术后死亡的主要原因。因此，预测肝癌转移复发倾向，判断肝癌预后的肿瘤标志物，早期发现复发病灶并进行规范化治疗，提高病人总体生存率，降低死亡率是提高肝癌手术后疗效的重点和难点内容。 ATAD2(ATPase family AAA domain-containing protein2)基因，定位于人染色体8q24.13，在一些肿瘤中参与调控染色质动力活性、基因组转录活性和细胞凋亡过程。其编码蛋白质具有两个结构域:AAA区域和溴区结构域(Bromodomain)。AAA区域做为分子伴侣，执行装配、操作、分解蛋白复合物的功能;溴区结构域参与基因转录调控、细胞周期调控、信号转导，其表达异常导致恶性肿瘤发生和发展。深入研究其作用机理将为肿瘤治疗提供新的策略，有望成为新的肿瘤表面标志物和治疗靶点。目的: 本研究旨在探讨ATAD2在肝癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及与肝癌发生发展、转移及与临床病理学特征的关系，为临床治疗提供新的思路及依据。研究的第一部分我们在细胞和组织水平上检测ATAD2的表达水平，分析其与临床病理学特征的关系;研究的第二部分，通过ATAD2表达沉默细胞株，观察对其增殖和侵袭能力的影响，揭示ATAD2与肝癌发生发展、侵袭转移的关系，探讨ATAD2潜在的临床应用价值。第三部分我们通过生物信息学预测，检测到调控ATAD2的上游miR-372，分析其表达改变对靶基因ATAD2的调控作用。由此探讨miR-372可能通过调控下游ATAD2基因参与肝癌的发生发展，恢复miR-372的表达可能使肝癌的进展受到抑制。方法: 一、实验对象 2008年1月～2011年6月中国医科大学普外科肝癌患者癌和癌旁配对组织病理切片129例;2011年1月～2012年1月45例肝癌新鲜组织标本;1株正常肝细胞LO2，6株肝癌细胞SMMC7721，QGY-7701，Bel-7402，PLC5，Huh7，HCCLM3，HepG2 二、实验方法 1.细胞培养:人肝癌细胞株和人正常肝细胞常规培养。 2.Real Time PCR检测ATAD2基因mRNA在组织和细胞水平的表达。 3.Westem blot检测7株细胞及8对肝癌和癌旁组织中ATAD2蛋白表达。 4.免疫组织化学检测肝癌和癌旁组织中ATAD2蛋白表达水平。 5.免疫荧光检测ATAD2在肝癌细胞中的定位。 6.应用CCK8检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞增殖能力。 7.应用平板克隆实验检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞克隆形成能力。 8.应用Transwell实验检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞侵袭迁移能力变化。 9.应用细胞周期试剂盒检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞细胞周期变化。 10.应用miRNA agomir及miRNA antagomir瞬时转染，检测靶基因ATAD2表达变化。 11.构建ATAD2的3'UTR野生型及突变型质粒，分别与miR372质粒共转染293T细胞，应用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶变化。结果: 第一部分ATAD2基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义 1.Real Time PCR及Western Blot结果显示，ATAD2在6株人肝癌细胞中的表达水平高于人正常肝细胞LO2，且在高转移细胞株Huh7和HCCLM3表达显著升高。 2.45例肝癌组织中有转移肝癌mRNA表达量0.283，未转移肝癌mRNA表达量0.097，均显著高于对应癌旁组织0.059，差异有统计学意义(P＜0.01)。 Western Blot结果与PCR结果趋势一致，且在有转移肝癌中ATAD2表达量更高。在129例肝癌组织的免疫组化结果中，83例呈现ATAD2蛋白高表达，46例低表达。ATAD2主要表达在细胞核，细胞浆亦有表达。 3.肝癌组织ATAD2表达变化与临床病理因素结果显示，ATAD2表达与转移（P＜0.05）密切相关;而与年龄、性别、肿瘤大小等其他临床病理因素无明显相关(P＞0.05)。第二部分ATAD2基因沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响 1.选取高表达人肝癌细胞株Huh7和HCCLM3细胞，免疫荧光结果显示ATAD2蛋白表达主要位于细胞核，细胞浆亦有表达。 2.沉默表达ATAD2基因，Transwell实验结果显示，两株细胞侵袭及迁移能力下降;CCK8及平板克隆实验表明细胞增殖能力及克隆形成能力下降;细胞周期实验结果显示沉默表达ATAD2基因，细胞周期阻滞于G1/S期。第三部分miR-372对靶基因ATAD2的负调控作用 1.生物信息学预测结果提示miR372与靶基因ATAD2的3'UTR区域第335-341位点形成互补配对，且该序列在多种属间高度保守。 2.Real Time PCR结果显示miR372在肝癌中呈现低表达为29/45(64.4％)。 3.45对肝癌组织中，通过Spearman相关分析，miR372与ATAD2基因表达呈现负相关(P=0.0002，r=-0.5237)。 4.应用miR-372 agomir上调其表达后，ATAD2在RNA和蛋白水平表达均出现显著下调;应用miR372 antagomir抑制其表达后，ATAD2在RNA和蛋白水平表达均出现显著上调，差异有统计学意义。 5.荧光素酶报告基因检测结果显示，ATAD2是miR-372的直接作用靶基因。与共转染突变型(MUT) ATAD2-3'-UTR报告基因载体相比，共转染miR-372和ATAD2-3'-UTR(WT)报告基因载体时，荧光素酶活性降低(P＜0.05);共转染miR-372和预测靶位点突变载体(MUT)时，荧光素酶活性未见明显改变。结论: 1.ATAD2在肝癌细胞及组织中呈高表达，且与肝癌转移密切相关。 2.下调ATAD2表达可以抑制肝癌细胞的增殖，使肝癌细胞阻滞于G1/S期，同时也可降低其侵袭转移能力。 3.miR-372在肝癌组织中显著低表达。 4.生物信息学预测miR-372对ATAD2有负向调控作用，通过共转染及荧光素酶报告基因检测结果证实ATAD2是miR372的靶基因。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌 miR-372 ATAD2基因侵袭转移

