中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. 共载双氢青蒿素和PI3K抑制剂的抗疟逐级靶向纳米递药系统的构建与评价

[学位论文] 王蓉蓉山西医科大学 2023年博士导师: 张淑秋共234页

摘要 : 目的：疟疾是由感染疟原虫的按蚊叮咬或者输入含有疟原虫的血液而导致的一种严重虫媒传染病。在治疗疟疾方面青蒿素类药物有独特的优势，是全球治疗疟疾的一线药物。但近年来青蒿素耐药性疟疾传播的地理范围日益扩大，耐药地区青蒿素类药物治疗... 展开目的：疟疾是由感染疟原虫的按蚊叮咬或者输入含有疟原虫的血液而导致的一种严重虫媒传染病。在治疗疟疾方面青蒿素类药物有独特的优势，是全球治疗疟疾的一线药物。但近年来青蒿素耐药性疟疾传播的地理范围日益扩大，耐药地区青蒿素类药物治疗失败率高达50％。在没有其他替代药物的情况下，青蒿素耐药威胁着全世界为消除疟疾做出的所有努力。基于以上背景，为了实现：①特异性抑制PI3K激酶，减少PI3P的生成，恢复疟原虫对ARTs的敏感性、保障ARTs活化起效;②利用感染红细胞膜和疟原虫膜上特有的代谢转运通道，将两种药物逐级靶向至疟原虫，增加两种药物在疟原虫内的富集，进一步增强ARTs效力。本研究首先通过计算机辅助设计和疟鼠体内的药效学评价，筛选出与PI3K蛋白亲和力高且具有较好抗疟效果的疟原虫PI3K抑制剂。利用药效学和相关脂质变化验证双氢青蒿素（DHA）联合PI3K抑制剂（idelalisib）协同逆转耐药的效果并对耐药相关机制进行初步评价。其次基于葡萄糖转运体、疟原虫还原微环境和疟原虫大分子转运通道，分别制备有无葡萄糖基、有无GSH响应（还原响应，二硫键）及不同粒径（～35 nm和～121nm）修饰的纳米微粒，初步评价这几种转运体（通道）对微粒靶向性和抗疟药效的影响。最后在前述研究的基础上，设计共载DHA和idelalisib的葡萄糖基修饰小粒径还原响应微粒（DHA+idelalisib共载逐级靶向递药微粒），期待微粒可通过大分子转运通道等选择性进入感染红细胞、再经疟原虫膜己糖转运体主动转运进入疟原虫、而后在疟原虫内实现还原响应释药、最后两药协同活化起效，为阐释ARTs耐药机制及治疗耐药性疟疾提供依据和新策略。方法： 1、疟原虫PI3K抑制剂的筛选及其与双氢青蒿素协同作用的评价为了找到对疟原虫PI3K有较强效果的抑制剂，本研究首先以恶性疟原虫PI3K同源模建得到的蛋白结构为基础，选择27种有人类三型PI3K抑制作用的化合物进行分子对接，以对接得分、结合能大小等为考察指标，初步筛选疟原虫PI3K抑制剂候选化合物。在此基础上，使用DHA和候选抑制剂的混合溶液对约氏BY265疟鼠进行治疗，以感染率、抑制率和治愈率等为考察指标，筛选药效最好的疟原虫PI3K抑制剂。为评价DHA和PI3K抑制剂的协同增敏和逆转耐药效果，将DHA和PI3K抑制剂（idelalisib）以不同比例混合后作用于BY265疟鼠、伯氏K173青蒿素敏感和K173青蒿素抗性疟鼠，对两药联用前后的抑制率、协同指数（CI)、半数抑制浓度（ED50）和耐药指数变化等进行考察。 2、DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响为探究PI3K耐药和DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响，以K173敏感疟鼠为对照，将生理盐水（Control）、DHA溶液、idelalisib溶液和DHA+idelalisib混合溶液注射至K173抗性疟鼠体内，连续给药4天，最后1次给药后提取疟原虫，对疟原虫脂质成分进行测定。分析 Control vs idelalisib、Control vs DHA、Control vs DHA+idelalisib、idelalisib vs DHA+idelalisib、DHA vs DHA+idelalisib 组的耐药相关脂质代谢差异，对PI3P含量、差异倍数大的脂质种类、及鞘脂和固醇的变化量进行不同差异分组间的比较，初步阐释两药联用逆转耐药的机制。结果： 1、疟原虫PI3K抑制剂的筛选及其与双氢青蒿素协同作用 (1)选择idelalisib作为疟原虫PI3K抑制剂以恶性疟原虫PI3K同源模建蛋白中的小分子配体为基础或SYBYL-X2.0软件自动识别构建两种对接口袋，与27种有PI3K抑制作用的化合物对接后使用分子动力学模拟验证对接结果，筛选出对接得分最高的5种候选抑制剂(copanlisib、idelalisib、taselisib、umbralisib、AZD6482)。将 5 种候选抑制剂与 DHA 等摩尔量混合后注射至约氏BY265疟鼠体内，停药1天小鼠尾尖取血涂片，DHA+idelalisib组(0.60±0.56)％和 DHA+taselisib 组(1.3±0.93)％的感染率相比 DHA 组(3.50±1.00)％显著降低;在接种32天内，DHA+idelalisib组转阴率最高，且仅DHA+idelalisib组有小鼠治愈，故选择idelalisib作为疟原虫PI3K抑制剂用于后续考察。 (2)DHA+idelalisib具有协同增敏、逆转耐药的作用将不同摩尔比的DHA和idelalisib混合溶液作用于BY265疟原虫感染的小鼠，停药一天，固定其中一种药物的浓度，感染率会随着另一种药物给药剂量的增加而减小，抑制率反之。不同剂量比的DHA+idelalisib组均表现出不同程度的协同抗疟效果，综合比较CI值和抑制率，idelalisib用量为60.2 μmol/kg/d时与DHA协同作用较佳，DHA+idelalisib 的剂量比(μmol/kg/d)为 1.1∶60.2、2.2∶60.2、4.4∶60.2、8.8∶60.2及17.6∶60.2时分别表现出强度、强度、高度、高度和中度的协同作用。在K173敏感疟鼠中，相比DHA溶液组，DHA+idelalisib联用后对疟原虫的抑制作用增强，两种药物联用达到中度和低度的协同增敏效果。在K173抗性疟鼠中，相比DHA溶液组，DHA+idelalisib联用表现出中、高度的协同作用，抑制率显著增加(P＜0.01)。且在K173抗性疟鼠中，DHA+idelalisib联用显著降低了 DHA的ED50,使得DHA抗性指数由13.82降低到2.75,降低了 5倍，达到较好的协同逆转耐药的作用。 2、DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响 (1)DHA+idelalisib联用影响敏感株PI3K相关脂质的表达在K173敏感疟原虫中，与疟鼠对照Control组相比，单用DHA未对疟原虫中的PI3P表达产生明显影响;DHA联合使用idelalisib后，DHA+idelalisib组相比DHA组的PI3P表达明显下调(P=0.004,VIP=1.90)。以P＜0.05,VIP＞1为条件，筛选两组间的差异脂质。Control组和idelalisib溶液组相比，在差异倍数最大的10种上调或下调的脂质中，维生素D类脂质(LMST03020457)上调。这类脂质可通过抑制PI3K-AKT通路介导细胞凋亡，对疟原虫的生长有抑制作用。Control组和DHA溶液组差异倍数最大的10种上调或下调的差异脂质中除发现与idelalisib组相同的维生素D类脂质外还发现有细胞凋亡诱导作用的鞘脂Cer(d16∶1/17∶0)上调。Control组和DHA+idelalisib混合溶液组差异倍数最大的10种上调或下调的差异脂质中有7种和DHA组相同，除和单用DHA或单用idelalisib上调相同的维生素D类脂质及和DHA单用相同上调的Cer(d16∶1/17∶0)细胞凋亡诱导剂外，另1种维生素D类物质(LMST03020502)也被上调。 (2)DHA+idelalisib联用影响抗性株PI3K相关脂质的表达结论： 1、选择的PI3K抑制剂idelalisb在体外分子对接和体内抗疟药效学评价中都具有较好的表现。将DHA+idelalisb注射至敏感和耐药疟原虫感染的小鼠体内，显示出一致的协同作用;且在抗性疟鼠中，idelalisb将DHA的抗性指数从13.82降低至2.75,表明idelalisb一定程度上恢复了 DHA对抗性疟原虫的敏感性。通过分析两种药物治疗前后脂质表达的变化，与DHA组相比，DHA+idelalisb组的PI3P表达显著下调，充分验证了 idelalisb可以抑制疟原虫PI3K,减少PI3P的产生，增强或恢复DHA的抗疟敏感性。在抗性虫株中，idelalisb与DHA联用对疟原虫中囊泡相关脂质的表达也产生了明显的影响(在耐药疟原虫中囊泡过表达)，间接说明idelalisib具有恢复ARTs敏感性的作用。此外，维生素D类物质在idelalisb治疗后显著上调，推断idelalisb还可以通过抑制PI3K-AKT途径介导疟原虫凋亡。这些发现为阐明青蒿素耐药性机制和治疗耐药性疟疾提供了依据和新思路。 2、基于糖转运体、疟原虫还原微环境和大分子转运通道，分别设计了葡萄糖基靶向、还原响应和小粒径微粒;糖转运体或大分子转运通道的响应修饰均使得微粒具有了较好的靶向作用;还原响应二硫键的修饰对增加DHA导致的过氧化损伤产生了一定的辅助作用。将小粒径靶向、葡萄糖靶向和还原响应结合起来后，靶向至疟原虫感染红细胞的微粒含量进一步提高。在证实DHA+idelalisib对敏感和抗疟疟原虫有强效抑制作用的基础上，将DHA+idelalisib共载在葡萄糖靶向的小粒径还原响应微粒中，增加了两种药物在敏感和抗性疟原虫中的有效含量，达到了更好的抗疟疗效。为抗疟药递送系统的设计提供了新策略。收起

