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1. 选择性S1P1激动剂SYL927治疗特发性肺纤维化的药效学及机制研究；Pan-PI3K抑制剂治疗胃癌的药效及机制研究

[学位论文] 伏蓉中国医学科学院北京协和医学院 2020年硕士导师: 金晶共69页

摘要 : 特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、渐进性的间质性肺病，中位生存期短且无特效治疗药物。目前研究认为慢性炎症和肺泡毛细血管内皮屏障破坏与IPF的发生发展密切相关。鞘氨醇-1-磷酸-受体1(Sphingosine-1-phosphate rec... 展开特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、渐进性的间质性肺病，中位生存期短且无特效治疗药物。目前研究认为慢性炎症和肺泡毛细血管内皮屏障破坏与IPF的发生发展密切相关。鞘氨醇-1-磷酸-受体1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1P1)是一种G蛋白偶联受体，在调节淋巴细胞运输和血管屏障保护中发挥重要作用。SYL927是中国医学科学院药物研究所自主合成的新型选择性S1P1激动剂，基于S1P1在抗炎免疫和血管内皮屏障调节方面的重要作用，我们对SYL927治疗IPF进行了药效学研究及初步的机制探索。首先建立了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型考察了SYL927对IPF的初步治疗作用。研究发现，SYL927可以显著提高肺纤维化小鼠生存率，改善多项肺功能，并显著降低肺组织的炎细胞浸润及胶原沉积。WesternBlot实验进一步证明，SYL927可以显著上调小鼠肺组织上皮表型标志物ZO-1和E-cadherin表达，下调间质表型标志物Snail的表达，并下调基质重要组成蛋白纤维粘连蛋白Fibronectin表达。提示，SYL927对IPF有显著的治疗作用，并可能与其抗炎作用及屏障保护功能相关。肺泡毛细血管屏障主要由毛细血管内皮细胞，肺泡上皮细胞及各自的基底膜构成。因而我们分别考察了SYL927对毛细血管内皮细胞和肺泡上皮的作用。体外应用激光共聚焦显微镜定性观察表明，SYL927能够通过诱导纤维肌动蛋白F-Actin重塑促进肌动蛋白环形成并诱导紧密连接相关蛋白ZO-1定位于细胞膜内侧，显著促进血管内皮细胞的紧密连接。FITC-BSA血管内皮渗透性实验定量研究进一步表明，SYL927能够显著降低血管的通透性，增加内皮细胞的紧密连接。体内小鼠腹腔毛细血管渗漏实验亦表明，SYL927预防给药可以明显降低醋酸诱导的毛细血管渗漏，作用强度与阳性对照药地塞米松相当。提示，SYL927对毛细血管内皮细胞的连接具有很好的促进作用。肺泡上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及血管内皮细胞间质转化(Endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)是肌成纤维细胞的重要来源，也是屏障损伤的重要关键因素。WesternBlot研究表明，SYL927对TGF-β1诱导的EMT/EndoMT具有很好的逆转作用，能够上调肺泡上皮细胞A549细胞上皮markerE-cadherin表达，下调间质markerSnail的表达，并显著下调血管内皮细胞EA.hy926细胞Fibronectin、Snail以及Slug的表达。综上所述，本研究表明SYL927对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化有显著疗效，其作用机制可能与其抗炎免疫作用及保护肺泡毛细血管内皮屏障功能有关。提示，靶向调节S1P1有望成为治疗IPF的新策略。关键词:特发性肺纤维化;慢性炎症;肺泡毛细血管屏障;S1P1;SYL927 胃癌是一种高患病率高致死率的恶性肿瘤，尤其在我国高发，预后较差，且现有治疗药物有限。PI3K是调节细胞生长、增殖、代谢、转移、凋亡等生命活动的重要调控通路。目前研究表明，胃癌存在广泛的PI3K信号通路过度激活以及PIK3CA与PTEN基因突变。化合物6a、7a是中国医学科学院药物研究所许恒研究员课题组合成的新型Pan-PI3K抑制剂。基于PI3K信号通路在胃癌发展中的重要作用，我们对化合物6a、7a进行了治疗胃癌的药效学研究及初步机制探索。首先通过MTT细胞增殖实验检测6a、7a对PIK3CA/PENT双突变的人胃癌细胞株HGC-27的体外抑制活性。研究发现，化合物6a、7a可以显著抑制HGC-27细胞在体外增殖。PI染色法检测细胞周期以及AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡结果表明，化合物6a、7a作用于HGC-27细胞24h可以将细胞阻滞于G0/G1期并促进细胞凋亡。WesternBlot实验进一步表明，化合物6a、7a作用于HCG273h可以有效抑制PI3K信号通路相关蛋白P-AKT(S473)、P-S6RP与P-4E-BP的表达，从而有效抑制该信号通路活化提示新型Pan-PI3K抑制剂6a、7a可以通过抑制HGC-27细胞中PI3K信号通路从而抑制细胞增殖，使细胞出现G0/G1期阻滞并诱导细胞凋亡。基于上述体外实验，进一步建立了人胃癌细胞株HGC-27裸鼠异体移植瘤模型考察了化合物6a、7a对胃癌的体内抑制活性。研究发现，化合物6a(40mg/kg)、7a(20/40mg/kg)均可显著抑制肿瘤增殖且7a(40mg/kg)对肿瘤抑制率可达88.67％。肿瘤组织免疫组化检测表明，化合物6a(40mg/kg)、7a(20/40mg/kg)均可有效抑制肿瘤增殖标志物Ki67的表达，同时抑制肿瘤组织中P-AKT(S473)的表达。本研究证实，Pan-PI3K抑制剂6a、7a可以通过抑制PI3K信号通路可以有效抑制胃癌细胞HGC-27的体内外增殖，并使HGC-27细胞出现G0/G1期阻滞、诱导其凋亡。收起

