中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 邵建明中国科学院大学 2017年博士导师: 曾长青共166页

摘要 : 作为世界上主要的三大高原人群之一，藏族人在青藏高原已经生存和繁衍了万年以上。长时间在高原环境的生存使得藏族人形成了适应性的生理表型，如各类急慢性高原病发病率极低。解析藏族人群的高原适应机制将有助于对各类急慢性高原病发病机制的理解，... 展开作为世界上主要的三大高原人群之一，藏族人在青藏高原已经生存和繁衍了万年以上。长时间在高原环境的生存使得藏族人形成了适应性的生理表型，如各类急慢性高原病发病率极低。解析藏族人群的高原适应机制将有助于对各类急慢性高原病发病机制的理解，最终可应用于各类急慢性高原病的预防和治疗。近年来，国内外的研究人员对藏族人高原适应遗传机制的研究报道了血红蛋白浓度相关且重现性最好的两个候选基因，EPAS1和EGLN1。虽有研究报道EPAS1启动子区域内的突变可以影响EPAS1自身表达水平，但是EPAS1基因功能机制仍不清楚，表现为:1）并未在该基因发现汉、藏频率显著分化的编码区突变;2）其藏族人群高度特异的后三分之二的单体型的关键功能突变位点仍不清楚。此外，目前缺乏对除EPAS1之外的其他的候选基因的研究，如这些基因是否受选择？潜在的功能机制是什么？利用候选基因捕获测序，对82个候选基因与藏族人高原适应的可能机制进行探索。通过多种群体遗传学分析方法、多组学的染色质活性状态功能数据、增强子功能实验验证、染色质空间构象捕获等技术，尝试探索如下问题:1）通过fine mapping探索候选基因是否存在受到选择的编码区突变;2）对于无蛋白编码区突变的候选基因，其非编码区是否具有潜在的调控元件？若有，这些调控元件都可能调控哪些基因？通过多种群体遗传学方法，筛选出6个高置信度的藏族人高原适应相关的正选择基因，非编码区功能评估显示EPAS1和EGLN1较其他基因的潜在活性非编码区更多。对EPAS1增强子功能实验验证出12个中的4个非编码区域具有增强子活性(E1、E2、E3和E4)。其中E1、E3、E4具有allele specificity，可能能够以启动子或增强子的功能影响EPAS1自身的转录。体外凝胶迁移率变化实验证实E4内的两个SNPs会影响蛋白质对该区域的结合。进一步4C实验发现，不同氧浓度处理下的一些与E4相互作用的区域会发生变化。对于EDAR证实其在藏族人中受到正向自然选择，且发现EDAR内有10和5个SNPs分别与血氧饱和度(SaO2)和血小板数相关联。发现SaO2关联的SNPs能解释藏族人和安第斯人平均SaO2差异的1/4。进一步功能注释发现rs10865026and rs3749110分别位于潜在的增强子区域内，可与EDAR、CCDC138基因的启动子形成相互作用。 EGLN1基因单体型网络分析显示藏族人和安第斯人受到选择的突变和单体型不同。该基因内4个非编码区域中含有rs12406290的区域具有allele specific的顺式作用元件功能，能与TSNAX和NPAT基因的启动子形成相互作用。DISC1基因的重测序发现一个与神经认知功能相关的汉、藏频率显著差异的错义突变rs3738401和与藏族人的主肺动脉内径相关且位于增强子内的非编码区突变rs16854730，该增强子可与EGLN1和DISC1基因的启动子形成相互作用。此外，功能注释发现三个物理位置上临近的SNPs位于同一个潜在的增强子内，且该区域与EGLN1、DISC1、LINC00582基因的启动子区域具有相互作用。综上，推测EPAS1、EGLN1、EDAR、DISC1四个基因的非编码区域在藏族人的高原适应中具有重要的作用。这些非编码区域可能是潜在的增强子区域，位于这些区域的突变可通过影响转录因子的结合而影响增强子的活性，最终影响这些增强子调控基因的转录水平。收起