6. mir-96和TACSTD1在原发性肝细胞癌根治术后早期复发患者中的表达及临床意义

[学位论文] 赖清波南方医科大学 2014年硕士导师: 简志祥共61页

摘要 : 背景:肝癌是目前常见的恶性肿瘤，我国肝癌死亡率占肿瘤死亡率居高不下。肝癌分原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)、胆管细胞癌(cholangio carcinoma ICC)和混合细胞癌。肝癌治疗方法首选是手术切除即是肝部分切除术。中国肝癌大多数是由... 展开背景:肝癌是目前常见的恶性肿瘤，我国肝癌死亡率占肿瘤死亡率居高不下。肝癌分原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)、胆管细胞癌(cholangio carcinoma ICC)和混合细胞癌。肝癌治疗方法首选是手术切除即是肝部分切除术。中国肝癌大多数是由于肝炎、肝硬化导致，所以大部分肝癌因患者肿瘤自身条件不能手术。很多肝癌患者行肝癌根治性切除后肝内复发，目前尚没有较好预测复发的检测，复发可能与肝癌患者本身生物遗传物质改变有关。肝癌根治性切除术后复发率在第一年内较高[1]，而且复发患者的预后也较其他晚期复发的患者差。因此肝癌术后是否早期复发成为了影响患者预后的重要原因。找出影响肝癌早期复发发生的关键信号通路及靶基因，并采取有效措施，提高肝癌根治性的可切除术率和疗效。我们的前期研究工作建立起了符合基因组学研究的较完善的肝癌数据标本库[2]，并利用AffymetrixU133 plus2.0芯片在全基因组范围内比较了10例术后1年内复发及10例术后超过2年未复发的两组肝癌患者基因表达谱的差异，发现了一批与肝癌早期复发相关的敏感基因。具有重要意义的是发现盘状结构域受体酪氨酸激酶[3](discoidin domain receptor tyrosine kinase1，DDR1)基因;在早期复发组，均明显上调，提示DDR1基因显著上调与肝癌的早期复发密切相关。进一步的RT-PCR及western-blot实验也证实DDR1基因在早期复发患者肝癌组织中表达量明显高于非早期复发患者，DDR1基因高表达与肝癌的高侵袭性密切相关。这高度提示，DDR1基因有可能成为肝癌基因治疗的一个新的敏感分子靶标。前期研究者又利用miRNA芯片(Agilent)技术比较了术后1年内复发及术后超过2年未复发的两组肝癌患者在全基因组范围mi RNA表达谱的差异，发现与肝癌早期复发转移相关的一些差异表达的MicroRNA，其中miR-96通过生物信息学技术预测可能与DDR1基因表达密切相关，及miRNA芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的miRNA，发表《利用芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的microRNA》[4]，其中发现miR-96是其中一个表达明显下调的miRNA。既往研究中，miR-96在胰腺癌中可作为肿瘤抑制性miRNA直接靶向KRAS基因，在临床标本中，miR-96表达下调或消失，而KRAS却表达上调，体外研究显示miR-96通过KRAS下调相关的方式降低癌细胞侵袭和迁移，其他研究还发现miR-96在乳腺癌[5、6]、前列腺癌发生发展中起负性调控作用。前期研究利用基因芯片技术在全基因组范围内检测了早期复发组和非早期复发组肝癌并且比较其基因表达谱的差异，筛选了与肝癌早期复发相关的敏感基因，研究发现了一批在早期复发组较非早期复发组中表达上调及下调的基因，这些差异表达基因主要为细胞黏附运动相关基因、细胞代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞凋亡周期相关基因等等。