关键词 : 胃癌 PI3K/AKT信号通路 Pan-PI3K抑制剂靶向治疗

2. 新型PI3K α亚型选择性抑制剂KTC-1001抗乳腺癌作用的研究

[学位论文] 李晓菲天津医科大学 2021年硕士导师: 孔德新共88页

摘要 : 目的：本文首先验证KTC-1001为一种潜在的PI3Kp110α亚型抑制剂，而后选取乳腺癌PIK3CA突变细胞系MCF-7和非突变细胞系MDA-MB-231作为研究模型，探索了KTC-1001在体外对两种乳腺癌细胞的抗癌作用及分子机制，并进一步检测了KTC-1001在裸鼠体内的... 展开目的：本文首先验证KTC-1001为一种潜在的PI3Kp110α亚型抑制剂，而后选取乳腺癌PIK3CA突变细胞系MCF-7和非突变细胞系MDA-MB-231作为研究模型，探索了KTC-1001在体外对两种乳腺癌细胞的抗癌作用及分子机制，并进一步检测了KTC-1001在裸鼠体内的抗乳腺癌作用。实验为PI3K亚型特异性抑制剂在抗乳腺癌领域的进一步研发提供新的思路和实验依据。方法： 1.通过质谱和氢谱验证化合物结构的准确性。通过对八种癌细胞系21种癌细胞建立相关靶点的指纹图谱，采用指纹图谱相关系数法（SRB）验证KTC-1001是否靶向抑制PI3K。 2.使用激酶活性测定实验（Adapta法）检测新型PI3K抑制剂KTC-1001分别对PI3K四种亚型α，β，γ，δ的抑制活性。 3.利用MTT法以及平板克隆实验来检测KTC-1001对两种乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖活性的影响。 4.使用流式细胞术检测KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231细胞周期的影响。Westernblot实验检测KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231细胞周期相关蛋白p-Rb，CyclinD1，p27表达水平的影响。 5.使用流式细胞术检测KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响。Westernblot实验检测KTC-1001对MDA-MB-231细胞的凋亡相关蛋白Caspase3、PARP活化的影响。 6.进行细胞划痕实验来检测KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。 7.用MDC实验检测KTC-1001处理MCF-7和MDA-MB-231细胞对细胞自噬泡形成的影响；Westernblot实验检测自噬相关蛋白p62，Atg5表达水平的变化以及LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化；用mRFP-GFP-LC3质粒转染MCF-7和MDA-MB-231细胞，在共聚焦显微镜下观察KTC-1001对细胞自噬流的影响。 8.Westernblot法分析KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（ProteinkinaseB，Akt）通路（PI3K/Akt通路）关键分子表达水平和磷酸化水平的影响。 9.建立MCF-7细胞的裸鼠异体移植瘤模型，检测KTC-1001对小鼠瘤体积、瘤重、体重的影响，并采用HE染色和免疫组化实验分析KTC-1001的体内抗乳腺癌活性和分子机制。结果： 1.SRB结果获得R值为0.709，证实KTC-1001靶向抑制PI3K，经过化合物质谱和氢谱数据的验证，进一步确定了KTC-1001的化学结构。 2.激酶活性测定实验（Adapta法）结果显示KTC-1001对于四种亚型的抑制效果不同，其对α亚型的IC50为31.86nM，对β亚型的IC50大于2.5μM，对γ亚型的IC50为276.9nM，对δ亚型的IC50为591.8nM。