关键词 : 纳米递药系统双氢青蒿素 PI3K抑制剂抗疟疾疗效

2. 基于VKORC1基因多态性的华法林剂量预测模型构建及其药物抵抗机制研究

[学位论文] 高伟祺药学院 2022年博士导师: 张淑秋共155页

摘要 : 目的：华法林(Warfarin)是最具代表性的香豆素类抗凝药物之一，因其具有充足的循证医学证据、确切的疗效以及低廉的价格，被广泛应用于临床抗凝治疗中。然而，华法林治疗的药理学难点在于其狭窄的安全剂量范围以及显著的个体间剂量差异，将维生... 展开目的：华法林(Warfarin)是最具代表性的香豆素类抗凝药物之一，因其具有充足的循证医学证据、确切的疗效以及低廉的价格，被广泛应用于临床抗凝治疗中。然而，华法林治疗的药理学难点在于其狭窄的安全剂量范围以及显著的个体间剂量差异，将维生素K环氧化物还原酶复合物1(VitaminKepoxidereductasecomplex1,VKORC1)基因、细胞色素P4502C9(CytochromeP450,family2,subfamilyC,polypeptide9,CYP2C9)基因多态性与临床因素相结合来构建精准化剂量预测模型是华法林个体化治疗领域的研究热点。VKORC1作为华法林的作用靶点包含163个氨基酸，由VKORC1基因编码，是维持机体维生素K循环及凝血因子活化的限速酶。华法林作为维生素K类似物通过竞争性与VKORC1结合来抑制凝血因子的活化以达到抗凝血的目的。CYP2C9是一种重要的药物代谢酶，临床上使用的华法林是消旋体混合物。其中，S-华法林是主要有效成分，其抗凝活性是R-华法林的3～5倍，主要经CYP2C9催化代谢。因此，VKORC1基因多态性影响的是华法林与作用靶点的结合情况，而CYP2C9基因多态性影响的是华法林的代谢速率，这两种基因也被认为是最重要的可显著影响华法林用药剂量的遗传因素。与此同时，在结合患者年龄、性别、体重等非遗传因素后，研究人员建立了很多基于药物基因组学的华法林剂量预测模型。然而这些模型在对不同种族人群进行华法林剂量预测时，其预测准确性会发生较大的变化，究其原因是因为不同种族间基因异质性的存在导致了种族特异性模型外推至其他种族时出现了模型预测准确性降低的问题，因此针对特定人群开发本土化的剂量预测模型是十分必要的。除此之外，VKORC1基因型对华法林剂量的影响远高于其它因素，华法林与靶蛋白VKORC1相互作用的复杂性表现在VKORC1基因发生某些单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)突变后会导致患者产生部分或完全的华法林药物抵抗，这些患者的混杂存在严重影响了基于回归分析的华法林剂量预测模型的预测准确性。然而，这些与VKORC1基因SNP突变相关的华法林药物抵抗问题仅在个别的病例报告或较短的临床观察研究中有所报道，其具体的作用机制仍有待进一步阐明。因此，为了针对山西地区患者构建华法林精准化用药模型，同时探索VKORC1基因SNP突变与华法林药物抵抗的关系，本研究首先利用山西地区华法林用药患者的临床数据(n=217)对六种国内外主要华法林剂量预测模型进行预测准确性评价，考察各因素对华法林剂量的影响权重，为寻找和建立更加适合山西地区患者的华法林剂量预测模型提供理论依据；其次，为了进一步提高自建模型的预测准确性，寻找更为贴合的建模平衡点以便优化模型，本研究针对因变量“华法林最佳剂量”(Warfarinoptimaldose,WOD)进行数据变换后再次进行单因素及多元线性回归分析，并使用验证集数据对各构建模型进行预测准确性验证；第三筛选山西地区患者(n=124)VKORC1基因外显子区可导致VKORC1氨基酸序列发生改变的SNP突变，随后通过分子对接技术(MolecularDocking,MD)模拟华法林与突变前后VKORC1结合情况的改变，寻找结合能降低的突变型；第四利用FIX(F9)-VKORC1基因共表达转染体系构建基于HEK293T细胞培养的可表征VKORC1与华法林结合情况的分析模型，以此来避免使用非生理性还原剂二硫-苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)驱动实验考查华法林对VKORC1活性的抑制。选择F9与VKORC1基因共同转染的原因一方面是由于F9因子的活化必须依赖于维生素K循环，而维生素K循环的限速酶是VKORC1，使用不同浓度华法林干预时其与VKORC1结合强弱会改变F9因子的活化速率，因此通过考察F9因子活性可间接表征华法林与VKORC1的结合情况；另一方面是HEK293T细胞中F9因子表达量中等偏低，通过构建过表达质粒可保证细胞中F9因子表达相对过量，能够更加准确的考察F9因子活化速率的变化情况；第五为了验证MD模拟结果的正确性，通过构建突变型F9-VKORC1基因共表达转染系统，利用已建立的可表征VKORC1与华法林结合情况的细胞分析模型，在细胞水平上考察VKORC1基因分别发生相应SNP突变后华法林与其表达的突变型VKORC1结合情况的改变，从而探索华法林药物抵抗与VKORC1基因外显子区SNP突变的关系，为阐明华法林药物抵抗的机制提供研究基础。方法： 1、六种主要华法林剂量预测模型对山西地区患者的预测性能评价以2017年1月-2019年12月期间在山西某大型综合三甲医院接受华法林抗凝治疗的患者作为研究对象，经排除标准筛选及知情同意后共有217名患者纳入研究。针对每位患者分别进行VKORC1(rs9923231)、CYP2C9*2(rs1799853)以及CYP2C9*3(rs1057910)基因分型检测。此外，同时收集患者年龄（岁）、性别、体重(kg)、身高(cm)、合并用药等其它15种非遗传因素资料。WOD定义为患者在住院期间或随访期间使INR保持在目标范围内的华法林用药剂量。六种主要华法林剂量预测模型的筛选原则如下：①模型是用来计算华法林维持剂量的，而不是估算初始剂量；②模型选择的最小可接受研究对象数量大于或等于120例；③纳入日本、韩国学者专为亚洲人口建立的模型。最终来自不同参考文献的六种主要华法林剂量预测模型被纳入本研究。其中两种模型(HUANG和MIAO)来源于中国，IWPC为国际公认的模型，OHNO和KIM分别为日本学者和韩国学者建立的模型，BRESS模型为针对非洲裔美国人建立的模型。分别使用六种华法林剂量预测模型对217名患者进行剂量估算，每位患者得到六个预测剂量(Predicteddose,PD)，使用配对样本t-检验(Pairedsamplet-test)和皮尔逊相关系数(Pearson''scorrelationcoefficient)来评估六组预测剂量PD与WOD之间的统计学差异并对各模型预测准确性进行排序；此外，根据预测值PD与WOD值计算的平均绝对误差(Meanabsoluteerror,MAE;=N1∑ni|PDo-W0Di)也用于评价六种模型的预测准确性；剂量分层分析中，根据日剂量将患者分为3个剂量组，即低剂量组(≤3mg/day)、中剂量组(3–5mg/day)和高剂量组(gt;5mg/day)，通过计算平均相对误差(Meanrelativeerror,MRE;MRE=1n∑ni=1|PDi-W0Di|W0Di)来评估每种模型对不同剂量组的预测准确性；最后采用单因素分析考察各临床因素对华法林剂量的影响，其中二分类变量采用独立样本t-检验(Independentsamplet-test)进行变量间统计学差异分析，多分类变量则采用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验变量间的统计学差异。 2、基于VKORC1基因多态性的山西地区患者华法林剂量预测模型构建为了更加准确的拟合各影响因素对WOD的线性回归方程，提高模型的预测准确性，针对因变量WOD进行三种形式的数据转换。本研究以上述217名患者作为研究对象，将患者的WOD进行取对数(lgWOD)，倒数(1/WOD)以及开方(√W0D)数据变换，之后以WOD及其三种变换值作为因变量再次分别进行单因素分析，其中二分类变量采用独立样本t检验进行变量间统计学差异分析，多分类变量则采用单因素方差分析检验变量间的统计学差异。针对上述经单因素分析筛选出的Plt;0.05的影响因素进行多元线性回归分析，采用逐步回归法筛选变量(αin=0.10,αout=0.15)，最终得到4个回归方程，选择R2值较高的两个回归方程作为备选的山西地区患者华法林剂量预测模型。以2020年1月-2020年6月期间在山西某大型综合三甲医院接受华法林抗凝治疗患者(n=24)的临床数据组成验证集，分别使用上述两个备选的山西地区患者华法林剂量预测模型与已发表模型（第一部分筛选出的最优模型）来估算华法林PD值。每位患者将得到3个PD值，使用配对样本t检验和Pearson相关分析来评估三组预测剂量PD与WOD之间的统计学差异并对各模型预测准确性进行排序；此外，根据预测值PD与WOD值计算的MAE(MAE=1n∑ni=1|PDi-W0Di|)也用于评价上述三种模型的预测准确性；确定最优模型后，针对模型中的各影响因素进行权重分析，对比各因素对华法林剂量的影响程度。 3、山西地区患者VKORC1基因外显子区SNP筛查及VKORC1与R/S-华法林相互作用模拟研究采用高通量基因测序技术对124名服用华法林的患者进行VKORC1基因外显子区测序，筛选出可导致VKORC1氨基酸序列发生改变的有意义SNP突变。随后将突变前后的VKORC1氨基酸序列导入Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)数据库，构建VKORC1基因突变前后的蛋白模型。使用Desmond(Schr?dingerRelease2021-1)软件对突变前后蛋白模型进行20ns分子对接(MolecularDocking,MD)模拟。采用TIP3P显式溶剂模型，将蛋白模型放入溶剂盒子中，盒子边界距离蛋白边界至少10?。此外，体系中加入0.15nM的NaCl以模拟生理条件。体系的优化采用OPLS-3e力场进行能量最小化。选择1ps的记录时间间隔，从而得到具有2000个独特构象的MD轨迹。使用等温等压(NPT)系综时，温度固定在300K，压力为1.01bar。积分时间步长设置为2fs。使用PyRx-v0.8虚拟筛选工具与AutoDock-Vina相结合进行MD模拟研究。所有的分子都经过PyRx软件包中的openbabel进行能量最小化后转换成PDBQT格式。所有配体对接到活性口袋所在方形盒子中(center_x=-9.7,center_y=26.6,center_z=56.6,size_x=17.5,size_y=15.3,size_z=18.3)。对接盒子的选择允许配体在网格框中的指定值内自由移动。拉马克遗传算法(LamarckianGeneticAlgorithm,LGA)中配体的状态变量，包括初始位置、方向和扭转都是随机设置的。每个配体设置8次对接，结果根据均方根偏差(RMSD)标准进行聚类分析。通过以上MD模拟研究，进一步推测可导致华法林产生耐药抵抗的VKORC1基因SNP突变位点。 4、可表征靶蛋白VKORC1功能的HEK293T细胞分析模型构建以FIX(F9)活性作为华法林与VKORC1结合的表征，使用共表达人类F9和VKORC1基因的质粒载体对HEK293T细胞进行转染，使两种蛋白在细胞中过表达。转染后通过荧光显微镜、实时荧光定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,RT-qPCR)以及蛋白质免疫印迹(Westernblot,WB)来评估转染效果，考察F9与VKORC1mRNA、蛋白的过表达情况。随后，分别在使用空载质粒(F9-VKORC1zero,FVZ)和过表达质粒(F9-VKORC1,FV)转染24h的细胞培养液中添加维生素K(5μg/mL)以及不同浓度的华法林(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μΜ)进行干预，继续培养48h后检测细胞培养液中F9因子的相对活性（以未添加华法林的细胞培养孔中F9因子活性为分母）。考察F9因子相对活性与华法林干预浓度的浓度依赖性，评价基于HEK293T细胞培养的F9-VKORC1共表达质粒载体系统中使用F9因子的相对活性来表征华法林与VKORC1结合情况的科学性。 5、VKORC1基因外显子区SNP突变与华法林药物抵抗的机制收起