其中肿瘤相关钙离子信号转导蛋白1(TACSTD1)[3]基因属于其中的细胞粘附运动相关基因，是一种癌相关抗原，在内皮细胞和胃肠道肿瘤中表达，与细胞黏附作用相关。近年相关研究发现可以作为免疫治疗的靶分子，在其他肿瘤如食管癌[7]、宫颈癌[8]均证实TACSTD1在其癌组织中高表达。目的: 运用实时荧光定量PCR技术和免疫组化技术在大样品的基础上验证miR-96和TACSTD1在原发性肝细胞癌根治术后早期复发组与非早期复发组肝癌之间表达水平的差异，从而探讨miR-96和TACSTD1的表达与肝细胞癌根治术后早期复发关系。方法: 根据筛选标准，早期复发定义为复发时间自肝癌根治术后至肿瘤复发在一年以内，非早期复发定义为自肝癌根治术后2年以上未见复发，从广东省人民医院肝胆外科行肝癌根治术的病例中筛选出61例，标本组织均为深低温冻存的。其中肝癌术后早期复发组为33例（根治术后1年内出现肝内复发病灶），28例为非早期复发组（术后超过2年未出现肝内复发病灶）。收集61例病例的一般临床资料及肿瘤资料包括性别、年龄、肿瘤直径、有无脉管癌栓、有无肝内转移、有无门脉癌栓、病理分级等。分别采用实时荧光定量PCR验证miR-96及免疫组化技术验证TACSTD1在两组肝细胞癌组织的表达水平。采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差((x)±s)表示，采用两独立样本t检验，方差不齐者采用非参检验;计数资料采用卡方检验，理论频数小于5者采用连续性校正卡方检验;P＜0.05为差异有统计学意义。结果: 1、早期复发组与非早期复发组肝癌一般临床资料的比较肝癌根治术后早期复发组与非早期复发组中一般临床资料中肿瘤直径的差异(P＜0.001)有统计学意义;在此次研究中提示肿瘤直径可能是肝癌根治术后早期复发密切相关的一个因素，而其他如年龄、性别、脉管癌栓、是否肝内转移、病理分级高低、门脉癌栓等因素与早期复发是否有关系尚待进一步研究。 2、实时荧光定量PCR检测miR-96在肝癌细胞中的表达实时荧光定量PCR检测miR-96在61例肝癌组织中的表达水平结果显示，相对于非早期复发组肝癌组织，miR96在早期复发组肝癌组织中表达明显下调[(0.634±0.783) VS(5.182±11.321)，P=0.016]，下调达8.174倍，两组比较在统计学上差异有统计学意义。 3、miR-96在肝癌中的表达量与临床病理特征的关系根据miR-96在肝癌组织中的相对表达量数值的中位数为界，将61例肝癌病例组分为高表达组和低表达组，运用统计分析显示，miR-96在肝癌中的表达量与肿瘤直径的大小(X2=4.761，P=0.029)、肝癌术后早期复发(X2=4.867，P=0.027)有关，有统计学差异，与其余特征无统计学差异。 4、免疫组化法检测TACSTD1在肝癌细胞中的表达 TACSTD1在阳性对照（食管癌组织）染色定位为细胞膜，呈棕黄色染色，在正常肝组织中呈阴性表达，在本实验中阳性染色定位于细胞膜;61例肝癌组织中表达总阳性率为8.2％(5/61)，其中在早期复发组中阳性表达率为9.09％(3/33)，非早期复发组中阳性表达率为7.14％(2/28);TACSTD1在早期复发组和非早期复发组表达差异无统计学意义(P=0.999)。结论: 1、肿瘤直径大小是肝癌根治术后早期复发密切相关的一个因素，而其他如年龄、性别、脉管癌栓、是否肝内转移、病理分级高低、门脉癌栓等因素与早期复发是否有关系尚待进一步研究; 2、miR-96在早期复发组肝癌中的表达远低于非早期复发组，与肝癌术后早期复发有密切关系，且miR-96在肝癌中的表达量与肿瘤直径的大小、肝癌术后早期复发有关，miR-96有可能成为肝癌根治术后预测肝癌复发的分子标志物; 3、TACSTD1与肝癌根治术后早期复发的关系尚不能确定，有待进一步研究。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌 miR-96 靶基因根治术