表明KTC-1001为p110α亚型选择性抑制剂。 3.MTT测得结果显示KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞有较好的增殖抑制活性，IC50值分别为0.85μM和8.23μM。平板克隆实验表明KTC-1001对乳腺癌细胞MCF-7和MBA-MB-231的克隆形成能力有明显的抑制作用。表明KTC-1001能抑制乳腺癌细胞增殖。 4.流式细胞术检测周期结果表明KTC-1001对乳腺癌细胞有周期阻滞作用，可以将MCF-7和MDA-MB-231细胞阻滞在G0/G1期。并且相关Westernblot结果也表明随着KTC-1001浓度的升高，周期相关蛋白p27表达水平升高，p-Rb和cyclinD1水平下降。 5.流式细胞术检测凋亡的结果表明KTC-1001仅对MDA-MB-231具有诱导凋亡的作用。Westernblot的结果显示KTC-1001促使MBA-MB-231细胞中caspase3和PARP蛋白裂解活化，Bad表达水平升高。 6.细胞划痕实验显示低毒性浓度下的KTC-1001可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移。 7.MDC染色实验结果显示给予KTC-1001后MCF-7和MDA-MB-231细胞中自噬小体增多且荧光强度增强；Westernblot中KTC-1001引起LC3Ⅱ与LC3Ⅰ比值升高、P62降表达，Atg5升表达；使用mRFP-GFP-LC3双标蛋白的自噬检测结果显示，转染了mRFP-GFP-LC3质粒的细胞在给予KTC-1001后绿色和红色荧光均增强，而在与自噬抑制剂Baf-A1共处理下红色荧光显著减弱，表明KTC-1001诱导乳腺癌细胞发生自噬；自噬抑制剂CQ与KTC-1001共处理MCF-7和MDA-MB-231细胞后，细胞活力增强，表明KTC-1001诱导乳腺癌细胞发生自噬性死亡。 8.Westernblot结果表明不同浓度KTC-1001处理后，MCF-7和MDA-MB-231细胞中PI3K通路关键因子p-PDK1（Ser241），p-Akt（Ser308），p-Akt（Ser473），p-mTOR（Ser2488）和p-p70S6K（Thr389）水平均下降。 9.KTC-1001显著抑制了裸鼠皮下瘤的生长，但对小鼠体重未见明显影响；免疫组化实验结果显示KTC-1001抑制了肿瘤组织中Ki67的表达水平和p-Akt（Ser473）的水平。结论： 1.指纹图谱的比较以及体外激酶实验的结果表明，KTC-1001是一个潜在的PI3Kp110α亚型特异性抑制剂。 2.KTC-1001对MCF-7和MDA-MB-231具有显著的抑制增殖、诱导细胞G0/G1期周期阻滞、诱导凋亡和自噬作用，并能抑制细胞迁移，显示出较好的体外抗乳腺癌活性。机制研究表明KTC-1001可能通过抑制PI3K/Akt通路发挥抗乳腺癌作用。 3.KTC-1001在裸鼠体内能显著抑制肿瘤生长，且显示较低毒性。机制研究表明KTC-1001体内抗乳腺癌活性与PI3K/Akt通路密切相关。收起

关键词 : 乳腺癌细胞周期阻滞 PI3K通路 Akt通路 PI3K抑制剂

3. 新型PI3Kα抑制剂的设计、合成和生物活性测定

[学位论文] 王祥聪上海应用技术大学 2021年硕士导师: 汪忠华;吴范宏共106页

摘要 : PI3Kα是一种磷酸肌醇3激酶（PI3Ks）的亚型，是PI3K/AKT/mTOR信号通路的重要调节剂，其异常激活可以引起致癌受体酪氨酸激酶（RTK）信号转导和肿瘤的发生。本论文的研究工作，主要从以下部分进行阐述： 1.基于65个以3-苯基磺酰氨基吡啶为母核结... 展开