关键词 : 华法林 VKORC1 剂量预测模型 VKORC1基因多态性药物抵抗

3. 青蒿素类药物时间依赖性药动学及其代谢调控机制研究

[学位论文] 柴丽青山西医科大学 2021年博士导师: 张淑秋共152页

摘要 : 目的：青蒿素（ART）类药物为我国首创并被WHO推荐用于治疗恶性疟疾的一线药物，同时该类药物还具有抗肿瘤、抗炎等其他药理作用，有广阔的应用前景。前期研究显示，ART随着口服给药时间的延长，体内药物暴露量不断降低，呈现时间依赖性药动学特... 展开目的：青蒿素（ART）类药物为我国首创并被WHO推荐用于治疗恶性疟疾的一线药物，同时该类药物还具有抗肿瘤、抗炎等其他药理作用，有广阔的应用前景。前期研究显示，ART随着口服给药时间的延长，体内药物暴露量不断降低，呈现时间依赖性药动学特征，直接影响了药物的体内疗效。但目前对于该特征尚缺乏系统的研究，调控机制尚不明确。为了进一步明确青蒿素类药物时间依赖性药动学特征，及其背后的代谢调控机制，本研究以ART和该类衍生物的共有代谢物双氢青蒿素（DHA）为代表药物，以比格犬和大鼠为实验动物，通过比较单剂量与多剂量给药的药动学差异，明确该类药物在动物体内的时间依赖性药动学特征；通过比较灌胃给药与静注给药时间依赖性药动学特征的差异以及多剂量灌胃给药后肝肠首过效应的变化，探究系统消除、肝首过及肠首过效应对时间依赖性药动学的贡献；研究ART和DHA多剂量给药后肝脏和各肠段中相关细胞色素P450s（CYP450s）的代谢活性变化，以及相关CYP450s和核受体mRNA表达的变化；考察ART和DHA多剂量诱导后体内外代谢物及代谢途径的变化，综合阐释青蒿素类药物的时间依赖性药动学及代谢调控机制，为该类药物在抗疟及抗肿瘤等领域的合理使用、剂型设计以及药物相互作用等提供依据。方法： 1、青蒿素类药物动物体内时间依赖性药动学的比较研究以静注给药的体内消除代表系统代谢，以灌胃给药的体内消除代表系统代谢和首过效应的综合作用。采用双交叉实验设计，对比格犬采用灌胃与静注的给药方式，连续给予ART或DHA5天，在给药第1天和第5天分别进行药动学研究，以液相色谱质谱联用（HPLC-MS/MS）法进行测定，明确ART和DHA在比格犬体内的时间依赖性药动学特征以及多剂量给药后系统代谢与首过效应的变化。采用组间比较法，分别对大鼠采用灌胃与静注、单次与连续5次的方式给予ART或DHA后，以HPLC-MS/MS法研究体内药动学行为，明确ART和DHA在大鼠体内的时间依赖性药动学特征以及多剂量给药后系统消除与首过效应的变化。通过大鼠组间比较法，以多剂量灌胃ART进行诱导，明确灌胃给药预处理对青蒿素大鼠体内系统代谢的影响，综合判断青蒿素类药物时间依赖性药动学与系统代谢和首过效应的相关性。并通过比较比格犬和大鼠的体内药动学行为，探究青蒿素类药物药动学特征在啮齿类和非啮齿类动物间是否存在种属差异。 2、青蒿素类药物大鼠体内首过效应研究肝门静脉中药物浓度代表入肝血药浓度，下腔静脉中药物浓度代表出肝血药浓度，以入肝血药浓度和出肝血药浓度计算的肝提取率（ERh）变化代表肝首过效应的变化，以入肝血药浓度变化代表肠首过效应的变化。通过对大鼠单次给予不同剂量的ART和DHA后，研究入肝血药浓度、出肝血药浓度及ERh随剂量的变化；通过比较相同剂量ART和DHA的入肝血药浓度，分析ART和DHA的胃肠道吸收差异；通过研究大鼠单次灌胃与连续5天灌胃给予ART或DHA后入肝血药浓度及ERh的变化，以反映多剂量给药后肝脏及小肠的首过效应变化。 3、青蒿素类药物对大鼠体内相关CYP450s代谢活性及mRNA表达的影响将大鼠分为空白组、ART诱导组及DHA诱导组，经灌胃途径连续4天分别给予空白或对应药物后，提取肝、十二指肠、空肠、回肠及结肠微粒体，分别以ART和DHA作为自身探针进行体外孵育，通过代谢动力学变化反映代谢相关酶活性的变化。将大鼠分为空白组、ART诱导组、DHA诱导组及利福平（RIF）阳性对照组，经灌胃途径连续4天分别给予空白或对应药物后，分离肝、十二指肠、空肠、回肠及结肠组织，以Trizol法提取各组织中总RNA，采用荧光定量PCR法对mRNA进行相对定量，研究大鼠肝脏及各肠段中CYP3A1、CYP2B1、CYP2C6、孕烷X受体（PXR）、组成型雄烷受体（CAR）及多药耐药基因（MDR1）的mRNA表达变化。 4、青蒿素类药物体内外代谢物及代谢途径初步考察将大鼠分为空白组、ART诱导组及DHA诱导组，经灌胃途径连续4天分别给予空白或对应药物，间隔1天后，空白组给予ART或DHA，诱导组给予对应药物，采集给药前及给药后24h胆汁和粪便样本，连同大鼠体外微粒体孵育样本，用高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）进行检测，分析体内外样本中母药和代谢物质谱响应丰度的变化以及可能代谢途径的变化，初步探究ART和DHA诱导对自身体内外代谢的影响。结果： 1、青蒿素类药物动物体内时间依赖性药动学的比较研究（1）ART比格犬体内连续口服给药呈现显著时间依赖性药动学特征：经灌胃途径给药时，ART在比格犬体内的药动学曲线无明显波谷特征；第5天的整体暴露量较第1天有明显降低趋势，血药浓度呈现时间依赖性降低的特征。第5天的血药浓度接近或低于定量下限，导致有效数据不足，无法准确求算药动学参数及进行差异统计分析。ART经静注给药时，第1天与第5天的药动学参数无显著性差异。以上结果表明ART连续口服给药改变了比格犬体内的首过效应，而非系统代谢。（2）ART大鼠体内连续口服给药呈现显著时间依赖性药动学特征：经灌胃途径给药时，ART多剂量组在大鼠体内的整体暴露量较单剂量组有明显降低趋势，血药浓度呈现时间依赖性降低的特征。药动学参数显示，多剂量组的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞分别是单剂量组的15.5%，38.8%和39.8%，CL/F是单剂量组的3.0倍，差异有显著性（Plt;0.01）。ART经静注给药时，单剂量组与多剂量组的药动学参数无显著性差异。ART多剂量灌胃预处理没有改变静注给药体内的药动学特征。以上结果表明ART连续口服给药改变了大鼠体内的首过效应，而非系统代谢。（3）DHA比格犬体内未表现出时间依赖性药动学特征：无论经灌胃或静注给药，DHA在比格犬体内第5天的整体暴露量与第1天无明显差异，未表现出时间依赖性药动学特征，表明该特征不是青蒿素类药物的共有特征。（4）DHA大鼠体内未表现出时间依赖性药动学特征：无论经灌胃或静注给药，DHA多剂量组在大鼠体内的整体暴露量与单剂量组无明显差异，未表现出时间依赖性药动学特征，表明该特征不是青蒿素类药物的共有特征。（5）ART和DHA口服生物利用度：ART和DHA在大鼠及比格犬中的口服生物利用度均较低。单剂量ART在大鼠和比格犬中的口服生物利用度分别为5.08%和1.32%；单剂量DHA在大鼠和比格犬中的口服生物利用度分别为7.15%和4.97%。ART在大鼠体内的口服生物利用度较比格犬高，存在一定种属差异。 2、青蒿素类药物大鼠体内首过效应研究（1）不同剂量ART大鼠体内首过效应研究：在考察剂量范围内，ART的出肝血药浓度明显小于入肝血药浓度（Plt;0.01）。ART有较大的ERh，40、60、80和120mg/kg的ERh分别为0.89±0.03、0.91±0.04、0.89±0.03和0.90±0.03，未受给药剂量的影响。将入肝血药浓度和出肝血药浓度分别进行剂量矫正后，各剂量组间没有明显差异。以上结果表明ART为高肝提取率药物，且在考察剂量范围内无代谢饱和现象，ART口服生物利用度低是首过效应高导致的。（2）多剂量灌胃ART大鼠体内首过效应研究：在考察剂量范围内，ART多剂量组的入肝血药浓度明显小于单剂量组的入肝血药浓度（Plt;0.05），出肝血药浓度也明显小于单剂量组的出肝血药浓度（Plt;0.05）。多剂量组40、60、80和120mg/kg的ERh分别0.91±0.02、0.95±0.03、0.94±0.05和0.93±0.03，与单剂量组的ERh没有显著性差异（Pgt;0.05）。以上结果表明多剂量灌胃ART诱导了肠首过效应。（3）不同剂量DHA大鼠体内首过效应研究：在考察剂量范围内，DHA的出肝血药浓度明显小于入肝血药浓度（Plt;0.01）。DHA有较大的ERh，10、15、20和40mg/kg的ERh分别为0.87±0.04、0.87±0.04、0.92±0.04和0.88±0.04，在考察剂量范围内不受给药剂量的影响。将入肝血药浓度和出肝血药浓度分别进行剂量矫正后，各剂量组间没有明显差异。在40mg/kg的相同给药剂量下，DHA的入肝血药浓度显著大于ART的入肝血药浓度（Plt;0.05）。以上结果表明DHA为高肝提取率药物，且在考察剂量范围内无代谢饱和现象，DHA口服生物利用度低是首过效应高导致的；DHA的胃肠道吸收较ART好。（4）多剂量灌胃DHA大鼠体内首过效应研究：DHA单剂量组与多剂量组的入肝血药浓度、出肝血药浓度及ERh均无显著性差异（Pgt;0.05）。以上结果与DHA无时间依赖性药动学特征的结果相一致。（5）ART和DHA小肠与肝脏的利用度估测：估测的ART肝脏利用度约为10%，未随给药次数的增加而改变；估测的ART单剂量组小肠利用度为（50.56±20.04）%，而多剂量组的小肠利用度为（30.37±5.47）%，差异有显著性（Plt;0.05）。估测的DHA肝脏及小肠利用度分别约为10%和60%，单剂量组和多剂量组间无明显差异。 3、青蒿素类药物对大鼠体内相关CYP450s代谢活性及mRNA表达的影响（1）ART对相关CYP450s代谢活性的影响：ART体外微粒体孵育结果显示，在连续4天灌胃ART诱导的肝微粒体中，ART的代谢速率较空白组增大，且低浓度较高浓度改变明显；酶促代谢动力学参数显示，ART的Vmax约增加4倍，CLint约增加2倍，Km约降低2倍。在各肠段连续4天灌胃ART诱导的微粒体中，ART代谢速率较空白组均有增加趋势，其中以十二指肠最为显著。ART在肝微粒体中的代谢速率明显高于肠微粒体中的代谢速率。以上结果与体内时间依赖性药动学的结果相一致，表明ART多剂量灌胃给药，能够诱导与自身代谢相关的I相代谢酶。（2）DHA对相关CYP450s代谢活性的影响：DHA体外微粒体孵育结果显示，与空白组相比，在连续4天灌胃DHA诱导的肝及十二指肠微粒体中，DHA的Vmax、CLint以及Km均无显著性差异。DHA在空肠、回肠及结肠微粒体中均无明显代谢趋势。以上结果与DHA无时间依赖性药动学特征的结果相一致，表明DHA多剂量灌胃给药对自身代谢相关的I相代谢酶没有明显影响。（3）ART和DHA对相关CYP450smRNA表达的影响：ART和DHA对大鼠CYP3A1、CYP2B1、CYP2C6、PXR及MDR1的mRNA均有诱导作用。ART对CYP3A1mRNA的诱导作用较DHA明显，其中在十二指肠和回肠有显著性差异（Plt;0.05）。DHA对CYP2B1mRNA的诱导作用较ART明显，其中在肝脏有显著性差异（Plt;0.05）。ART和DHA对各部位PXRmRNA均有不同程度的诱导作用，且两者作用无显著性差异，而对CARmRNA均无明显影响。ART对肝脏、十二指肠、回肠及结肠中的CYP2C6mRNA均有诱导作用，而DHA仅对肝脏中的CYP2C6mRNA有影响。ART及DHA只对大鼠肠段中的MDR1mRNA有诱导作用。以上结果表明，ART与DHA可能是通过诱导体内的PXR，进而诱导了CYP3A1和CYP2B1mRNA的表达；联合用药时，应注意酶诱导作用引起的药物相互作用。 4、青蒿素类药物体内外代谢物及代谢途径初步考察（1）ART体内外代谢物及代谢途径分析：ART在体内外共发现25种代谢产物，主要经历脱氧、羟基化、加氢、葡萄糖醛酸化代谢途径。ART在体内经历广泛的代谢，胆汁和粪便中未发现ART母药。4天的ART诱导使体内外ART母药明显降低，羟基化产物有相对增加趋势，脱氧产物有相对降低趋势。（2）DHA体内外代谢物及代谢途径分析：DH 收起