关键词 : 急慢性高原病藏族人高原适应性遗传机制候选基因测序

2. 应用外显子组测序技术的早发结直肠癌肝转移研究

[学位论文] 宫轲楠中国科学院大学 2015年博士导师: 曾长青共166页

摘要 : 结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，转移是其最主要的死亡原因。此外，促使结直肠癌早发（发病年龄≤50岁）的分子机制尚不明确。为了了解结直肠癌原发肿瘤与肝转移瘤在基因组水平上的差异、克隆组成，并探究参与结直肠癌早发... 展开结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，转移是其最主要的死亡原因。此外，促使结直肠癌早发（发病年龄≤50岁）的分子机制尚不明确。为了了解结直肠癌原发肿瘤与肝转移瘤在基因组水平上的差异、克隆组成，并探究参与结直肠癌早发的分子事件，我们应用外显子组测序及全基因组SNPs分型芯片技术在基因组变异和拷贝数变异方面对配对的原发肿瘤及转移瘤进行解析。首先，通过对4例患者的原发与转移肿瘤进行外显子组测序，我们发现已报道的肿瘤驱动突变基因如APC、TP53、KRAS、PIK3CA、SMAD4、ATM、PTEN等只存在于部分患者中。虽然患者间的突变基因不一致，但这些突变基因都富集于WNT、TGF-β、PI3K、RAS、P53多条已知在结直肠癌中失调的信号通路。通过对4例患者的肿瘤进行拷贝数变异分析，发现只有13q的扩增为共有的大片段拷贝数变异(broad copy number variation);集中拷贝数变异(focal copy number variation)中包含位于普通型脆性位点(common fragile site)的基因，提示肿瘤内部存在很强的DNA复制压力。其次，肿瘤内部存在异质性，患者1中驱动基因KRAS、PIK3CA的突变状态在原发瘤与转移瘤间不一致;患者2中的原发瘤多处取点间的突变谱及拷贝数变异存在异质性，根据突变的分布关系我们推测3处转移瘤是来自于不同原发肿瘤取点的子代。第三，虽然肿瘤内部存在异质性，但在同一病人中，原发瘤与转移瘤共有的突变及拷贝数变异包含了所有的已知驱动突变基因。通过突变谱、大片段变异、集中拷贝数变异及拷贝数变异断点在肿瘤间的分布关系，我们构建了进化树并认为肿瘤呈分支进化，且原发瘤与转移瘤来自同一克隆起源。应用克隆组成分析，我们发现在原发瘤与转移瘤中均存在一个优势克隆，且其优势在肿瘤的发展过程中保持稳定。最后，早发结直肠癌中存在高比例的拷贝数变异及杂合度缺失，且存在CpT_pT背景下T＞G的富集。此外，在患者2中APC1309号密码子5 bp碱基缺失存在体细胞嵌合现象，推测其为结直肠癌早发的原因之一。收起

关键词 : 早发型结直肠癌外显子组测序体细胞变异肝转移

3. 高海拔人群历史及适应的基因组学研究

[学位论文] Muhammad Sohail Raza 中国科学院大学 2019年博士导师: 曾长青共155页

摘要 : 高原地区是史前人类征服的地球上最后一些区域之一。青藏高原和喜马拉雅山脉是阻挡人类迁徙的地理屏障，限制了人群间的遗传交流，然而长期以来人们依然可以通过周围的山谷和丝绸之路进行商品和文化交流。虽然高原地区的多次外来移民对当地的遗传连续... 展开高原地区是史前人类征服的地球上最后一些区域之一。青藏高原和喜马拉雅山脉是阻挡人类迁徙的地理屏障，限制了人群间的遗传交流，然而长期以来人们依然可以通过周围的山谷和丝绸之路进行商品和文化交流。虽然高原地区的多次外来移民对当地的遗传连续性非常重要，我们目前仍然不清楚高海拔地区藏族人的起源和人群历史。以往的全基因组水平研究试图阐明藏族的人群历史和印记，但是目前还没有详细研究能描述从古人类到当今藏族和其他喜马拉雅人群的基因交流与迁徙事件细节，这些事件对于高原对藏人群的分支和演化的贡献程度也都不清楚。本人群历史研究中，我们汇集了来自中国西藏、尼泊尔、北印度和不丹的48个种族的850个样本的基因型数据，包括12例我们新测藏族样本的全基因组测序数据，是目前样本数最多的喜马拉雅山区人群数据集。此外，我们还收集了六个古人类和553个古现代人类的遗传数据，时间跨度为从欧亚大陆的旧石器时代至吐蕃王朝建立和中世纪时期。结果表明最早居住在喜马拉雅山区的可能是起源于东亚的史前高海拔人群，虽然如今此地区观察到了不同的文化和丧葬形式，但是当地人群在几千年里保持了遗传连续性。通过分析目前已知的最早定居在高原地区的藏族样本，我们发现该个体包含来自欧亚大陆和东南亚多个地区的狩猎采集人群的祖先成分，表明当时的高原地区主要由史前的觅食者占据。此外，新石器时代的东南亚农耕人群和青铜时代及铁器时代的欧亚大草原游牧民族是对藏族人群另一层的祖先遗传贡献，提示来自欧亚大陆和东南亚的不同人群通过古老的欧亚大草原和丝绸之路网络迁徙至高原地区并进行了接触。在本研究中，我们通过全基因组扫描来鉴定安第斯人、藏族人和夏尔巴人在自然选择下的基因组特征，并结合各自的适应性表型进行对比分析。我们将对照组的27个来自低海拔地区的汉族样本（包含24个新样本和三个公共样本）进行了深度(～30X)的全基因组测序。我们的数据表明，钙信号通路和血管平滑肌细胞收缩通路在藏族人和安第斯人中均受到自然选择，表明血管性因素可能是人类适应高海拔环境的方式之一。此外，低氧诱导通路是藏族和夏尔巴人的共有候选通路。随后我们鉴定了几个在高海拔适应表型中可能发挥作用的编码和非编码的变异。值得注意的是，SPRTN的rs2437150和ADH1B的rs1229984在近期经历了正选择。我们通过三维结构分析研究了rs2437150和rs1229984的等位基因特异的蛋白质互作机制，并且发现这种机制可能有助于高海拔地区人群的心脏功能和紫外线辐射抗性。OCA2基因的一个错义多态(rs1800414)与黑色素生成显著相关。该位点与皮肤颜色变黑相关的等位基因在藏族中频率较高。此外，EDAR的两个位点rs10865026和rs3749110分别与藏族样本的血氧饱和度和血小板数量相关。这些数据表明，喜马拉雅山区的高原人群在史前和历史上有多次人群迁移，导致其基因库中含有旧石器时代觅食者和经欧亚大草原和丝绸之路传播的人群遗传组分的混合。人类高海拔适应是一个历经高原个体的多种生理机制不断改善以动态应对长期缺氧环境的复杂进化过程。收起

