摘要: 目的： 疟疾是由感染疟原虫的按蚊叮咬或者输入含有疟原虫的血液而导致的一种严重虫媒传染病。在治疗疟疾方面青蒿素类药物有独特的优势，是全球治疗疟疾的一线药物。但近年来青蒿素耐药性疟疾传播的地理范围日益扩大，耐药地区青蒿素类药物治疗失... 展开 目的： 疟疾是由感染疟原虫的按蚊叮咬或者输入含有疟原虫的血液而导致的一种严重虫媒传染病。在治疗疟疾方面青蒿素类药物有独特的优势，是全球治疗疟疾的一线药物。但近年来青蒿素耐药性疟疾传播的地理范围日益扩大，耐药地区青蒿素类药物治疗失败率高达50％。在没有其他替代药物的情况下，青蒿素耐药威胁着全世界为消除疟疾做出的所有努力。 基于以上背景，为了实现：①特异性抑制PI3K激酶，减少PI3P的生成，恢复疟原虫对ARTs的敏感性、保障ARTs活化起效;②利用感染红细胞膜和疟原虫膜上特有的代谢转运通道，将两种药物逐级靶向至疟原虫，增加两种药物在疟原虫内的富集，进一步增强ARTs效力。本研究首先通过计算机辅助设计和疟鼠体内的药效学评价，筛选出与PI3K蛋白亲和力高且具有较好抗疟效果的疟原虫PI3K抑制剂。利用药效学和相关脂质变化验证双氢青蒿素（DHA）联合PI3K抑制剂（idelalisib）协同逆转耐药的效果并对耐药相关机制进行初步评价。其次基于葡萄糖转运体、疟原虫还原微环境和疟原虫大分子转运通道，分别制备有无葡萄糖基、有无GSH响应（还原响应，二硫键）及不同粒径（～35 nm和～121nm）修饰的纳米微粒，初步评价这几种转运体（通道）对微粒靶向性和抗疟药效的影响。最后在前述研究的基础上，设计共载DHA和idelalisib的葡萄糖基修饰小粒径还原响应微粒（DHA+idelalisib共载逐级靶向递药微粒），期待微粒可通过大分子转运通道等选择性进入感染红细胞、再经疟原虫膜己糖转运体主动转运进入疟原虫、而后在疟原虫内实现还原响应释药、最后两药协同活化起效，为阐释ARTs耐药机制及治疗耐药性疟疾提供依据和新策略。 方法： 1、疟原虫PI3K抑制剂的筛选及其与双氢青蒿素协同作用的评价 为了找到对疟原虫PI3K有较强效果的抑制剂，本研究首先以恶性疟原虫PI3K同源模建得到的蛋白结构为基础，选择27种有人类三型PI3K抑制作用的化合物进行分子对接，以对接得分、结合能大小等为考察指标，初步筛选疟原虫PI3K抑制剂候选化合物。在此基础上，使用DHA和候选抑制剂的混合溶液对约氏BY265疟鼠进行治疗，以感染率、抑制率和治愈率等为考察指标，筛选药效最好的疟原虫PI3K抑制剂。 为评价DHA和PI3K抑制剂的协同增敏和逆转耐药效果，将DHA和PI3K抑制剂（idelalisib）以不同比例混合后作用于BY265疟鼠、伯氏K173青蒿素敏感和K173青蒿素抗性疟鼠，对两药联用前后的抑制率、协同指数（CI)、半数抑制浓度（ED50）和耐药指数变化等进行考察。 2、DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响 为探究PI3K耐药和DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响，以K173敏感疟鼠为对照，将生理盐水（Control）、DHA溶液、idelalisib溶液和DHA+idelalisib混合溶液注射至K173抗性疟鼠体内，连续给药4天，最后1次给药后提取疟原虫，对疟原虫脂质成分进行测定。分析 Control vs idelalisib、Control vs DHA、Control vs DHA+idelalisib、idelalisib vs DHA+idelalisib、DHA vs DHA+idelalisib 组的耐药相关脂质代谢差异，对PI3P含量、差异倍数大的脂质种类、及鞘脂和固醇的变化量进行不同差异分组间的比较，初步阐释两药联用逆转耐药的机制。 结果： 1、疟原虫PI3K抑制剂的筛选及其与双氢青蒿素协同作用 (1)选择idelalisib作为疟原虫PI3K抑制剂 以恶性疟原虫PI3K同源模建蛋白中的小分子配体为基础或SYBYL-X2.0软件自动识别构建两种对接口袋，与27种有PI3K抑制作用的化合物对接后使用分子动力学模拟验证对接结果，筛选出对接得分最高的5种候选抑制剂(copanlisib、idelalisib、taselisib、umbralisib、AZD6482)。将 5 种候选抑制剂与 DHA 等摩尔量混合后注射至约氏BY265疟鼠体内，停药1天小鼠尾尖取血涂片，DHA+idelalisib组(0.60±0.56)％和 DHA+taselisib 组(1.3±0.93)％的感染率相比 DHA 组(3.50±1.00)％显著降低;在接种32天内，DHA+idelalisib组转阴率最高，且仅DHA+idelalisib组有小鼠治愈，故选择idelalisib作为疟原虫PI3K抑制剂用于后续考察。 (2)DHA+idelalisib具有协同增敏、逆转耐药的作用 将不同摩尔比的DHA和idelalisib混合溶液作用于BY265疟原虫感染的小鼠，停药一天，固定其中一种药物的浓度，感染率会随着另一种药物给药剂量的增加而减小，抑制率反之。不同剂量比的DHA+idelalisib组均表现出不同程度的协同抗疟效果，综合比较CI值和抑制率，idelalisib用量为60.2 μmol/kg/d时与DHA协同作用较佳，DHA+idelalisib 的剂量比(μmol/kg/d)为 1.1∶60.2、2.2∶60.2、4.4∶60.2、8.8∶60.2及17.6∶60.2时分别表现出强度、强度、高度、高度和中度的协同作用。 在K173敏感疟鼠中，相比DHA溶液组，DHA+idelalisib联用后对疟原虫的抑制作用增强，两种药物联用达到中度和低度的协同增敏效果。在K173抗性疟鼠中，相比DHA溶液组，DHA+idelalisib联用表现出中、高度的协同作用，抑制率显著增加(P＜0.01)。且在K173抗性疟鼠中，DHA+idelalisib联用显著降低了 DHA的ED50,使得DHA抗性指数由13.82降低到2.75,降低了 5倍，达到较好的协同逆转耐药的作用。 2、DHA+idelalisib联用对疟原虫脂质代谢的影响 (1)DHA+idelalisib联用影响敏感株PI3K相关脂质的表达 在K173敏感疟原虫中，与疟鼠对照Control组相比，单用DHA未对疟原虫中的PI3P表达产生明显影响;DHA联合使用idelalisib后，DHA+idelalisib组相比DHA组的PI3P表达明显下调(P=0.004,VIP=1.90)。 以P＜0.05,VIP＞1为条件，筛选两组间的差异脂质。Control组和idelalisib溶液组相比，在差异倍数最大的10种上调或下调的脂质中，维生素D类脂质(LMST03020457)上调。这类脂质可通过抑制PI3K-AKT通路介导细胞凋亡，对疟原虫的生长有抑制作用。Control组和DHA溶液组差异倍数最大的10种上调或下调的差异脂质中除发现与idelalisib组相同的维生素D类脂质外还发现有细胞凋亡诱导作用的鞘脂Cer(d16∶1/17∶0)上调。Control组和DHA+idelalisib混合溶液组差异倍数最大的10种上调或下调的差异脂质中有7种和DHA组相同，除和单用DHA或单用idelalisib上调相同的维生素D类脂质及和DHA单用相同上调的Cer(d16∶1/17∶0)细胞凋亡诱导剂外，另1种维生素D类物质(LMST03020502)也被上调。 (2)DHA+idelalisib联用影响抗性株PI3K相关脂质的表达 结论： 1、选择的PI3K抑制剂idelalisb在体外分子对接和体内抗疟药效学评价中都具有较好的表现。将DHA+idelalisb注射至敏感和耐药疟原虫感染的小鼠体内，显示出一致的协同作用;且在抗性疟鼠中，idelalisb将DHA的抗性指数从13.82降低至2.75,表明idelalisb一定程度上恢复了 DHA对抗性疟原虫的敏感性。通过分析两种药物治疗前后脂质表达的变化，与DHA组相比，DHA+idelalisb组的PI3P表达显著下调，充分验证了 idelalisb可以抑制疟原虫PI3K,减少PI3P的产生，增强或恢复DHA的抗疟敏感性。在抗性虫株中，idelalisb与DHA联用对疟原虫中囊泡相关脂质的表达也产生了明显的影响(在耐药疟原虫中囊泡过表达)，间接说明idelalisib具有恢复ARTs敏感性的作用。此外，维生素D类物质在idelalisb治疗后显著上调，推断idelalisb还可以通过抑制PI3K-AKT途径介导疟原虫凋亡。这些发现为阐明青蒿素耐药性机制和治疗耐药性疟疾提供了依据和新思路。 2、基于糖转运体、疟原虫还原微环境和大分子转运通道，分别设计了葡萄糖基靶向、还原响应和小粒径微粒;糖转运体或大分子转运通道的响应修饰均使得微粒具有了较好的靶向作用;还原响应二硫键的修饰对增加DHA导致的过氧化损伤产生了一定的辅助作用。将小粒径靶向、葡萄糖靶向和还原响应结合起来后，靶向至疟原虫感染红细胞的微粒含量进一步提高。在证实DHA+idelalisib对敏感和抗疟疟原虫有强效抑制作用的基础上，将DHA+idelalisib共载在葡萄糖靶向的小粒径还原响应微粒中，增加了两种药物在敏感和抗性疟原虫中的有效含量，达到了更好的抗疟疗效。为抗疟药递送系统的设计提供了新策略。 收起