关键词 : 青蒿素双氢青蒿素时间依赖性药动学首过效应酶诱导

4. 肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及抗疟作用评价

[学位论文] 强济红山西医科大学 2023年硕士导师: 张淑秋共115页

摘要 : 目的: 青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物，然而随着广泛使用，在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株，导致其药效下降。有研究发现，恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类... 展开目的: 青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物，然而随着广泛使用，在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株，导致其药效下降。有研究发现，恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类药物耐药直接相关。PfK13蛋白突变导致PfK13蛋白与疟原虫磷脂酰肌醇3-激酶(PfPI3K)结合力下降，PfPI3K泛素化降解减少，PfPI3K水平升高继而介导磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)过量。PfPI3K 与 PI3P抑制了血红蛋白向疟原虫的转运，使疟原虫环状体期发育停滞，对ARTs敏感性下降,另外，血红蛋白内吞减少使得亚铁血红素含量降低，ARTs活化受阻，导致其耐药性的出现，疗效下降。 PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源，尤其与Ⅲ型PI3K的结构更为相似，3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)作为一种广谱的PI3K抑制剂，可通过抑制P13K/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，下调PI3K的表达，鉴于PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源，利用3-MA的抑制作用有望逆转ARTs的耐药性。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)作为广泛使用的抗疟一线药物，同样受到耐药性困扰,为了解决恶性疟原虫对ARTs的耐药性，提高ARTs的抗疟疗效，拟将二者联合用药。首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并对其进行抗性诱导，而后将两者单独给药得到各自ED50并进行联合给药，得到其联合用药指数。二者呈现协同给药,后续拟设计DHA与3-MA前药，由于DHA羟基不易与3-MA氨基反应，但是DHA前药青蒿琥酯(artesunate,AS)有羧基，容易发生酰胺化反应，以AS为原料药，通过与3-MA酰胺化反应得到DHA-3-MA的前药 AS-3-MA(artesunate-3-Methyladenine,AS-3-MA)。恶性疟原虫在感染红细胞后，会在红细胞膜表面表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP-1), 肝素能够与之特异性结合，为提高后续制剂对恶性疟原虫感染红细胞的靶向性，我们在此利用肝素修饰纳米脂质体以提高其靶向性。首先制备了双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,AMLs)及肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(heparin-modified artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,HAMLs),并对HAMLs进行了处方优化。并考察了 HAMLs制剂学特性、抗吞噬、体外靶向性、长循环等，为其后续用于抗疟治疗提供了基础依据。方法: 1.DHA与3-MA协同给药评价首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并通过动物模型对其进行抗性诱导，在诱导到十代后检测抗性指数呈中度抗性。然后构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并将DHA与3-MA单独给药得到，各自的ED50值。依据得到的ED值，设置二者以等摩尔比方式给药及等ED50给药两种方式下的给药剂量，二者按照等摩尔比给药时的剂量为:(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg;按照等ED50给药时的剂量分别为:1/4ED50、1/2ED50、ED50、2ED50、4ED50。利用动物模型，根据给药剂量及停药后的抑制率得到二者协同作用指数(combination index,CI)。2.AS-3-MA的合成以AS与3-MA为原料药，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N''，N''-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)为缩合剂，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)为质子清除剂，通过酰胺化反应合成AS-3-MA。后采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)对其结构进行了鉴定。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性采用薄膜分散法制备AMLs,以粒径(Size)、多分散指数(PDI)为考察指标,进行单因素优化后进行了响应面优化，得到AMLs较优处方。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)对AMLs进行了表征，然后考察了 AMLs稀释稳定性、血清中物理稳定性、储存稳定性及体外释放。结果: 1.DHA与3-MA协同抗疟作用利用诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型，给与DHA与3-MA单独治疗，得到二者的 ED50值，分别为:(2.71±0.06)μmol/kg、(83.61±1.36)μmol/kg。按照等摩尔比方式给药，剂量由低到高(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg,DHA 与 3-MA 对疟鼠的抑制率分别为:35.6％、49.0％、70.0％、86.5％、94.0％,二者的协同作用指数分别为:0.68、0.87、0.85、0.86、0.74,呈现出较弱的协同作用;按照等ED50方式给药，剂量按照1/4ED50、1/2ED50、ED50、2 ED50、4 ED50由低到高，二者联合给药对疟鼠的抑制率分别为:47.1％、60.0％、74.0％、85.3％、94.8％,协同作用指数分别为:0.57、0.73、0.78、0.84、0.58表现出协同作用，为后续试验提供了基础。 2.AS-3-MA的合成傅里叶红外光谱图中，1720 cm-1的吸收峰表示羰基上的N-H基团的伸缩振动，2928 cm-1处的吸收峰表示酰胺键上的N-H基团的伸缩振动，而1253 cm-1处的吸收峰表示酰胺键上的C-N键的伸缩振动;HR-MS测量得到的精确质量数与理论值的相对误差在一个数量级内;核磁共振氢谱1H-NMR和碳谱13C-NMR的谱图结果与所期望的化合物结构一致。综合表明成功合成了 AS-3-MA。酰胺化反应合成AS-3-MA的产率较低，不足10％,合成工艺有待优化。 3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性成功建立了 AS-3-MA的HPLC方法，用于AS-3-MA含量测定及体外分析。在8.0～ 600 μg/mL的浓度范围内，AS-3-MA线性良好;其检测限为4 μg/mL,定量限为8 μg/mL;所建立的方法精密度与专属性及回收率均符合方法学要求。通过单因素优化及响应面优化法，得到脂质体的较优处方，在该处方下制备得到的 AMLsSize 为(75.95±0.78)nm,PDI 为 0.30±0.02,粒径分布较为均匀，Zeta电位为(-21.63±1.59)mV,其绝对值较高，所测得的AMLs包封率为(80±0.03)％,制备的纳米脂质体混悬液显淡蓝色乳光。红外图谱中，AMLs冻干粉末在1720 cm-1有羰基上N-H基团的伸缩振动峰，在2928 cm-1处有酰胺键上N-H的伸缩振动峰，另有mPEG-PLGA、大豆磷脂、胆固醇特征峰，无新的峰形出现，显示脂质体成功制备。在稀释稳定性考察中，将AMLs在室温下利用超纯水稀释数倍后，测定其Size与PDI的变化，发现未发生较大改变，表明其具有较好的稀释稳定性;在血清稳定性试验中，将AMLs与胎牛血清共孵育24 h,于不同时间点测定混悬液吸光度，发现其未发生显著变化，表明AMLs具有较好的血清稳定性;将AMLs在4℃在储存，于第1、3、5、7、9天测定其Size与PDI,发现其未发生显著变化，表明AMLs具有较好的储存稳定性;在体外释放试验中，发现与AS-3-MA溶液相比，AMLs在48 h有44.59％释放，而AS-3-MA溶液则释放了接近75％,表明AMLs有缓慢释药的特性。结论 1.DHA与3-MA协同作用评价利用构建的伯氏疟原虫K173抗性虫株疟鼠模型，在单独给药得到各自ED50基础上，设置剂量，采用两种方式给药，以停药第一天的感染率计算得到二者联合给药协同作用指数，发现CI均小于1,二者表现出协同作用。2.AS-3-MA的合成通过酰胺化反应合成AS-3-MA,并通过FT-IR、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR多种手段对结构进行确证，显示成功合成了该前药。 3.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及质量表征肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体呈球形，粒径均匀，无团聚现象，具有较好的稀释稳定性，与胎牛血清(37±0.5)℃孵育24h,吸光度未发生明显变化，表明其在血清中具有较好的物理稳定性;在4℃环境下9天的储存时间内，其粒径与PDI未发生显著变化，表明其具有较好的初步储存稳定性体外释放实验中，观察到缓释特性，体外溶血实验中未观察或者检测到溶血现象，符合试验要求。收起