关键词 : 藏族人群遗传连续性迁徙事件基因交流环境适应性高原地区

4. 低氧相关通路多态与人类复杂性状的关联性研究

[学位论文] 刘天资中国科学院大学 2019年博士导师: 曾长青共154页

摘要 : 低氧环境对人体的正常生理活动是一个巨大的挑战。低氧指的是低于空气中20.9％的氧气浓度或任何一种生理性氧量不足或组织需氧量不足的状态。本课题从藏族登山运动员的高海拔适应和中国不同地区高度近视发病机制两个方面，研究低氧环境对人体的影响及... 展开低氧环境对人体的正常生理活动是一个巨大的挑战。低氧指的是低于空气中20.9％的氧气浓度或任何一种生理性氧量不足或组织需氧量不足的状态。本课题从藏族登山运动员的高海拔适应和中国不同地区高度近视发病机制两个方面，研究低氧环境对人体的影响及相应的适应机制。藏族登山运动员作为对高海拔低氧环境适应能力最强的特殊人群，具有非常卓越的心肺功能和携氧运氧能力。为了研究藏族登山运动员高海拔低氧适应的机制，我们将运动员样本和五个不同海拔高度的非运动员藏族样本进行了基因分型，并收集了详尽的血常规、肺功能和心脏彩超数据，通过全基因组等位位点频率差异分析、FsT、iHS、EHH、通路富集、基因集合分析和数量性状关联分析等方法筛选高海拔低氧适应相关基因。前期研究发现EPAS1在藏族中与较低的血红蛋白浓度相关，我们的数量性状关联分析发现，EPAS1也与较高的心脏输出显著相关。除了EPAS1之外，CACNA1C、PRKCE、ADRA1A、EDAR、FAM149A、MCTP2和ATP6V1E2等基因均有强烈的自然选择信号，且与心肺功能和血液指标显著相关，是登山运动员的低氧适应的重要基因。通过对候选基因的通路富集分析，我们发现钙信号通路最为显著。钙离子作为重要的第二信使，参与细胞应对低氧环境时的收缩反应过程，并受ROS的调节参与低氧诱导通路。此外，钙信号通路调节的两个下游通路心脏功能疾病类通路和胰岛素分泌通路也显著富集。心脏功能和血糖调控是人体应对高原低氧刺激的重要机制。而藏族登山运动员在这两个通路上的遗传特征可能是他们具有高超低氧适应能力的关键。此外，通过在心肺功能和血液指标的上位效应研究，我们发现EPAS1和其上游基因PRKCE有非常显著的相互作用，且这种相互作用与心肺功能显著相关。这提示我们EPAS1作为重要的调控因子，通过与其他基因互作来影响藏族人的生理表型，帮助藏族人更好的适应低氧环境。我们高度近视的前期研究表明，脉络膜厚度和血流-巩膜低氧微环境是近视形成的诱因，低氧诱导、肌动蛋白细胞骨架调节和细胞外基质受体相互作用通路参与其中并发挥重要作用。在本课题中，我们分析了这三个候选通路与前期研究鉴定的近视风险基因之间的相互作用网络，并在中国不同地区的三个高度近视队列的基因分型数据中使用基因集合关联分析研究近视的遗传因素。我们发现肌动蛋白细胞骨架调节通路和细胞外基质受体相互作用通路与非极端高度近视中显著相关，而低氧诱导通路则与极端高度近视显著相关。这表明在非极端高度近视中，HIF1-α通过巩膜低氧微环境造成近视，而极端高度近视则主要是由低氧诱导通路上的遗传变异导致的。这一结论与之前关于近视的家系研究结果一致。收起