7. 环状RNA cFUT8在肝癌中的表达及其与预后关系的研究

[学位论文] 宁静苏州大学 2020年硕士导师: 朱虹共50页

摘要 : 目的：探讨环状RNA cFUT8在原发性肝细胞癌组织中的表达水平及其对预后的影响。方法： 1、收集217例HCC患者的癌组织及配对的瘤旁正常组织标本，采用Arraystar人类环状RNA芯片对随机选择的3对HCC临床标本进行筛选，筛选标准为log2(F... 展开目的：探讨环状RNA cFUT8在原发性肝细胞癌组织中的表达水平及其对预后的影响。方法： 1、收集217例HCC患者的癌组织及配对的瘤旁正常组织标本，采用Arraystar人类环状RNA芯片对随机选择的3对HCC临床标本进行筛选，筛选标准为log2(FC)f＞1、P＜0.05，选出最显著差异性上调的环状RNA，进行ORT-PCR验证。 2、通过qRT-PCR测定cFUT8在肝癌组织的表达水平，明确cFUT8与临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法分析cFUT8表达与患者生存时间的关系，采用log-rank(Mantel-Cox)检验分析组问差异。 3、使用qRT-PCR验订E Hep3B，97L，PLC，HLE，Huh7和HepG2等6个肝癌细胞系和肝正常细胞系LO2中的cFUT8表达水平。Transwell侵袭实验验证各细胞系侵袭能力，探讨二者相关性。 4、构建cFUT8过表达载体和空白载体，分别转染到肝癌Huh7和HepG2细胞系中后观察细胞形态。 5、使用3种siRNA特异性敲低Huh7和HepG2细胞系中cFUT8，通过qRT-PCR再次验证cFUT8敲低效率。选出敲低效率最显著的一组再次进行Transwell侵袭实验检测侵袭能力，以及进行动物实验观察敲低cFUT8后对肝癌细胞在体内的转移、增殖能力的影响。结果： 1、通过Arraystar circRNA芯片，筛选出肝癌样本中符合条件的环状RNA有127个(上调113个，F调14个)，其中has_circRNA_101368(cFUT8)表达量显著上调约11.44倍(FC=11.44)。随后在57对癌组织/正常组织中验证肝痛组织中的cFUT8表达水平明显增高(P＜O.01)。 2、cFUT8的表达水平与肝癌的临床分期(P＜O.001)、病理分级(P＜O.001)和淋巴结浸润有关(P＜0.005)。Kaplan-Meier生存曲线提示cFUT8表达水平与HCC患者的总生存率(P=O.0023)和无病生存率(P=O.0057)成负相关。 3、与肝正常细胞系LO2相比，cFUT8在Hep3B，97L，PLC，HLE，Huh7和HepG2等6个HCC细胞系中显著上调，同时cFUT8的表达水平与体外侵袭能力成正相关。 4、cFUT8过表达时，Huh7和HepG2细胞显示间充质形态，而对照细胞则表现出上皮形态。 5、与对照组相比，敲除cFUT8则显著抑制Huh7和HepG2细胞的侵袭活性(P＜0.01)，同时NOD-SCID小鼠肝脏转移性结节明显减少，皮下移植瘤体积显著缩小(P＜0.011)。结论： cFUT8在肝癌组织中高表达，使得肿瘤侵袭、转移、增殖能力增强，与肝癌不良预后相关，可为肝癌的治疗和诊断提供新视角。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌环状RNA 侵袭能力预后评价