关键词 : 双氢青蒿素 3-甲基腺嘌呤纳米脂质体制备工艺肝素修饰抗疟作用

5. 双氢青蒿素二聚体的合成、抗疟活性及体内代谢初步研究

[学位论文] 代华灵山西医科大学 2017年硕士导师: 张淑秋共114页

摘要 : 目的：合成双氢青蒿素二聚体（以下简称二聚体），确定其绝对构型；考察二聚体在体外各环境中的稳定性及主要降解产物；测定二聚体的平衡溶解度和表观油水分配系数；考察二聚体对恶性疟原虫3D7株的体外抗疟活性；建立约氏疟鼠模型，考察二聚体对... 展开目的：合成双氢青蒿素二聚体（以下简称二聚体），确定其绝对构型；考察二聚体在体外各环境中的稳定性及主要降解产物；测定二聚体的平衡溶解度和表观油水分配系数；考察二聚体对恶性疟原虫3D7株的体外抗疟活性；建立约氏疟鼠模型，考察二聚体对约氏鼠疟的体内抗疟活性；初步研究二聚体在大鼠体内的可能代谢产物及主要代谢途径。方法： 1.二聚体的合成及理化表征以双氢青蒿素(Dihydroartemisinin， DHA）为原料药，三氟化硼乙醚（BF3 Et3O）为催化剂，通过醚化反应合成二聚体。经高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定，采用面积归一化法计算其纯度。并以高分辨质谱（HR-MS）法、核磁共振氢谱（1H-NMR）法对其结构进行鉴定。在室温条件下用石油醚对其重结晶后，培养单晶体，采用单晶X射线衍射（SXRD）确定其绝对构型。建立LC-MS/MS法，考察二聚体在pH1.2～8.0缓冲液、血浆和培养基中（37℃孵育24 h）的稳定性；测定二聚体在pH4.0～8.0缓冲液中的平衡溶解度和在正辛醇-水/磷酸缓冲盐中的表观油水分配系数。此外，采用高效液相-高分辨质谱联用（HPLC-HRMS）法鉴定二聚体在pH1.2缓冲液中的降解产物。 2.二聚体的体外抗疟活性考察以恶性疟原虫3D7株为模型，经山梨醇同步化法同步疟原虫生长周期，以DHA为阳性对照组，采用SYBR GreenⅠ法测定不同浓度的二聚体对疟原虫增殖的抑制情况。并以 IC50（50%抑制浓度）和 IC95（95%抑制浓度）评价药物的体外抗疟活性。 3.二聚体的体内药效学研究以约氏疟鼠为模型，采用皮尔逊四天抑制法分别经灌胃、尾静脉注射途径给予不同剂量的二聚体，以DHA为阳性对照组。停药1 d后，取血、镜检，计算其感染率、抑制率、ED50（50%有效剂量）、ED90（90%有效剂量）和转阴率。停药1周后，再次取血、镜检，计算并比较各剂量组间感染率。停药一个月，比较各组间的复燃率、治愈率、死亡率、平均存活天数，并观察存活鼠的肝脾组织病理变化。 4.二聚体的大鼠体内代谢初步研究采用HPLC-HRMSn技术对二聚体和DHA的体内代谢进行初步研究。通过对比二聚体组与空白组、DHA对照组的大鼠体内代谢情况的异同，初步推断二聚体在体内的可能代谢产物和代谢途径，并与DHA的体内代谢进行比对。结果： 1.二聚体的合成及理化表征 HR-MS、1H-NMR图谱解析表明合成的二聚体结构正确无误，其收率约为75%，熔点为160.5℃～161℃，且其纯度大于98%。SXRD分析表明合成产物为非对称型二聚体，即为 a dimer ofα- andβ-DHA: bis(3,6,9-trimethyl-3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。二聚体 LC-MS/MS含量测定方法的精密度小于5.58%；准确度为98.54%～105.70%；基质效应和提取回收率均为96.21%～104.11%。二聚体在各环境中孵育24 h后，剩余浓度百分比分别为69.94%±3.37%（血浆）、85.54%±1.40%（培养基）、76.95%±0.61%（pH4.0）、76.86%±1.75%（pH6.8）、80.94%±0.65%（pH7.4）、85.75%±0.68%（pH8.0）。二聚体在pH1.2缓冲液中反应6 h，几乎完全降解，并鉴定到主要降解产物为α-DHA和β-DHA。二聚体的平衡溶解度分别为（54.02±3.36）μg/ml（纯化水）、（128.79±9.31）μg/ml（pH4.0）、（230.33±17.79）μg/ml（pH5.0）、（313.76±17.32）μg/ml（pH6.8）、（425.94±35.07）μg/ml（pH7.4）、（466.06±21.76）μg/ml（pH8.0），表观油水分配系数lgP分别为1.55±0.19（纯化水）、1.12±0.05（pH4.0）、1.41±0.28（pH5.0）、1.48±0.20（pH6.8）、1.36±0.02（pH7.4）、1.22±0.26（pH8.0）。 2.二聚体的体外抗疟活性给药组对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用随浓度的增加而增强，呈浓度依赖性。二聚体的IC50值（（0.51±0.12）nmol/L）明显小于DHA的IC50值（（1.81±0.70）nmol/L）（P<0.001），二聚体的IC95值为（4.72±1.86）nmol/L，也小于DHA的IC95值（（6.40±2.05）nmol/L）（P<0.05）。 3.二聚体的体内药效学灌胃给药，停药1 d后，测得的二聚体ED50值（（0.44±0.03）mg/kg/d）和ED90值（（1.95±0.10）mg/kg/d）均显著小于DHA的ED50值（（0.76±0.03） mg/kg/d）和ED90值（（4.15±0.32）mg/kg/d）（P<0.001）。尾静脉给药后，二聚体的ED50（（0.18±0.03）mg/kg/d）和ED90（（0.83±0.08）mg/kg/d）分别显著低于DHA的ED50（（0.32±0.03）mg/kg/d）和ED90（（1.87±0.11）mg/kg/d）（P<0.001）。两种途径给药后，给药组对约氏鼠疟的抑制作用均呈剂量依赖性。除正常空白（不感染）组外，其余各组小鼠的体重都呈降低趋势，但给药剂量越大，体重降低量越少。灌胃给药（7.80、15.6 mg/kg/d）后，二聚体组的转阴率（75%、100%）明显高于DHA组（37.5%、62.5%）（P<0.001）。尾静脉注射给药（3.0、6.0 mg/kg/d）后，二聚体组的转阴率（62.5%、100%）显著高于DHA组（37.5%、50%）（P<0.001）。停药一周，给予相同剂量的二聚体组小鼠的感染率显著低于DHA组（P<0.001）。停药一个月，灌胃二聚体（15.6 mg/kg/d）组小鼠的复燃率为50%，存活率为75%。尾静脉二聚体（3.0、6.0 mg/kg/d）组小鼠的复燃率分别为60%、25%，存活率分别为62.5%、100%。灌胃和尾静脉DHA组小鼠的复燃率均为100%，存活率为0。所有存活下来的小鼠体重均显著增加，且无明显肝脾病变现象。4.二聚体的大鼠体内代谢初步研究在灌胃DHA后的大鼠体内检测到18种可能代谢产物，包括11种Ⅰ相代谢产物和7种Ⅱ相代谢产物，Ⅰ相代谢物主要为DHA过氧桥断裂为单氧桥、羟基化和羰基化代谢产物，Ⅱ相代谢产物则为Ⅰ相代谢物的葡萄糖醛酸结合型代谢物。代谢产物主要出现在尿液和胆汁中。在给予二聚体后的大鼠体内检测到27种可能产物，其中包括DHA和11种DHA相关代谢产物，其余15种可能产物的代谢途径主要为过氧桥断裂为单氧桥、羟基化、羟基化脱水等，产物主要经粪便、尿液、胆汁排出。结论： 1、成功合成非对称型DHA二聚体，化学名称为a dimer ofα-andβ-DHA:bis(3,6,9-trimethyl-3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。该化合物在水中溶解度较小，在pH4.0～8.0范围内，二聚体较稳定，且其平衡溶解度和稳定性均随pH的增大而增加，表观油水分配系数呈先增大（pH4.0～6.8）后减小（pH6.8～8.0）的趋势。二聚体在培养基中稳定，但在血浆中易降解，在pH1.2的缓冲液中极其不稳定，迅速降解成α-DHA和β-DHA。 2、体外药效学研究结果显示，给药组对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用随浓度的增加而增强。二聚体的IC50和IC95值均明显低于DHA，可知二聚体的抗疟活性优于DHA。 3、疟鼠体内药效学研究结果显示，两种途径给药后，各给药组对约氏鼠疟的抑制作用随剂量的增加而增强。二聚体的抗疟活性明显好于DHA。停药一个月，二聚体的复燃率低于DHA，转阴率和治愈率均高于DHA。 4、大鼠体内代谢初步研究结果显示，DHA在大鼠体内检测到的代谢产物、代谢途径与文献报道相符。二聚体除代谢成DHA及11种其相关代谢产物外，部分代谢成15种其他的相关可能产物。代谢产物主要为过氧桥断裂为单氧桥、羰基化、羟基化、羟基化脱水产物和葡萄糖醛酸结合型代谢物，最终主要经粪便、尿液、胆汁排出。本课题为国家自然科学基金“基于代谢机制靶向红细胞内疟原虫的青蒿素类药物纳米递药系统研究（编号：81373364）”。收起

关键词 : 双氢青蒿素二聚体理化表征抗疟活性药效学体内代谢动物模型

6. 胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒的制备及其体内外药效与初步靶向性研究

[学位论文] 史光玉山西医科大学 2017年硕士导师: 张淑秋共103页

摘要 : 目的：感染疟原虫的红细胞会特异性表达生成新渗透性通道（NPPs），并在红细胞膜上过表达胆碱转运载体(ECCs）。基于此，本课题以胆碱-聚乙二醇衍生物（CD-PEG-SA）为修饰分子，构建粒径＜80 nm的胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒（CD-PEG-... 展开目的：感染疟原虫的红细胞会特异性表达生成新渗透性通道（NPPs），并在红细胞膜上过表达胆碱转运载体(ECCs）。基于此，本课题以胆碱-聚乙二醇衍生物（CD-PEG-SA）为修饰分子，构建粒径＜80 nm的胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒（CD-PEG-ARM-NLC），以期靶向红细胞膜上的NPP通道和ECC载体，达到长循环和靶向抗疟的作用。制备并表征CD-PEG-ARM-NLC；考察其对约氏疟原虫（PyBY265）、恶性疟原虫（Pf3D7）的体内外抗疟活性；并通过包载荧光探针香豆素-6研究CD-PEG-NLC对感染红细胞的靶向性。方法： 1. CD-PEG-ARM-NLC的处方工艺考察在前期工艺研究基础上，采用高压乳匀法制备CD-PEG-ARM-NLC，通过对CD-PEG-SA的加入方式、用量进行单因素考察，优化制备处方。 2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征对CD-PEG-ARM-NLC的形状、粒径、Zeta电位、包封率、载药量等理化性质进行表征，考察药物的体外释放特性，并进行体外溶血试验。 3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价通过明胶沉降法从常规培养的Pf3D7中分离得到有/无knob结构的Pf3D7，以ARM为阳性对照，采用常规培养的、有/无knob结构的Pf3D7，应用SYBR Green I法，考察不同浓度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对疟原虫增殖的抑制作用，以药物的半数抑制浓度（IC50）为指标考察其体外抗疟活性。 4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察以香豆素-6（C6）为荧光探针，C6溶液为阳性对照，高压乳匀法制备C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。将荧光纳米粒分别与体外培养的Pf3D7感染的红细胞、在体PyBY265感染的疟鼠红细胞孵育，荧光显微镜下观察荧光分布和强度。通过NPP通道和ECC载体抑制试验，比较不同纳米粒组的荧光亮度，分析NPP通道和ECC载体对纳米粒进入感染红细胞的影响。 5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究采用约氏疟原虫BY265感染小鼠模型，以溶剂组、三种空白纳米粒组，不治疗（空白）组为阴性对照，以ARM组为阳性对照，通过四天抑制试验和28天治愈试验考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三种纳米粒的抗疟活性。结果： 1. CD-PEG-ARM-NLC考察后处方 CD-PEG-SA的加入方式为外加乙醇法，加入量为m胆碱/m混脂=19.24%（g/g）。考察后的处方组成为：GMS1.9286 g，MCT1.0714 g，RH401.2 g，ARM0.768 g， CD-PEG-SA0.5772 g，去离子水100 ml。 2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征 CD-PEG-ARM-NLC是均一、略带蓝色乳光的半透明液体制剂，透射电镜结果显示纳米粒呈类球形，粒径分布均匀；测定平均粒径为65.10±0.64 nm，多分散系数为0.186±0.004；Zeta电位为-24.47±1.01 mV；包封率为87.03%±0.71%；载药量为11.62%±0.10%；在pH7.4的磷酸盐缓冲液中72 h内体外累积释放率为81.95%±0.85%，释药规律符合Weibull方程，t50为10.36 h；体外溶血试验无红细胞聚集及溶血现象。 3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价 SYBR Green I法测得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对常规培养的Pf3D7的IC50值分别为4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05 nmol/L；对有knob结构的Pf3D7的IC50值分别为4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L；对无knob结构的Pf3D7的 IC50值分别为4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。 4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察荧光显微镜观察结果显示，纳米粒基本不进入正常红细胞，但可进入感染红细胞，且能聚集于疟原虫周围，而不是弥散于整个红细胞；CD-PEG-C6-NLC组的荧光强度高于C6-NLC组和PEG-C6-NLC组；以上结果显示CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用。加入NPP抑制剂（呋塞米）可基本阻断C6-NLC和PEG-C6-NLC进入感染红细胞，但CD-PEG-C6-NLC仍可进入感染红细胞；同时加入NPP抑制剂（呋塞米）和ECC天然底物（胆碱）方能基本阻断红细胞对CD-PEG-C6-NLC的摄取。 5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究阳性对照组ARM尾静脉注射的ED50值为0.266 mg/(kg·day)，ED90值为0.945 mg/(kg·day)，ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分别为0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day)，ED90值分别为0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day)，表明ARM制成纳米粒后抗疟活性有一定的提高。结论：采用优化后处方制备CD-PEG-ARM-NLC，其粒径、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放特性和溶血试验等指标均符合预期要求；体内外药效实验均说明CD-PEG-ARM-NLC比ARM、ARM-NLC和PEG-ARM-NLC有更好的抗疟活性；靶向试验初步结果表明CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用，更深入的验证有待后续实验。本课题为国家自然科学基金“基于代谢机制靶向红细胞内疟原虫的青蒿素类药物纳米递药系统研究（编号：81373364）”。收起