关键词 : 低氧环境登山运动员适应能力高度近视发病机制

5. 健康个体的突变模式及致病突变的研究

[学位论文] 洪雅强中国科学院大学 2018年博士导师: 曾长青共153页

摘要 : 突变不仅驱动物种进化也是许多疾病产生的重要原因。本论文系统性地分析了后合子突变在健康个体的模式，新生突变在对疾病的贡献以及胚系突变在个体表型中的影响，进一步研究了不同突变与个体健康之间的关系。第一部分研究中先通过分析健康个体的后合... 展开突变不仅驱动物种进化也是许多疾病产生的重要原因。本论文系统性地分析了后合子突变在健康个体的模式，新生突变在对疾病的贡献以及胚系突变在个体表型中的影响，进一步研究了不同突变与个体健康之间的关系。第一部分研究中先通过分析健康个体的后合子突变，发现了突变在正常细胞中累积产生的一个新的突变以及该突变是由于胚胎低氧环境导致的;第二部分结合病理性近视中新生突变的基本特征，进一步揭示了新生突变对病理性近视的影响;第三部分分析胚系突变在同卵双胞胎家系以及强直性脊柱炎家系中对表型的贡献，发现了与表型相关的胚系突变，为解释对应表型的发生机制提供新的线索。利用改进后的外显子组测序方法，通过对5个健康个体的后合子突变模式的分析，我们发现在正常细胞中普遍存在两种突变模式。其中一种突变模式(Signature A)的主要特征是在NpCpG三碱基形式上的C＞T突变，该突变模式已报道与胞嘧啶的自发脱氨基相关，且随着个体年龄增加累积。另一种突变模式(Signature B)首次被发现，该突变模式的主要特征是GpCpN三碱基形式上的C＞T突变。在肿瘤样本的配对正常细胞也存在这两种突变模式。数量性状关联分析结果提示这两种突变模式在个体突变谱中全部突变模式中的比例与DNA甲基化相关基因上的多态相关。此外，在19.6％的肾透明细胞癌的肿瘤细胞中存在高比例的GpCpN位点上的C＞T突变，同时这些肿瘤细胞的转录组数据表明其低氧诱导通路活性更高，提示Signature B的产生与低氧诱导通路的活化相关。通过对胚胎干细胞加药处理来激活低氧诱导通路，处理后的细胞基因组中的确表现出GpCpN位点上C＞T突变的显著富集。同时，对一健康个体血液和精子细胞的进行了多时点采样分析，对3年间的多组织样本后合子突变分析发现不同组织间胚胎早期的特异性突变虽然较少但都包含了Signature B，此外Signature B在监测时间段内并不随着年龄增加，提示说明了其主要在胚胎发育早期累积。综上，我们推断胚胎发育早期的低氧环境是导致Signature B在健康个体中累积的因素。第二部分新生突变研究中，通过对45个散发病理性近视患者全基因组测序数据分析，发现新生突变显著富集在细胞间信号转导、细胞生长以及脂质代谢相关通路的基因上。进一步，蛋白互作网络提示携带新生突变的基因与细胞骨架蛋白调控通路以及胞外基质受体互作通路的蛋白互作显著。这些结果共同提示了新生突变对散发病理性近视的发生发展起到了重要的作用。第三部分胚系突变研究中，分别对一同卵双胞胎家系以及一强直性脊柱炎家系与表型相关胚系突变的定位来进一步研究胚系突变对表型和疾病的影响。结果发现与同卵双胞胎性状共分离的胚系点突变以及拷贝数变异显著富集在细胞粘附相关通路的基因上，例如FGFR1、TUBB6以及MYH7B等，提示细胞粘附通路以及相关基因与双胞胎形成有关。在强直性脊柱炎家系中发现TREML2基因上的胚系突变与家系的HLA-B27阳性患者共分离，并验证了该基因在散发患者的突变率高于正常个体，提示TREML2对强直性脊柱炎在HLA-B27阳性个体的发生起到了一定的作用。这些结果对进一步了解同卵双胞胎的形成机制以及强直性脊柱炎的发生原因提供了新的线索。收起