关键词 : PI3K&alpha 抑制剂生物活性分子对接

4. PI3Kα抑制剂虚拟筛选及其抗肿瘤分子机制研究

[学位论文] 尹双红南方医科大学 2023年硕士导师: 夏承来共96页

摘要 : 研究目的: PI3K/AKT/mTOR信号通路突变和异常激活常在卵巢癌和乳腺癌中被发现，而该通路与肿瘤生长、迁移、代谢以及耐药性都密切相关，因此,PI3K/AKT/mTOR被视为开发抗肿瘤药物的理想靶标。本论文以PI3K的α亚型为研究靶点，通过虚拟筛选发现高... 展开研究目的: PI3K/AKT/mTOR信号通路突变和异常激活常在卵巢癌和乳腺癌中被发现，而该通路与肿瘤生长、迁移、代谢以及耐药性都密切相关，因此,PI3K/AKT/mTOR被视为开发抗肿瘤药物的理想靶标。本论文以PI3K的α亚型为研究靶点，通过虚拟筛选发现高效的PI3K抑制剂，并探讨虚拟筛选所得葫芦素B(CuB)抑制耐药卵巢癌细胞增殖和化合物CP068抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制，为卵巢癌和乳腺癌的治疗提供新思路。研究方法: (1)通过Schording软件中对Targetmol和Chemdiv两个数据库先进行HTVS、SP、XP筛选，再根据分层级聚类和分子对接打分虚拟筛选PI3Kα抑制剂。通过CCK-8试剂，检测CuB对顺铂耐药卵巢癌细胞和化合物CP068对乳腺癌细胞活力的影响。 (2)通过Hoechst染色与流式细胞术检测CuB对耐药卵巢癌细胞的增殖和凋亡的影响，通过集落克隆实验与流式细胞仪检测CP068对乳腺癌细胞的增殖和周期的影响。 (3)通过构建卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤模型和乳腺癌荷瘤小鼠模型，分别观察CuB和CP068对肿瘤生长的影响。 (4)通过蛋白质组学分析CP068抑制乳腺癌细胞生长过程中对蛋白表达谱的影响，并通过蛋白印迹法分析CuB和CP068或联用PI3K抑制剂LY294002对PI3K/AKT/mTOR通路的干预和下游调控的分子信号的影响。研究结果: (1)虚拟筛选发现与PI3Kα有很强亲和力并具有抗肿瘤活性的CP068和CuB,其结合能分别是-9.0 kcal/mol和-9.14 kcal/mol;CuB和CP068对顺铂耐药卵巢癌细胞和乳腺癌细胞呈剂量依赖性抑制作用。 (2)Hoechst染色和凋亡检测结果表明，CuB能呈浓度依赖性的抑制卵巢癌耐药细胞的增殖并促进细胞凋亡。集落克隆和细胞周期分析结果显示，CP068能以浓度依赖性的抑制乳腺癌细胞的增殖，并诱导细胞G2和M期的阻滞。 (3)CuB不能克服顺铂耐药来抑制耐药卵巢癌移植瘤的生长;CP068对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响与模型组没有统计学差异。 (4)蛋白质组学分析和蛋白免疫印迹法的结果显示，CuB能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，并且诱导DNA损伤，激活cGAS和IKBα招募从而抑制顺铂耐药卵巢癌细胞的增殖;CP068能抑制PI3K/AKT/mTOR通路，激活P53/P21通路并调控ATR与Cyclin D信号分子诱导细胞周期阻滞抑制乳腺癌细胞的增殖。研究结论: 本课题结合虚拟筛选、分析对接和抗肿瘤活性评价发现了 PI3K抑制剂CuB和CP068。CuB通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导细胞凋亡和DNA损伤，并激活cGAS和招募IKBα,抑制顺铂耐药卵巢癌细胞增殖;CP068可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路，激活P53/P21通路并调控ATR和Cyclin D信号，从而诱导乳腺癌细胞周期阻滞和抑制细胞增殖，给PI3K抑制剂的开发提供新的选择。收起