关键词 : 蒿甲醚脂质纳米粒胆碱-聚乙二醇双修饰药效学靶向性抗疟活性青蒿素类药物

7. 红细胞膜包覆双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸仿生纳米粒的制备及抗疟作用评价

[学位论文] 左恒通药学院 2022年硕士导师: 张淑秋共101页

摘要 : 目的：为了延长双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）在体内的作用时间，提高其抗疟疗效，并且基于疟原虫感染的宿主红细胞能与正常红细胞通过“玫瑰花环”效应产生亲和粘附作用，本文构建了抗疟药物双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（poly（... 展开目的：为了延长双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）在体内的作用时间，提高其抗疟疗效，并且基于疟原虫感染的宿主红细胞能与正常红细胞通过“玫瑰花环”效应产生亲和粘附作用，本文构建了抗疟药物双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（poly（lactic-co-glycolic）acid）-dihydroartemisininnanoconjugates，PDNs），进一步用红细胞膜包覆制备得到仿生纳米粒（redbloodcellmembranecloaked-PDNs，RPDNs），以期通过“玫瑰花环”效应，增加红细胞膜仿生纳米粒向感染红细胞的靶向药物递送，对仿生纳米粒的制备方法进行优化，通过考察仿生纳米粒的制剂学特性、体外抗吞噬、体外靶向性，体内抗疟药效、仿生纳米制剂的安全性以及血液长循环特征，为红细胞膜仿生纳米粒应用于抗疟药物给药系统构建，改善双氢青蒿素药物的不足，实现靶向药物递送，提高抗疟药物疗效提供基础与思路。方法： 1.双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的制备及质量表征采用纳米沉淀法制备双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（PDNs），通过单因素优化法和响应面优化法筛选得到PDNs纳米粒较优处方；通过高速离心法以及高效液相-柱后衍生化法测定并计算PDNs纳米粒的包封率（entrapmentefficiency,EE）与载药量（drug-loading，DL）；采用傅里叶红外光谱（IR）、差示扫描量热分析（DSC）等对PDNs进行质量表征；采用MaterialsStudio软件中DPD模块对PDNs形成过程进行分子动力学模拟。 2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及制剂学性质考察采用低渗法提取红细胞膜，通过超声法与共挤出法制备得到不同粒径的红细胞囊泡（redbloodcellvesicles，RVs）；通过将RVs与PDNs共挤出制备得到红细胞膜仿生纳米粒（RPDNs）；通过透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察PDNs与RPDNs的形态；对PDNs与RPDNs的粒径、PDI及Zeta电位进行表征；采用激光共聚焦对荧光标记的红细胞膜仿生纳米粒进行共定位分析；采用透析法考察PDNs与RPDNs的释放行为；考察两种纳米粒的血清稳定性与初步稳定性；采用SDS-PAGE蛋白电泳与WesternBlot实验检测RPDNs表面相关蛋白；考察两种纳米粒的体外溶血性。 3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体外抗吞噬及体外靶向性考察以香豆素-6（coumarin6，C6）为荧光探针，通过纳米沉淀法制备载C6的荧光纳米粒（PC6Ns）以及共挤出法制备载C6的红细胞膜仿生纳米粒（RPC6Ns）；对荧光纳米粒粒径、PDI、Zeta电位、包封率和载药量进行表征；采用透析法考察荧光纳米粒的释放行为；通过体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7对RPC6Ns的体外抗吞噬特性进行考察，高内涵细胞成像分析系统与激光共聚焦观察巨噬细胞对RPC6Ns的吞噬情况，流式细胞仪对吞噬情况进行定量考察；将RPC6Ns与PyBY265感染的疟原虫红细胞共孵育，激光共聚焦下观察荧光分布和强度，计算皮尔逊共定位系数，考察红细胞膜仿生纳米粒对疟原虫感染红细胞的亲和靶向作用。 4.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效、安全性及长循环评价构建约氏鼠疟模型，静脉注射五种剂量的PDNs和RPDNs纳米粒混悬液，采用皮尔逊四天抑制法进行给药。四天连续给药后，停药第1天，小鼠尾尖采血、涂片、染色、镜检，计算小鼠体内疟原虫的感染率、抑制率、50%有效剂量（ED50）、90%有效剂量（ED90）；停药第1周，再次采血、涂片、染色、镜检，计算小鼠体内疟原虫的感染率；观察14天，取血检测血常规指标、肝功能指标，采集心、肝、脾、肺、肾进行组织切片与病理分析，每天记录小鼠体重与生存只数；正常小鼠体内注射PDNs和RPDNs纳米粒，观察14天，取血检测血常规指标，考察纳米粒的安全性；以荧光染料DiD为探针，制备载DiD红细胞膜仿生纳米粒，正常小鼠尾静脉注射DiD标记的红细胞膜仿生纳米粒，于不同时间点取血，酶标仪测定荧光强度，考察红细胞膜仿生纳米粒的体内长循环特性。结果： 1.双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒制备及处方优化结果通过单因素优化法以及响应面法优化，得到较优处方，通过较优处方制备得到PDNs纳米粒其粒径分布均匀（71.23±0.78nm，PDI：0.05±0.01），并且有绝对值较高的Zeta电位（–21.63±1.59mV），EE为70.10±0.79%，DL为1.21±0.09%，纳米粒混悬液外观呈淡蓝色乳光。在红外光谱图中，PDNs冻干粉末在1750cm-1与3370cm-1处有最大吸收，分别为PLGA与DHA的特征峰，没有新的峰形出现，差示扫描量热分析结果中未见DHA结晶的特征熔融吸热峰；通过DPD粗粒化模拟，从微观角度了解到PDNs纳米粒形成的动态过程，双氢青蒿素药物通过氢键相互作用以及范德华力被包裹在PLGA聚合物材料的疏水性的内核中。 2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及制剂学性质考察采用低渗处理法得到红细胞膜，用超声法与共挤出法制备红细胞囊泡RVs，依次通过不同孔径大小的聚碳酸酯（PC）膜得到囊泡尺寸为85.62±2.39nm、Zeta电位约为-29mV的RVs。将RVs与PDNs共挤出制备得到红细胞膜仿生纳米粒RPDNs，测得粒径：86.40±2.54nm、PDI：0.179±0.011，其Zeta电位与制备得到的RVs的电位值较接近（-29.20±4.19mV），并且观察其外观呈粉红色乳状；透射电镜图能看到RPDNs呈明显的“核壳”结构，在荧光共定位图中观察到两种荧光重合，表明红细胞膜成功包覆在PDNs纳米粒表面。在30%无水乙醇-PBS释放介质中，RPDNs中DHA在24h的累积释放量为39.23%，PDNs为48.28%。两种纳米粒在胎牛血清以及4℃的水中稳定性良好。SDS-PAGE蛋白电泳表明红细胞膜仿生纳米粒中的大部分膜蛋白被保留，WesternBlot结果显示抗吞噬蛋白CD47被保留。体外溶血试验结果表明仿生纳米粒中没有红细胞聚集及溶血现象发生。 3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体外抗吞噬及体外靶向性考察高内涵细胞成像分析系统与激光共聚焦观察单核巨噬细胞RAW264.7对两种纳米粒的摄取结果显示，RPC6Ns相对于PC6Ns有效地降低了单核巨噬细胞对纳米粒的摄取。通过细胞成像分析系统中内吞模块定量分析结果显示，RPC6Ns平均颗粒数目远低于PC6Ns平均颗粒数目；流式细胞仪定量结果表明红细胞膜仿生纳米粒成功逃避巨噬细胞的吞噬。考察RPC6Ns对疟原虫感染红细胞的体外靶向性，激光共聚焦观察结果显示，RPC6Ns基本不进入正常红细胞，但可以进入疟原虫感染的红细胞，对感染红细胞具有亲和作用，计算皮尔逊共定位系数为0.7173，表明红细胞膜仿生纳米粒对疟原虫感染的红细胞存在靶向亲和作用，使纳米粒能够富集在感染红细胞周围。 4.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效、安全性及长循环评价停药第1天，测得PDNs与RPDNs组的ED50值分别为0.53±0.01μmol/kg，0.13±0.05μmol/kg与课题组前期所得到的DHA溶液组的ED50值（0.87±0.27μmol/kg）相比存在显著性差异（Plt;0.05）。停药第1周，所有组中疟原虫的感染率都有所上升，在8.8μmol/kg药物浓度下，RPDNs组的感染率均低于PDNs组，并且通过14天观察，RPDNs治疗的小鼠组生存良好，红细胞膜仿生纳米粒明显提高药物的抗疟活性。在PDNs和RPDNs给药组中，随着DHA的剂量的增加，疟原虫的感染率逐渐降低，存在剂量依赖性。通过对治疗小鼠与正常小鼠的血常规进行分析，PDNs与RPDNs组中血常规的各项指标都在正常阈值范围内。通过对小鼠组织器官进行Hamp;E病理分析，PDNs组与RPDNs组未发现病理损伤。对纳米粒进行体内长循环特性考察，红细胞膜仿生纳米粒RPDiDNs在正常小鼠体内半衰期为32.716±0.611h明显高于PDiDNs纳米粒（23.911±1.464h）（Plt;0.05），充分证明红细胞膜仿生纳米粒可以实现在体内的长循环作用。结论： 1.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及质量表征红细胞膜仿生纳米粒（RPDNs）呈明显的核壳结构，粒径均匀、有良好的EE和DL，红细胞膜蛋白被保留在纳米粒表面，在血清中与4℃水中比较稳定，具有缓释释药的特性，体外溶血性实验均符合预期要求。 2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒体外免疫逃逸及体外靶向性考察红细胞膜仿生纳米粒可以逃逸巨噬细胞的吞噬，避免药物被免疫系统清除，延长药物的作用时间；体外靶向性研究表明红细胞膜仿生纳米粒对感染疟原虫的红细胞有一定的亲和靶向作用，可以实现靶向递送药物。 3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效，安全性及长循环评价综合比较不同评价指标，RPDNs的抗疟活性强于PDNs以及DHA溶液组，仿生纳米粒表现出较好的抗疟活性以及安全性，并且能够在小鼠体内实现血液中长循环。收起