关键词 : 发病机制后合子突变新生突变胚系突变致病突变

6. 基于转录组测序的小鼠形觉剥夺性近视机制研究

[学位论文] 罗书萌中国科学院大学 2018年博士导师: 曾长青共150页

摘要 : 近视是目前全球特别是东亚地区高发的视力异常表型，近视及其相关并发症给社会和个人造成沉重的负担，成为亟待解决的公共卫生问题。借助于动物近视模型进行近视生物学机制研究具有很重要的意义。随着高通量测序技术的发展，转录组测序已经成为广泛应... 展开近视是目前全球特别是东亚地区高发的视力异常表型，近视及其相关并发症给社会和个人造成沉重的负担，成为亟待解决的公共卫生问题。借助于动物近视模型进行近视生物学机制研究具有很重要的意义。随着高通量测序技术的发展，转录组测序已经成为广泛应用的生物学机制研究方法。本研究应用转录组测序技术对小鼠形觉剥夺性近视模型在多个诱导时间阶段的视网膜、巩膜组织进行转录组测序分析，描述形觉剥夺性近视过程中的转录组表达变化模式，发现形觉剥夺近视相关的分子信号，同时对形觉剥夺近视的分子机制及信号传导方式进行研究探讨。研究结果显示，在短期形觉剥夺上午时段表现出明显的视网膜感光通路信号，通过影响感光细胞化学分子水平起始近视分子信号，然后通过相应转录因子影响诸多基因表达，促进近视产生发展。视网膜起始的近视分子信号除了作用于视网膜本身，也有可能通过视网膜色素上皮层的吞噬作用传导于视网膜色素上皮层，引起视网膜色素上皮层的生长因子表达变化同时调控两侧的视网膜、脉络膜，继而传导至巩膜产生近视效应。在长期形觉剥夺性近视两天起始阶段，视网膜产生促进近视的化学信号分子、生长因子等负调控分子信号促进近视起始，其中Ca2+、去甲肾上腺素、β雌激素等变化较为显著。巩膜存在对脉络膜血液循环改变造成微环境改变的应激，表现出线粒体功能紊乱，可能通过去乙酰化酶通路影响HIF1a通路和PPARA通路，同时EIF2蛋白翻译通路的抑制也参与近视发生。然而在长期形觉剥夺性近视四周发展阶段，转录组表达模式发生变化，从两天的负调控作用转变为正调控作用，从近视起始阶段进入近视维持阶段。通过对小鼠形觉剥夺近视转录组研究所得到生物信息学分析结果，加深对形觉剥夺近视生物学机制的理解，对人类近视研究提供参考意义。收起

关键词 : 形觉剥夺性近视分子机制信号传导转录组测序

7. 基于转录组学解析低氧适应与习服机制和近视成因

[学位论文] 吴邓中国科学院大学 2020年博士导师: 曾长青共143页

摘要 : 转录组作为连接基因组和蛋白组的桥梁，其变化特征不仅能代表遗传物质信息的改变也更易于建立与表型的联系。例如对藏族人群的低氧适应的研究中发现，藏族人群不仅有较强的低氧适应性表型，也存在显著受选择的基因。但是由于受选择基因例如EPAS1中的被... 展开转录组作为连接基因组和蛋白组的桥梁，其变化特征不仅能代表遗传物质信息的改变也更易于建立与表型的联系。例如对藏族人群的低氧适应的研究中发现，藏族人群不仅有较强的低氧适应性表型，也存在显著受选择的基因。但是由于受选择基因例如EPAS1中的被选择位点都处于非编码区，因此较难建立基因组突变与表型之间的直接联系。由于非编码区域对基因表达存在调控关系，因此这些突变极有可能影响基因的表达。所以对藏族人群转录组的分析不仅可以在一定程度上解释藏族人群的低氧适应表型，也能建立起藏族人群基因变异与其低氧适应表型的联系。另外，随着单细胞测序技术的发展，转录组分析能让人们在细胞层面分析基因的时空特异性表达。例如可以基于单细胞测序技术对视网膜的各种细胞类型在近视形成过程中的作用进行全面分析阐述。本课题通过转录组学研究解析高原人群在妊娠过程中的低氧适应及习服机制。发现高海拔移居汉族人群胎盘组织基因表达更为活跃，主要表现为以激活炎症反应，细胞外基质重构等功能为主的低氧应激模式。相比与不同海拔的汉族人群，藏族人群胎盘具有更为稳定的基因表达模式，通过高表达胎盘相关基因，促进血管生成，提高能量代谢效率以及降低能量消耗等方式实现妊娠过程中的低氧适应过程。并且发现EPAS1作为低氧诱导因子，对于藏族人群中胎盘相关基因的表达起到非常重要的调控作用。且EPAS1中受选择的位点也可能产生藏族人群特异的EPAS1可变剪接模式。同时，基于单细胞转录组学对近视形成过程中小鼠视网膜的各种细胞变化进行了全面阐述。发现形觉剥夺并未对小鼠视网膜的细胞类型及各类型的细胞数量产生显著影响，但对各个细胞类型的基因表达以及相关通路都有广泛的显著抑制作用。例如近视相关基因Vip及早期生长因子Egr4等均在各自高表达的细胞类群中显著下调，神经系统相关通路在给光型双极细胞及SEG类无长突细胞中被显著抑制。同时发现传递暗视觉的视杆类通路中的各细胞类型在形觉剥夺过程中均处于突触形成或信号传导被抑制的状态。因此推测形觉剥夺信号传导的减弱造成的突触发育受到抑制可能是导致近视发生的原因之一。本论文通过对藏族人群胎盘转录组的研究详细阐述了高原人群尤其是藏族人群在妊娠过程中低氧适应的机制，为解释高原人群低氧适应及习服机制提供了一定的遗传参考证据，并且为基因组突变与表型之间建立了一定的联系。基于单细胞转录组学全面分析了在近视形成过程中视网膜各个细胞类型的变化过程，为近视形成提供了一定的理论依据。收起