关键词 : PI3K抑制剂虚拟筛选抗肿瘤作用

5. CARM1在肿瘤中的作用机制及其抑制剂的研究

[学位论文] 张竹青中国科学院大学 2020年博士导师: 丁健共125页

摘要 : 肿瘤的发生发展常常伴随表观遗传的异常，而蛋白的翻译后修饰是表观遗传的重要组成部分。蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族中的CARM1（PRMT4）可以通过催化其组蛋白底物或非组蛋白发生单甲基化修饰或不对称二甲基化修饰，发挥包括RNA剪接、DNA损伤修... 展开肿瘤的发生发展常常伴随表观遗传的异常，而蛋白的翻译后修饰是表观遗传的重要组成部分。蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族中的CARM1（PRMT4）可以通过催化其组蛋白底物或非组蛋白发生单甲基化修饰或不对称二甲基化修饰，发挥包括RNA剪接、DNA损伤修复和调控细胞周期在内的多种生物功能。研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤中常存在CARM1的异常高表达和突变，并且CARM1的功能异常与肿瘤病人的预后或肿瘤的恶性程度密切相关。因此，CARM1被认为是非常具有潜力的抗肿瘤治疗靶点。但是，目前CARM1抑制剂抗肿瘤作用机制尚不明确，且对CARM1功能和生物学作用机制的研究不够深入，CARM1的病理作用还有待进一步确证。因此开发高效的化学生物学探针或小分子抑制剂，对CARM1的药物开发与作用机制研究有重要意义。本论文旨在开发高效高选择性的CARM1抑制剂和探究CARM1调控肿瘤进展的分子机制，推进CARM1抑制剂的研发进程。基于AlphaLISA技术的CARM1抑制剂高通量筛选平台，我们筛选得到四氢异喹啉类与乙二胺类CARM1抑制剂。选择性测试和体内抗肿瘤效果评价的结果显示四氢异喹啉类CARM1抑制剂GZH-C-177是一个具有体内外抗肿瘤活性的CARM1特异性抑制剂;乙二胺类CARM1抑制剂GZH-C-31在分子和细胞水平显示出对CARM1的靶点抑制作用，同时在免疫缺陷小鼠ASPC-1和BT549皮下移植瘤模型中体现出比阳性化合物EZM2302更优的肿瘤抑制活性。此外，我们也发现GZH-C-31或许可以通过增强抗肿瘤的免疫反应，进而提高其抗肿瘤效果。我们通过检测癌细胞中CARM1的表达量和调研数据库证实CARM1在多种肿瘤中存在过表达，且CARM1的表达量与乳腺癌和肾透明细胞癌患者的不良预后呈正相关。通过化学分子探针与基因沉默技术明确了乳腺癌细胞和肾透明细胞癌细胞的敏感群体，并发现在乳腺癌敏感细胞株和非敏感细胞株中差异变化基因主要富集与MAPK/ERK和PI3K/AKT等信号通路。进一步研究发现抑制CARM1导致乳腺癌和肾癌的不敏感细胞株的ERK、AKT的磷酸化水平上调，说明MAPK/ERK、PI3K/AKT可能是介导肿瘤细胞对CARM1抑制剂敏感性的关键信号通路。我们重点探究了PI3K信号通路是否介导了肿瘤细胞对CARM1抑制剂的敏感性差异。通过PI3K抑制剂与CARM1抑制剂进行联用，我们发现PI3K抑制剂可以促进部分实体瘤细胞和血液瘤细胞对CARM1抑制剂的敏感性。以不敏感肾癌细胞株786-O为研究对象，我们发现CARM1抑制剂和PI3K抑制剂联用可以促进细胞凋亡，同时抑制细胞自噬，从而产生协同抑制细胞增殖的作用。综上所述，我们筛选并评价了两种靶向CARM1的选择性抑制剂，同时证实PI3K信号通路是介导肿瘤细胞对CARM1抑制剂耐药的关键信号通路之一。CARM1抑制剂与PI3K抑制剂联用可以协同抑制肿瘤细胞增殖，拓展了两种抑制剂的应用范围，为后续CARM1抑制剂的开发和未来的临床应用提供了线索和思路。收起