关键词 : 双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒 PLGA 靶向性药效学稳定性

8. 青蒿素注射用纳米结构脂质粒的制备及其初步药动学研究

[学位论文] 高伟祺山西医科大学 2013年硕士导师: 张淑秋共91页

摘要 : 青蒿素(artemisinin)是从植物青蒿中提取分离得到的具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，是新型抗疟药。在犬体内研究已发现连续多日口服给予青蒿素后其血药浓度未达稳态，相反与首次给药后的血药浓度相比却有显著降低，这种时间依赖性药动学现象被... 展开青蒿素(artemisinin)是从植物青蒿中提取分离得到的具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，是新型抗疟药。在犬体内研究已发现连续多日口服给予青蒿素后其血药浓度未达稳态，相反与首次给药后的血药浓度相比却有显著降低，这种时间依赖性药动学现象被制备工艺认为是由于青蒿素存在显著的自身诱导代谢而引起的。然而，通过静脉注射途径连续5日给予青蒿素后第5日犬体内的血药浓度与第1日静脉注射给药后犬体内血药浓度无显著性差异，说明青蒿素的自身诱导代谢诱导首过代谢作用来造成口服清除率（CL/F）的增加。静脉注射给药途径能避免首过代谢，因此将青蒿素搭载于合适的载体系统制成注射剂不仅可以降低甚至避免其显著的自身诱导代谢作用提高药物的生物利用度，而且可以降低临床治疗疟疾时青蒿素的用药剂量，减缓疟原虫对青蒿素耐药性的产生，降低药物相互作用的风险。纳米结构脂质载体系统（nanostructuredlipidcarriers,NLC）是在固体脂质纳米粒（solidlipidnanoparticles,SLN）的基础上发展起来的新型脂质纳米粒，除具有SLN可以保护敏感药物不被降解、实现缓控释效果和生物相容性好等优点外，还克服了SLN载药能力有限、物理稳定性差等不足。NLC最显著的特点就是向固态脂质中加入化学性质差异较大的液态脂质，使纳米粒以结晶缺陷型或无定型存在，增加了对药物分子的包容性，避免了放置过程中药物包封率降低的现象，提高稳定性。本研究采用生物相容性的单硬脂酸甘油酯（glycerylmonostearate,GMS）作为固态脂质材料，通过对肉豆蔻酸异丙酯(IPM)﹑油酸乙酯(EO)和中链甘油酸三酯(MCT)的筛选，最终选定了中链甘油酸三酯(MCT)作为液态基质。利用微乳滴定法和高压乳匀法分别制备了ART-NLC，并对两种方法制备的青蒿素纳米结构脂质粒进行了比较。此外，本文采用高效液相-质谱联用技术考察了尾静脉、腹腔注射ART-NLC和ART原料药后SD大鼠体内青蒿素的药动学，并绘制血药浓度量时曲线，比较原料药和纳米结构脂质粒经尾静脉/腹腔注射给药后在大鼠体内的主要药代动力学参数，对所制得的青蒿素纳米结构脂质粒的药代动力学进行初步的评价。一、青蒿素纳米结构脂质粒的处方前研究建立了高效液相-柱后衍生化-紫外检测法测定青蒿素（artemisinin,ART）体外含量的分析方法。采用乙腈-0.1mol/L醋酸盐缓冲盐（70：30，V/V）为流动相，1mol·L-1KOH乙醇（80％）溶液为柱后衍生化试剂，流速分别为0.7mL·min-1和0.2mL·min-1，Agilent-C18液相色谱柱（5mm，150mm×4.6mm）为分析柱，检测波长289nm。此方法的线性范围为1.8～18mg·mL-1。处方前研究主要测定了青蒿素在不同pH缓冲液和7种非极性溶剂中的平衡溶解度以及在正辛醇-水中的表观油水分配系数，为青蒿素新剂型的研究与开发提供实验基础。实验结果表明，37℃时青蒿素在纯水中的平衡溶解度为82.4±0.04mg·mL-1，随着pH的增大平衡溶解度呈先增大（pH5.0-6.8）后减小（pH6.8-8.0）的趋势；37℃时青蒿素在肉豆蔻酸异丙酯(IPM)﹑油酸乙酯(EO)和中链甘油酸三酯(MCT)中平衡溶解度较大分别为10.34±0.09mg·mL-1﹑9.28±0.05mg·mL-1和8.46±0.08mg·mL-1，青蒿素的正辛醇-水表观油水分配系数P为12.2（LgP=1.09）。二、青蒿素纳米结构脂质粒的处方研究及质量表征通过青蒿素在各油相、表面活性剂及助表面活性剂中的平衡溶解度的测定，结合考虑安全性后，选定液态脂质为IPM（肉豆蔻酸异丙酯）、MCT（中链甘油酸三酯）和EO（油酸乙酯），表面活性剂为RH40（聚氧乙烯氢化蓖麻油），乙醇和异丙醇作为助表面活性剂，对上述各相进行伪三元相图的滴定通过微乳区域面积筛选最佳组合。将单硬脂酸甘油酯（GMS）与液态脂质IPM、MCT和EO按不同比例混合后引入已筛选出的最佳微乳组合，再进行伪三元相图的滴定，通过对伪三元相图中形成微乳区域面积的大小进行比较，筛选出了GMS-EO(1:1)，RH40-Ethanolabsolute(3:1)、GMS-MCT(1:1)，RH40-Ethanolabsolute(3:1)和GMS-IPM(1:1)，RH40-Isopropylalcohol(3:1)三组微乳区域面积较大的组合。处方优化过程通过对影响微乳滴定结果的a固-液脂质比(2:1、1:1、1:2)、b液态脂质种类(EO、MCT、IPM)、c油相:表面活性剂相(2:8、3:7、4:6)、d滴定温度(60、70、75℃)、e乳化时间(0.5、1.0、1.5h)和f载入药量(20mg、40、60mg/4.6g脂质)六个因素以包封率为指标进行单因素实验，筛选得到其中四个影响较大的因素，采用正交实验设计方法建立了4因素3水平的正交实验表，结果得到各因素对ART-NLC包封率的影响次序是a＞f＞e＞b,因素a（固-液脂质比）对ART-NLC的平均包封率在α=0.05时的影响存在显著性，经过筛选得出各因素的最优组合为a3b2e3f1。ART-NLC的优化后工艺是将20mg的青蒿素原料药溶于4.6gGMS-MCT(1:2)的混合油相中，加入乳化剂10.7gRH40-Ethanolabsolute(3:1)，在70℃下充分搅拌熔融使其混合均匀。在磁力搅拌条件下将25.1ml相同温度2%的泊洛沙姆水溶缓缓滴加至有机相中，搅拌90min后迅速将其置于冰水中继续搅拌30min，过0.45mm微孔滤膜，即得。在微乳滴定法确定的最优处方基础上，采用高压乳匀法进一步优化了ART-NLC处方及制备工艺，利用新的设备来获取粒径更小的ART-NLC，处方优化过程是以平均粒径为指标，同样进行了单因素实验和正交实验设计，最终确定ART-NLC的优化后工艺是将20mg的青蒿素原料药溶于4.6gGMS-MCT(1:2)的混合油相中，加入乳化剂4.6gRH40-Ethanol(3:1)，在70℃下充分搅拌熔融使其混合均匀。在磁力搅拌条件下将27.6ml相同温度6%的泊洛沙姆水溶缓缓滴加至有机相中，搅拌30min后，补充体积至50ml得到初乳，将所得初乳经高压微射流纳米匀质机乳匀3次迅速将其置于冰水浴中搅拌冷却，即得。微乳法制备的ART-NLC平均包封率为70.9％，平均粒径在180～220nm之间，高压乳匀法制备的ART-NLC平均包封率为73.9％，平均粒径在80～90nm之间。高压乳匀法制备的ART-NLC经冻干处理，复溶后在体外的释放试验结果表明在初期前4h释放存在突释现象共释放了药物总量的67.4％，在10h时释药总量为98.6％，而原料药组在4h时释药总量已达99.1％。溶血性试验考察了0.5g/ml的ART-NLC冻干粉混悬液对人体红细胞的溶血性，结果发现阴性对照组和ART-NLC组均未发现明显的溶血现象，而阳性对照组则溶血，说明制备的ART-NLC不存在明显的溶血性。三、青蒿素纳米结构脂质粒在SD大鼠体内的初步药代动力学研究对本实验室已建立的高效液相-质谱联用测定大鼠血浆中青蒿素浓度的方法进行部分确证，验证该方法的精密度、准确度和线性范围。结果表明该方法的线性范围为2~400ng?mL-1，定量下限（LLOQ）为2ng?mL-1，质谱响应的线性关系良好。ART的日内和日间精密度均小于12%，准确度在97.6%-109.3%范围内，符合中国药典2010版的规定。将24只健康SD大鼠分为4组（尾静脉注射ART和ART-NLC组，腹腔注射ART和ART-NLC组），给药后在不同时间点采取血样，应用液相色谱-质谱联用方法测定血浆中青蒿素的含量并计算主要药动学参数。尾静脉注射组通过winnonlin软件的处理可读出C0，将C0和所测得的浓度利用非隔室模型法计算AUC0-t、AUC0-∞、CL、V和t1/2。尾静脉注射ART原料药后主要药动学参数AUC0-t为367.40±136.65h·ng·mL-1，AUC0-∞为373.65±138.85h·ng·mL-1，t1/2为1.03±0.25h，MRT为1.39±0.61h，CL为11.72±3.40L·h-1，V为15.17±3.60L。尾静脉注射ART-NLC后主要药动学参数AUC0-t为620.82±88.86h·ng·mL-1，AUC0-∞为693.78±104.04h·ng·mL-1，t1/2为2.85±1.05h，MRT为3.38±0.46h，CL为5.90±0.99L·h-1，V为19.83±4.36L。腹腔注射组达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为实测值。以半对数作图法，由消除相末几个浓度点计算消除速度常数k，利用非隔室模型法计算AUC0-t、AUC0-∞、CL/F、V/F和t1/2。腹腔注射ART原料药后，Cmax为490.90±78.71ng?mL-1，Tmax为0.58±0.20h主要药动学参数AUC0-t为860.72±228.80h·ng·mL-1，AUC0-∞为871.17±234.03h·ng·mL-1，t1/2为1.30±0.25h，MRT为1.75±0.31h，CL/F为6.02±1.33L·h-1，V/F为10.33±1.86L。腹腔注射ART-NLC后，Cmax为236.03±19.43ng?mL-1，Tmax为0.83±0.26h主要药动学参数AUC0-t为1188.46±246.54h·ng·mL-1，AUC0-∞为1233.06±235.57h·ng·mL-1，t1/2为3.63±0.84h，MRT为4.97±0.69h，CL/F为4.18±0.86L·h-1，V/F为20.33±2.88L。通过SPSS软件进行独立样本的t检验，结果显示ART组与ART-NLC组主要药动学参数均具显著性差异（P﹤0.05），说明制备得到的ART-NLC可以延长ART的体内生物消除半衰期，增大药物在血中的循环时间。收起