关键词 : 近视病理机制低氧适应习服机制转录组学

8. 基于组学技术的脊索瘤和2型糖尿病遗传与分子机制解析

[学位论文] 管晓楠中国科学院大学 2019年博士导师: 曾长青共127页

摘要 : 随着组学技术的发展，复杂疾病的致病机制研究进入了大数据时代。基于转录组测序、DNA甲基化测序、CRISPR/Cas9基因编辑、染色质构象捕获等技术对脊索瘤及2型糖尿病的疾病分子机制进行了解析。脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤，是由胚胎时期退化不完全... 展开随着组学技术的发展，复杂疾病的致病机制研究进入了大数据时代。基于转录组测序、DNA甲基化测序、CRISPR/Cas9基因编辑、染色质构象捕获等技术对脊索瘤及2型糖尿病的疾病分子机制进行了解析。脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤，是由胚胎时期退化不完全的脊索组织恶性癌变而来，但其致病机制尚不明确。由于对传统的放疗、化疗手段都不敏感，缺乏靶向治疗药物，目前脊索瘤的主要治疗手段是手术切除。但脊索瘤多发生于颅底和脊柱等重要组织器官附近，手术风险极高。因此，解析脊索瘤的致病机制，寻找有效的分子治疗靶点是脊索瘤研究中迄待解决的重要问题。本研究以胎儿脊索组织为癌旁对照，从转录组和miRNA组水平上对脊索瘤的致病机制进行解析。发现与胎儿脊索相比，TGF-β信号通路在脊索瘤中显著被抑制，该通路的上游基因TGFB3在脊索瘤样本中普遍低表达。在TargetScan软件预测的靶向调控TGFB3的microRNA中，miR-29家族的三个成员miR-29a，miR-29b和miR-29c在脊索瘤样本中都显著上调。通过双荧光素酶报告实验，在脊索瘤细胞系UM-Chor1中验证了miR-29b对TGFB3的直接调控作用，揭示了TGFB3在脊索瘤样本中下调的机制。另一方面，对TGF-β3在脊索瘤发生发展中的作用做了进一步探索。发现外源的TGF-β3能够抑制脊索瘤细胞UM-Chor1的增殖，并通过上调表达CDKN2B基因将细胞周期阻滞在G1/G0期。TGF-β3还能够抑制脊索瘤细胞的侵袭和转移，这与以往报道的TGF-β促进肿瘤细胞侵袭转移的功能不同。这是由于在A549等肿瘤细胞中，外源的TGF-β会上调miR-182的表达，进而抑制TGF-β信号通路的负反馈调控因子Smad7;而在脊索瘤细胞中，外源的TGF-β3能抑制miR-182的表达，从而激活Smad7蛋白，抑制细胞的侵袭和转移。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼胚胎中敲除了tgfb3基因，发现脊索细胞增生异常，并向周围组织浸润。Brachyury蛋白的高表达与维持脊索瘤的细胞活性和肿瘤干细胞特性密切相关，是目前脊索瘤治疗的主要研究靶点。我们的研究结果表明，外源的TGF-β3能够显著抑制脊索瘤细胞中Brachyury的表达。综上所述，认为TGF-β3在脊索瘤中扮演着抑癌基因的角色，是一个非常有前景的临床治疗靶标。此外，基于450K甲基化分型数据，对脊索瘤的发病机制及其亚分类进行了初步探索。发现与胎儿脊索相比，脊索瘤中差异甲基化基因也显著富集在TGF-β信号通路。基于分子水平的亚分类对于肿瘤的临床治疗和预后都有重要的指导意义，但脊索瘤在这方面的研究尚属空白。结合临床影像学和细胞病理资料，将经典型脊索瘤分为两个亚类，它们之间的差异甲基化基因主要富集在血管生成相关的通路上。 2型糖尿病是一种遗传和环境共同作用导致的复杂疾病。目前，全基因组关联性研究(GWAS)已鉴定出200多个与2型糖尿病相关的风险位点，但这些位点多位于基因组的非编码区，缺乏功能注释。发现9号染色体上有一段10Kb的连锁不平衡区，包涵5个2型糖尿病相关的风险位点。组蛋白修饰及物种间的保守性提示在这段非编码区域上可能存在2型糖尿病相关的增强子调控元件。通过双荧光素酶报告实验，鉴定出了一段120bp的核心增强子区域，并发现该增强子的活性与其在质粒上的插入方向有关。通过环状染色质构象捕获(4C)技术、CRISPRR/Cas9基因编辑技术和转录组测序，找到了该增强子所调控的基因集。该基因集的通路富集结果提示该增强子参与葡萄糖代谢及细胞周期调控等生命过程。我们的研究对非编码区的疾病风险相关位点进行了解析，并为2型糖尿病致病机制的研究提供了线索。收起