8. Notch受体和配体在原发性肝细胞癌中的表达及其意义

[学位论文] 杨彦伟新乡医学院 2012年硕士导师: 臧运金共48页

摘要 : 目的：研究Notch信号通路中Notch-1、Notch-2受体和Jagged-1、Dll-1配体蛋白在原发性肝细胞癌组织和健康供者正常肝脏组织中的表达情况，分析这4种蛋白各自在两组组织中表达的差异性，探讨Notch-1、Notch-2受体和Jagged-1、Dll-1配体在原发性肝细胞癌... 展开目的：研究Notch信号通路中Notch-1、Notch-2受体和Jagged-1、Dll-1配体蛋白在原发性肝细胞癌组织和健康供者正常肝脏组织中的表达情况，分析这4种蛋白各自在两组组织中表达的差异性，探讨Notch-1、Notch-2受体和Jagged-1、Dll-1配体在原发性肝细胞癌发生发展中的作用及其临床意义。方法：收集2010年至2011年在武警总医院器官移植研究所行原位肝移植患者的受者和健康供者正常肝组织标本，选取30例原发性肝细胞癌组织和对应健康供者正常肝脏组织为研究对象。应用免疫组织化学染色PV二步法分别检测肝癌组织和健康供者正常肝组织中Notch受体(Notch-1、Notch-2)和配体(Jagged-1、Dll-1)的表达情况。采用非参数检验分析Notch受体、配体在原发性肝细胞癌组织和健康供者正常肝脏组织中表达的差异性，应用Spearman相关分析原发性肝细胞癌组织中Notch受体与配体表达的相关性以及与临床病理资料的相关性。结果：Notch-1表达定位于细胞质及细胞核，30例原发性肝细胞癌组织中阳性率为86.67%(26/30)，30例健康供者正常肝组织中的阳性率为40.00%(12/30)。Notch-1在原发性肝细胞癌组织中的表达高于在健康供者正常肝组织中的表达(Z=-3.719，P=0.000)。Notch-2表达定位于细胞质，原发性肝细胞癌组织中的阳性率为73.33%(22/30)，健康供者正常肝组织中的阳性率为63.33%(19/30)。Notch-2在两组组织中表达的差异无统计学意义(Z=-1.115，P=0.265)。Jagged-1表达定位于细胞质，原发性肝细胞癌组织中的阳性率为76.67%(23/30)，健康供者正常肝组织中的阳性率为46.67%(14/30)。Jagged-1在原发性肝细胞癌组织中的表达高于在健康供者正常肝组织中的表达(Z=-3.369，P=0.001)。Dll-1表达定位于细胞质，原发性肝细胞癌组织中的阳性率为70.00%(21/30)，健康供者正常肝组织中的阳性率为53.33%(16/30)。Dll-1在两组组织中表达的差异无统计学意义(Z=-0.041，P=0.963)。原发性肝细胞癌组织中相对于健康供者正常肝脏组织高表达的是Notch-1受体和Jagged-1配体，分析二者在肝癌组织中表达的相关性显示：在原发性肝细胞癌组织中Notch-1受体的表达与Jagged-1配体的表达存在低度正相关关系(rs=0.379，P=0.039)。分析原发性肝细胞癌组织中高表达的Notch-1、Jagged-1与临床病理资料相关性：Notch-1在肝癌组织中的表达与年龄、分化程度、AFP、肿瘤大小不相关(rs=0.308、P=0.098；rs=0.018、P=0.926；rs=0.162、P=0.393；rs=0.011、P=0.954)；Jagged-1在肝癌组织中的表达与年龄、分化程度、AFP、肿瘤大小不相关(rs=-0.116、P=0.543；rs=-0.219、P=-0.303；rs=0.326、P=0.078；rs=0.201、P=0.288)。结论：Notch受体(Notch-1、2)和配体(Jagged-1、Dll-1)在原发性肝细胞癌组织和健康供者正常组织中均表达。在正常肝脏组织中的表达可能参与了维持正常肝细胞形态及分化。Notch-1、Jagged-1在肝癌组织中的表达水平比正常肝组织明显升高，对原发性肝细胞癌的发生发展可能有促进作用。在原发性肝细胞癌组织中高表达的Notch-1和Jagged-1的相关性研究中发现二者存在低度正相关，说明了二者在原发性肝细胞癌发生发展过程中既互相协同但又各自发挥作用。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌 Notch受体配体基因表达