关键词 : 青蒿素注射纳米结构脂质粒药动学制备工艺

9. 蒿甲醚脂质纳米粒的制备及初步药动学研究

[学位论文] 王晓蕾山西医科大学 2013年硕士导师: 张淑秋共90页

摘要 : 蒿甲醚（AM）在水中几乎不溶，现有的制剂主要有油针、片剂、胶丸、胶囊等。蒿甲醚的口服制剂吸收快但不完全，前期研究表明多剂量口服给药后药物在体内的总体清除率增大、血药浓度下降，导致疟疾的复发率较高，研究表明可能是药物的自身诱导代谢所致... 展开蒿甲醚（AM）在水中几乎不溶，现有的制剂主要有油针、片剂、胶丸、胶囊等。蒿甲醚的口服制剂吸收快但不完全，前期研究表明多剂量口服给药后药物在体内的总体清除率增大、血药浓度下降，导致疟疾的复发率较高，研究表明可能是药物的自身诱导代谢所致，而静脉注射给药没有自身诱导代谢现象。其油针用于恶性疟的急救时通过肌内注射给药，虽然可能也不存在自身诱导作用，但该类药物主要作用于红内期的疟原虫，通过静脉注射给药更有利于药物快速发挥作用。本研究使用微乳法和高压乳匀法分别制备了蒿甲醚的脂质纳米粒（AM-NLC），所得NLC粒径小，稳定性好，体外释放表现出缓释特征，且无明显的体外溶血效应，通过大鼠尾静脉注射及腹腔注射给药后血药浓度平稳，有缓释作用。一．蒿甲醚脂质纳米粒的处方前研究建立了高效液相色谱法（HPLC）测定蒿甲醚含量的方法。以Agilent-C18柱（150×4.6mm，5μm）为分析柱，以甲醇-水-冰醋酸（85.4:37.6:1，v/v/v，pH3.4）为流动相，检测波长为230nm，柱温30℃，流速为1.0mL·min-1。该方法的线性范围为100～900μg·mL-1。使用摇瓶法测定蒿甲醚在正辛醇-水/缓冲体系中的表观油水分配系数。在37℃下，蒿甲醚在正辛醇-水及pH5、pH6.8、pH7.4、pH8的磷酸盐缓冲液中的表观油水分配系数（lgP）分别为：2.2、1.6、1.5、2.6、2.2。结果表明，蒿甲醚的脂溶性较大。pH在一定范围内变化时，蒿甲醚的表观油水分配系数不同，但变化幅度不大。采用高效液相色谱法（HPLC）法测定蒿甲醚在各种介质如注射用油、乳化剂及助乳化剂中的平衡溶解度。在37℃时，蒿甲醚在注射用油中链甘油三酯（MCT)、橄榄油、大豆油、蓖麻油及肉豆蔻酸异丙酯（IPM)中的平衡溶解度依次为：306.9，246.6，222.8，265.0，273.3mg·mL-1；在乳化剂(6mg·ml-1的胶束溶液)泊洛沙姆188（F68）、壬基酚聚氧乙烯醚（OP乳化剂）、聚山梨酯80、大豆卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40)中的平衡溶解度依次为：0.1，1.4，0.5，0.6，0.6mg·mL-1。在助乳化剂无水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、异丙醇、正丁醇中的平衡溶解度依次为：177.3，37.0，3.4，204.1，303.1mg·mL-1。结果表明蒿甲醚在注射用油MCT、OP乳化剂、助乳化剂正丁醇中的平衡溶解度比较大。二．蒿甲醚脂质纳米粒的处方筛选及优化本文使用微乳法(方法1）和高压乳匀法（方法2）两种方法制备蒿甲醚脂质纳米粒（AM-NLC），并将高压乳匀法制得的NLC进行冷冻干燥得到其冻干粉，以增加制剂的储存稳定性。在微乳法制备AM-NLC时，依据处方前研究的结果选择三种备用的油、乳化剂、助乳化剂，并以单硬脂酸甘油酯（GMS）为固态脂质，在一定的相比下制备空白NLC并绘制伪三元相图，依据相图中微乳区面积的大小进行处方筛选。结果确定以GMS为固态脂质、MCT为液态脂质（油）、RH40为乳化剂、乙醇为助乳化剂、去离子水为水相来制备NLC，并使用正交设计，以粒径和包封率两个指标对处方进行了优化。高压乳匀法制备AM-NLC时，从辅料的安全性出发，并结合处方前研究结果，确定以GMS为固态脂质、MCT为液态脂质、RH40及F68为乳化剂、去离子水为水相来制备NLC。通过单因素试验考察了制备工艺（温度、剪切速度、乳匀压力及循环次数、乳化剂加入方式等）和处方因素（脂质含量、乳化剂含量、两种乳化剂的比例、AM的含量等）对NLC粒径的影响，并使用正交设计，以粒径和包封率为指标对处方进行优化。将优化后的NLC进行冷冻干燥，使用复合冻干保护剂蔗糖和甘露醇，得到外观良好、再分散性好的冻干粉。三．蒿甲醚脂质纳米粒理化性质的测定由微乳法和高压乳匀法制备的AM-NLC均为淡蓝色的半透明液体，粒径小且分布均匀。通过透射电镜扫描，得到NLC的粒径分布特征。通过超滤法测定优化NLC的包封率，使用激光粒度仪对其粒径及zeta电位进行测定。微乳法制备的AM-NLC包封率为92.8%，平均粒径为30.0nm，zeta电位为-39.0mv；高压乳匀法制备的AM-NLC包封率为83.8%，平均粒径为61.5nm；高压乳匀法制备的NLC冻干粉的包封率为72.2%，平均粒径为225.1nm。四．蒿甲醚脂质纳米粒的体外释放试验及体外溶血试验本文中采用透析袋扩散法考察AM-NLC的体外释放特征，透析袋的分子量阈值为10kDa。由于蒿甲醚在水中的溶解度较小，难以测定，所以以含20%乙醇的磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4）作为释放介质，并使用乙醚来萃取释放液中的蒿甲醚进行测定，低、中、高浓度下的萃取率均大于95%。微乳法制备的AM-NLC在48h内的累积释放率为80.6%，高压乳匀法制备的AM-NLC冻干粉在48h内的累积释放率为83.9%。由释放曲线可以看出，两种方法制备的AM-NLC在前4h内均有轻微的突释现象，累积释放率分别为27.2%，36.4%。之后随着脂质的不断溶蚀，呈现出缓释特征。体外溶血试验考察NLC对家兔2%红细胞悬液的溶血作用，采用目视法进行检测。结果表明两种方法制备的AM-NLC在2h内均无明显的溶血作用，可供静脉注射使用。五．蒿甲醚脂质纳米粒的初步药动学研究建立了液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定大鼠血浆中蒿甲醚（Artemether,AM）浓度的方法。以青蒿素（Artemisinin,ART）为内标，以乙腈-10mmol·L-1醋酸铵（含0.1%甲酸）（85:15，v/v）为流动相，流速为0.6mL·min-1，以Agilent-C18（50×4.6mm,1.8μm）为色谱柱，采用电喷雾电离源（ESI），以多反应监测方式进行阳离子检测，用于定量分析的离子反应分别为m/z316.4→163.0（AM）和m/z300.8→209.0（ART）。该方法的线性范围为5.0-500.0ng?mL-1，定量下限为5.0ng?mL-1。雄性SD大鼠30只，每组6只，随机分为5组，其中三组以尾静脉注射方式分别给与AM溶液即对照组、微乳法制备的AM-NLC及高压乳匀法制备的AM-NLC，其余两组以腹腔注射方式分别给予微乳法制备的AM-NLC及高压乳匀法制备的AM-NLC，各组给药剂量均为15mg?kg-1，在不同时间点从大鼠眼眶后静脉丛采集血浆样品，以LC-MS/MS法测定血浆药物浓度并计算主要的药动学参数，腹腔注射组的达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为实测值。静脉注射组的结果为：AM溶液组的t1/2为（2.3±1.1）h，AUC0-t为（885.4±295.3）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（919.5±314.3）h·ng·mL-1，CL为（4.4±1.4）L·h-1，V为（11±2.9）L；微乳法制备的AM-NLC组的t1/2为（7.7±2.4）h，AUC0-t为（1391.2±234.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1492.2±304.2）h·ng·mL-1，CL为（2.2±0.3）L·h-1，V为（12±2.4）L；高压乳匀法制备的AM-NLC组的t1/2为（9.5±2.2）h，AUC0-t为（1886.8±555.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（2127.5±717.9）h·ng·mL-1，CL为（2.3±0.8）L·h-1，V为（15±6.1）L。腹腔注射组的结果为：微乳法制备的AM-NLC组的Cmax为（290.6±58.6）ng?mL-1，Tmax为（0.8±0.3）h，t1/2为（9.2±0.8）h，AUC0-t为（1158.1±349.9）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1252.2±388.7）h·ng·mL-1，CL/F为（3.0±0.8）L·h-1，V/F为（15±2.6）L；高压乳匀法制备的AM-NLC组的Cmax为（341.8±53.2）ng?mL-1，Tmax为（0.7±0.3）h，t1/2为（9.6±4.1）h，AUC0-t为（1599.8±150.6）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1636.8±237.9）h·ng·mL-1，CL/F为（2.2±0.6）L·h-1，V/F为（13±3.8）L。结果表明，与对照组相比，两种方法制备的AM-NLC通过静脉注射和腹腔注射给药后，AM在大鼠体内的半衰期均显著延长，且AUC增大，血药浓度相对平稳，这表明，将AM制成NLC后在大鼠体内均有缓释效果，延长了血中循环时间，提高了血药浓度整体水平。收起

关键词 : 蒿甲醚脂质纳米粒药动学制备工艺

10. 青蒿素类抗疟药与磷酸哌喹、本芴醇体外代谢相互作用研究

[学位论文] 吴婧山西医科大学 2009年硕士导师: 张淑秋共75页

摘要 : 青蒿素类抗疟药是目前仅有的一类在人体内尚未发现明显耐药性的强效抗疟药，为降低复发率、防止耐药性的发生，世界卫生组织(WHO)推荐使用以青蒿素类抗疟药为主的联合用药方案。但受分析方法等的限制，该类药物的药动学性质、代谢机理等尚不完全明确，... 展开青蒿素类抗疟药是目前仅有的一类在人体内尚未发现明显耐药性的强效抗疟药，为降低复发率、防止耐药性的发生，世界卫生组织(WHO)推荐使用以青蒿素类抗疟药为主的联合用药方案。但受分析方法等的限制，该类药物的药动学性质、代谢机理等尚不完全明确，存在机制不明的时间依赖性药动学与自身诱导代谢现象，因而可能易发生药物相互作用。鉴于复方制剂已在临床广泛使用，研究其联合用药的相互作用机理已迫在眉睫，本论文采用高效液相—柱后衍生化—紫外检测法建立了青蒿素类抗疟药与磷酸哌喹的体外分析方法，同时采用高效液相色谱—紫外检测法建立了本芴醇的体外分析方法，采用肝微粒体孵化法对青蒿素类抗疟药的代谢情况进行了考察，同时还考察了青蒿素、双氢青蒿素与磷酸哌喹、本芴醇单独孵化和共同孵化的药物代谢相互作用情况。一、青蒿素类抗疟药与其它抗疟药体外分析方法研究采用高效液相—柱后衍生化—紫外检测法建立了：(1)同时检测双氢青蒿素和磷酸哌喹的含量测定方法；(2)同时检测青蒿素与磷酸哌喹的含量测定方法；(3)同时检测青蒿琥酯及其代谢物双氢青蒿素的含量测定方法；采用高效液相色谱—紫外检测法建立了本芴醇在体外的含量测定方法。双氢青蒿素的线性范围为3.0-300μmol/L，r=0.9999，同时，磷酸哌喹的线性范围为6.8-680μmol/L，r=0.9996，双氢青蒿素的定量下限3.0μmol/L，检测限为0.6μmol/L；青蒿素的线性范围为3-300μmol/L，r=0.9998，同时，磷酸哌喹的线性范围为6.8-680μmol/L，r=0.9997，青蒿素的定量下限3.0μmol/L，检测限为0.3μmol/L；青蒿琥酯的线性范围为5-500μmol/L，r=0.9997，同时双氢青蒿素的线性范围为5-500μmol/L，r=0.9999，以双氢青蒿素确定的浓度定量下限为5μmol/L，检测限为1μmol/L；本芴醇的线性范围为3.78-378μmol/L，r=0.9998，浓度定量下限为3.78μmol/L。本文建立的分析方法灵敏度高，重现性好，适用于青蒿素、青蒿琥酯、双氢青蒿素、磷酸哌喹、本芴醇的质量控制及体外代谢动力学研究。二、青蒿素及其衍生物在人肝微粒体中的代谢研究考察了青蒿素、青蒿琥酯、双氢青蒿素在人肝微粒体中的代谢动力学。以WinNonlin药动学程序，根据酶催化反应动力学Michealis—Menten方程，自行编写程序，拟合药物浓度—时间曲线，并拟合得到主要药物代谢动力学参数。青蒿素在人肝微粒体中孵化60 min，Km、Vmax、Clint值分别为99.99±39.29(μmol·L-1)、2.73±0.56(μmol·L—1·min-1)、(2.70±0.54)×10-2(ml·min-1)；双氢青蒿素在人肝微粒体中孵化60 min，Km、Vmax、Clint值分别为99.73±50.94(μmol·L-1)、1.12±0.30(μmol·L—1·min-1)、(1.10±0.20)×10-2(ml·min-1)；青蒿琥酯在人肝微粒体中孵化60min，Km、Vmax、Clint值分别为49.47±18.75(μmol·L-1)、7.16±0.56(μmol·L—1·min-1)、(0.14±0.04)×10-2(μmol·L—1·min-1)。以上结果可知，青蒿琥酯在人肝微粒体中的代谢速度快于双氢青蒿素和青蒿素。同时对这几种青蒿素类抗疟药在失活微粒体中的孵化情况进行了考察，结果证明青蒿素类抗疟药在人肝微粒体中确实发生了生物代谢，而非化学降解。三、青蒿素类抗疟药联合用药在人源肝微粒体中的代谢研究考察了青蒿素类抗疟药联合用药在人肝微粒体中的代谢差异情况，以WinNonlin药动学程序，根据酶催化反应动力学Michealis—Menten方程，自行编写程序，拟合药物浓度—时间曲线，并拟合得到主要药物代谢动力学参数。通过比较药物单独孵化和共同孵化后代谢参数的变化情况得出药物相互作用情况，结果如下：磷酸哌喹和本芴醇均使青蒿素在人肝微粒体中的代谢减慢；磷酸哌喹使双氢青蒿素在人肝微粒体中的代谢加快，但是本芴醇对双氢青蒿素在人肝微粒体中的代谢未产生显著影响；青蒿素和双氢青蒿素均未对磷酸哌喹在人肝微粒体中的代谢产生显著影响；青蒿素和双氢青蒿素均使本芴醇在人肝微粒体中的代谢加快。收起

关键词 : 抗疟药磷酸哌喹体外代谢本芴醇青蒿素药动学性质代谢机理复方制剂