关键词 : 脊索瘤 2型糖尿病遗传机制分子机制

9. 正选择信号确定在乙肝病毒进化和高原低氧适应研究中的应用

[学位论文] 许喆中国科学院大学 2013年博士导师: 曾长青共119页

摘要 : 正选择是指在群体进化的历程中，具有选择优势的遗传多态通过自然选择的作用被保留并且在群体中持续积累的过程。使用正选择信号检测的方法研究群体的遗传多态，能找到群体基因组上受到正选择的基因和功能区段，有助于理解群体的适应机制，分析选择压... 展开正选择是指在群体进化的历程中，具有选择优势的遗传多态通过自然选择的作用被保留并且在群体中持续积累的过程。使用正选择信号检测的方法研究群体的遗传多态，能找到群体基因组上受到正选择的基因和功能区段，有助于理解群体的适应机制，分析选择压力来源，了解群体进化历史。为了研究不同种生物之间适应性进化机制的特点，确定进化过程中可能起重要作用的遗传多态和基因，本研究选用了不同的正选择信号检测方法，以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和高原世居人群为研究对象，分别扫描其基因组，进行正选择信号定位。 HBV是人类健康的威胁之一，感染HBV的患者往往容易罹患各种肝炎病症，如慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化等。为了研究HBV适应性进化与肝炎患者病程以及病毒基因型之间的关系，共收集486条具有患者诊断信息的B型和C型全长HBV基因组。按照相应宿主的诊断信息将这些病毒基因组划分为急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎组。采用基于密码子的最大似然法，对HBV的所有基因进行正选择信号分析，在HBV基因组上总共发现95个氨基酸位点受到正选择。在慢性肝炎组和重型肝炎组中受正选择的氨基酸位点数显著多于急性肝炎组中受到正选择的氨基酸位点数。一些氨基酸位点只在特定的肝炎病程组或HBV基因型中受到正选择。对HBV蛋白产物HBcAg的进化保守性分析显示，受到正选择的氨基酸大多分布在病毒蛋白的高变区。此外，对各病程组的HBV基因组进行基于核苷酸等位基因频率的分析，发现B型和C型HBV中共有8个核苷酸位点的等位基因频率在不同病程组中有显著差异，且这8个核苷酸位点的突变频率随着病程的加重而升高，而另有3个核苷酸突变，A1762T、G1764A和A2739C，在HBV的进化历程中趋向固定。将HBV基因组上所有受到正选择的氨基酸和核苷酸突变对回病毒蛋白或基因组上的功能区段，发现60％左右的受到正选择的突变，其选择压的来源是宿主的免疫监视、抗病毒治疗，以及病毒的复制效率。为了研究世界不同高海拔地区的世居人群在低氧适应机制方面的异同，选用多种正选择信号检测方法，扫描藏族人和安第斯高海拔世居人群的基因组。对藏族人的全基因组等位基因频率分化检测发现，汉族和藏族人在EPAS1基因上的等位基因频率差异最为显著。而后的数量性状关联分析发现并验证了EPAS1基因遗传多态和藏族人血红蛋白水平显著相关。此外还发现ACE基因的遗传多态和藏族人群血管紧张素转换酶水平具有显著相关性，NOS2A基因的遗传多态和藏族人群心脏收缩压水平显著关联。随后对藏族和安第斯人群采用基于等位基因频率、单体型的方法检测其基因组上的正选择信号，发现在这两个人群中，有些受到正选择的SNP位点位于基因组的调控元件区段。通过寻找受选择的SNP位点周围的蛋白编码基因，发现低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)通路的基因，如EPAS1、EGLN1、ARNT、ARNT2、EP300经历了正选择。作为HIF通路的核心调控元件，EPAS1和EGLN1在藏族人中受到选择。ARNT2、EP300作为HIF通路的重要参与者，在安第斯高海拔世居人群中也经历了正选择。凝血通路基因F2和呼吸反应相关的基因OPRM1在藏族人和安第斯人中也都受到选择。上述结果提示在世界不同地区的高原人群中，涉及到低氧适应机制的通路和相关基因具有一定程度的一致性，但是由于起作用的关键基因在不同人群之间存在差异，所以他们的具体的适应机制有所不同。收起