9. 原发性肝细胞肝癌血供特点的螺旋CT表现及其与病理学特性的相关性研究

[学位论文] 黄娟四川大学 1999年硕士导师: 周翔平共44页

摘要 : 目的:探讨原发性肝细胞性肝癌(Primary Hepatocelluar Carcinoma,PHCC)的血供方式及其与癌细胞分化程度、组织学类型和生长方式的相关性.材料和方法:收集50例行螺旋CT扫描(平扫+动脉期进床式动态扫描/同层动态扫描+门静脉期扫描),并经手术病理证实的... 展开

关键词 : 原发性肝细胞癌血供病理学螺旋CT

10. 原发性肝细胞癌患者根治性手术术后1年内复发的危险因素分析

[学位论文] 阎文心吉林大学 2020年硕士导师: 张平共38页

摘要 : 目的：原发性肝癌是第六位最常见恶性肿瘤，第三位常见的癌症死亡原因。原发性肝癌包括原发性肝细胞癌（HCC）、原发性肝内胆管细胞癌及混合型，其中以原发性肝细胞癌居多。HCC治疗方式较多，包括手术切除、射频消融、肝动脉栓塞化疗、靶向药物... 展开目的：原发性肝癌是第六位最常见恶性肿瘤，第三位常见的癌症死亡原因。原发性肝癌包括原发性肝细胞癌（HCC）、原发性肝内胆管细胞癌及混合型，其中以原发性肝细胞癌居多。HCC治疗方式较多，包括手术切除、射频消融、肝动脉栓塞化疗、靶向药物、放疗等多种治疗方案，但首选手术切除。HCC术后1年内复发率较高，患者术后较高复发率与术前相关因素有一定关系。本研究就是通过回顾性分析了125例接受根治性肝切除术的HCC患者。并从中寻找分析HCC术后1年内复发的独立危险因素。为HCC临床治疗及术后预后的判断提供一定的帮助。方法：收集2016年10月-2017年10月在吉林大学第一医院实行根治性肝切除术的HCC患者的临床资料。从中罗列出HCC根治性手术术后1年内复发的可能危险因素。这些因素包括（1）患者个体基本信息：性别、年龄、饮酒史、吸烟史、高血压史、糖尿病史、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染；（2）生化检查资料：AFP水平、肝纤维化程度、吲哚氰绿清除试验、门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶水平及中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）。（3）肿瘤特点：肿瘤直径、肿瘤数目、血管受侵；（4）手术相关资料：术中输血量。通过卡方检验，对以上所有危险因素进行单因素分析。将卡方检验有意义的单因素纳入二元分类logistic回归分析，得出HCC术后1年内复发的独立危险因素。结果： 1.125例HCC患者经根治性肝切除术后1年内复发例数为41例，1年复发率为32.8%。 2.将所有可能复发因素通过卡方检验进行单因素分析，以P≤0.1为标准。结果：显示：AFP>200ng/ml、肝纤维化程度>F2、肿瘤数目>1个、肿瘤直径>5cm、血管侵犯及NLR>3是HCC患者术后1年内复发的危险因素（P均≤0.1）。性别、年龄、是否有糖尿病史、是否有高血压病史、是否有吸烟史、是否有饮酒史、是否感染乙型肝炎病毒、是否感染丙型肝炎病毒、AST、ALT及ICG15与HCC术后1年内复发无关（P均>0.1）。 3.将经卡方检验进行单因素分析得出的结果（P≤0.1），纳入二元logistic回归分析，以P<0.05为标准。结果显示：肝纤维化程度（P=0.003）、血管侵犯（P=0.002）是HCC患者经根治性肝切除术后1年内复发的独立危险因素（P均<0.05）。AFP>200ng/ml、肿瘤数目>1个、肿瘤直径>5cm及NLR>3不是HCC患者经根治性肝切除术后1年内复发的独立危险因素（P均>0.05）。结论：通过对125例患者数据研究分析得出，HCC患者经根治性肝切除术后1年内复发的危险因素包括：AFP>200ng/ml、肝纤维化程度＞F2、肿瘤数目>1个、肿瘤直径>5cm、血管侵犯及NLR>3。其中肝纤维化程度＞F2及血管侵犯是HCC患者经根治性肝切除术后1年内复发的独立危险因素。收起

关键词 : 原发性肝细胞癌根治性手术术后复发