关键词 : 正选择信号确定适应性进化乙型肝炎病毒低氧适应 ACE基因遗传多态

10. 肝病患者外周血游离DNA和藏族胎盘甲基化组的研究

[学位论文] 张海坤中国科学院大学 2020年博士导师: 曾长青共118页

摘要 : DNA甲基化在肿瘤的发生发展和胚胎发育过程中发挥重要作用。随着测序技术的快速发展，DNA甲基化在肿瘤早期检测和群体适应性研究方面得到了广泛的应用。基于全基因组甲基化测序技术对肝病患者血液游离DNA及高原世居藏族胎盘的全基因组甲基化图谱进行分... 展开 DNA甲基化在肿瘤的发生发展和胚胎发育过程中发挥重要作用。随着测序技术的快速发展，DNA甲基化在肿瘤早期检测和群体适应性研究方面得到了广泛的应用。基于全基因组甲基化测序技术对肝病患者血液游离DNA及高原世居藏族胎盘的全基因组甲基化图谱进行分析阐述。循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的甲基化分析已被证明是非侵入性癌症诊断的有效方法，然而全基因组甲基化测序(Whole genome bisulfite sequencing，WGBS)的高成本严重阻碍了cfDNA甲基化标志物在肿瘤早期筛查中的临床应用。通过对慢性肝炎患者、肝硬化患者和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的cfDNA进行全基因组甲基化测序分析，发现测定的cfDNA片段多来自于人基因组的基因间区和重复区域，特别是已报道的HBV整合区域，表明细胞释放的cfDNA存在区域偏好性。在肿瘤细胞DNA中，这些HBV整合位点附近区域，无论是否出现病毒整合，均维持在低甲基化水平，非常好的代表了HCC基因组整体低甲基化的状态，可以作为HCC筛查的标志特征。基于此，通过低重数WGBS(测序读长数目约为5million)提取分析cfDNA中HBV整合位点附近长区域的甲基化水平，作为HCC早期筛查的新的标志物。首先对肝炎患者、肝硬化患者、早期HCC患者、晚期HCC患者和术后HCC患者的cfDNA进行低重数WGBS，成功检测出HCC患者cfDNA在HBV整合位点附近区域呈现低甲基化状态。为了提高对早期HCC患者的检测性能，用基于随机森林的特征选择方法筛选早期HCC患者特异的甲基化区域。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)分析表明HBV整合位点上下游5Kb区域的甲基化水平和特异的甲基化区域对早期HCC患者表现出较高的区分能力，并在一个独立的数据集中得到了验证。我们的结果表明HBV整合位点附近的低甲基化可以提升cfDNA低重数WGBS数据对早期HCC患者的检测性能，同时该分析策略也可应用于监测其他由具有整合活性病毒导致的肿瘤。高海拔人群的遗传适应为其提供了高海拔地区的生存优势。迄今为止，关于高海拔人群适应的表观遗传研究仍旧有限。在本课题中，进行了DNA甲基化与高原世居藏族人群高海拔适应的研究。胎盘是人体易获取的组织之一，并且在生殖生育方面具有重要调节作用。因此以胎盘为研究对象，通过对高原世居藏族、高原移居汉族和平原世居汉族的胎盘进行全基因组甲基化测序得到了全基因组甲基化单碱基图谱。相比于高原世居藏族和平原世居汉族两个人群各自内部个体间甲基化谱的一致稳定性，高原移居汉族个体间胎盘DNA甲基化模式差别较大，表明不同个体对高原低氧环境的习服能力存在较大差异。与平原世居汉族相比，高原世居藏族胎盘表现出全局低甲基化的特征。藏族胎盘低甲基化差异区域相关基因(BCL6、KLF5、TFAP2A、EGR2、JUN、JOS和ETV5等)显著的富集在细胞低氧反应生物过程中，表明藏族的低甲基化与高原低氧适应相关。通过对不同人群胎盘转录组数据的分析，发现与平原世居汉族相比，在藏族胎盘中DNMT1表达显著下降，这提示藏族胎盘中DNMT1的下调是导致DNA甲基化的降低的原因之一。结合转录因子ChIP-seq公共数据和不同人群胎盘转录组数据，筛选出潜在的引起藏族胎盘DNMT1表达下降的转录因子，如AP-1等。我们的研究揭示了DNA甲基化修饰在藏族高原低氧适应中的作用，为进一步探索高原人群的低氧适应机制提供参考。收起

关键词 : 循环游离DNA 高原世居藏族胎盘组织全基因组甲基化图谱