关键词 : 表观遗传 CARM1抑制剂联合 PI3K抑制剂小分子抑制剂

6. 探究PI3Kα抑制剂BYL719抗胃癌作用机制

[学位论文] 马旭斌郑州大学 2021年硕士导师: 马立英共69页

摘要 : 胃癌的发生率和致死率在我国分别排名第三位与第二位。然而，目前胃癌治疗仍以手术切除结合传统放、化疗为主。治疗胃癌的靶向药物的靶标仅有HER-2、VEGFR-2、PD-1，且只在部分患者中有效。亟需开发更多治疗胃癌的靶向药物。 PI3K信号通路在胃癌... 展开胃癌的发生率和致死率在我国分别排名第三位与第二位。然而，目前胃癌治疗仍以手术切除结合传统放、化疗为主。治疗胃癌的靶向药物的靶标仅有HER-2、VEGFR-2、PD-1，且只在部分患者中有效。亟需开发更多治疗胃癌的靶向药物。 PI3K信号通路在胃癌中异常激活较高，参与胃癌的发生发展。其中，编码PI3Kα催化亚基的PIK3CA在胃癌中高频激活突变(7％-25％)。此外，PI3K信号通路参与已有胃癌治疗药物的耐受。已有文献报道体外抑制PI3K具有抗胃癌活性。因此，PI3Kα是潜在抗胃癌靶标。 BYL719是PI3Kα选择性抑制剂，减少了PI3K泛抑制剂靶点依赖性的不良反应。然而，体内外试验结果显示单一PIK3CA突变不能准确指示PI3K抑制剂的抗肿瘤活性。因此，有必要探究能够指示或预测PI3Kα抑制剂抗肿瘤活性的生物标志物。基于以上背景，本课题拟首先在细胞和动物水平评价PI3Kα抑制剂BYL719的抗胃癌活性，接着使用细胞生物学和分子生物学技术探究BYL719抗胃癌的疗效生物标志物。首先，通过SRB实验发现BYL719差异性地抑制不同胃癌细胞的增殖，BYL719对敏感胃癌细胞AGS和NCI-N87的GI50在纳摩尔水平，BYL719对耐受胃癌细胞SGC-7901的GI50大于10μM。其次，WesternBlot检测结果显示BYL719能够降低敏感和耐受胃癌细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路关键节点蛋白AKT和S6的磷酸化水平。随后我们在NCI-N87与SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤模型中评价BYL719的抗肿瘤活性，结果显示BYL719能够剂量依赖性地抑制敏感胃癌细胞NCI-N87移植瘤的生长。而SGC-7901细胞移植瘤对BYL-719表现为耐受。WesternBlot检测结果进一步显示BYL719长时间作用反馈性上调NCI-N87移植瘤内AKT磷酸化水平，但对SGC-7901移植瘤内AKT与S6磷酸化无影响。综上，PI3Kα抑制剂BYL719能够在细胞和动物水平显著抑制敏感胃癌细胞增殖。为进一步探究介导BYL719药物敏感性的分子机制，我们首先使用siRNA技术分别降低p110α与p110β亚基的表达水平来验证不同胃癌细胞对PI3Kα的依赖性。发现下调p110α能够有效抑制敏感胃癌细胞AGS增殖，而对耐受胃癌细胞SGC-7901的增殖无影响。而降低p110β亚基表达水平后对敏感胃癌细胞和耐受胃癌细胞的增殖均无影响。以此确证了敏感胃癌细胞AGS的增殖依赖PI3Kα。随后，我们使用RNA-seq技术分析BYL719对敏感胃癌细胞和耐受胃癌细胞转录组的作用差异，发现敏感胃癌细胞NCI-N87内PIK3IP1显著上调。qRT-PCR和WesternBlot检测结果进一步确证BYL719能够上调敏感胃癌细胞AGS和NCI-N87内IK3IP1转录和表达水平，而在耐受胃癌细胞内无此现象。为进一步研究PIK3IP1在BYL719胃癌细胞增殖抑制活性中发挥的作用，我们使用shRNA下调胃癌细胞内PIK3IP1表达水平后，发现IK3IP1表达下降能够部分拮抗BYL719对AGS细胞的增殖抑制作用。这些结果表明PIK3IP1上调介导不同胃癌细胞对BYL719的敏感性。综上所述，我们发现BYL719可以在细胞和动物水平显著抑制部分胃癌细胞增殖。同时，本课题首次发现PIK3IP1上调介导不同胃癌细胞对BYL719的敏感性。这些发现为靶向PI3Kα治疗胃癌提供了有价值的理论和实验依据，具有重要意义。收起

关键词 : 胃癌 PI3K&alpha 抑制剂 PI3K/AKT/mTOR信号通路 PIK3IP1 药物敏感性

7. PI3K抑制剂YY-20394治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的体外探索性研究

[学位论文] 黄玉洁广西医科大学 2021年硕士导师: 岑洪共98页

摘要 : 目的探讨PI3K抑制剂YY-20394对弥漫大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeBcelllymPhoma,DLBCL)是否具有抗肿瘤效应，对于不同细胞起源的DLBCL其作用是否有差异，并进一步探讨YY-20394的作用机制，为临床YY-20394治疗DLBCL提供理论依据。方法 1、采用... 展开目的探讨PI3K抑制剂YY-20394对弥漫大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeBcelllymPhoma,DLBCL)是否具有抗肿瘤效应，对于不同细胞起源的DLBCL其作用是否有差异，并进一步探讨YY-20394的作用机制，为临床YY-20394治疗DLBCL提供理论依据。方法 1、采用CCK8试剂盒检测YY-20394对SUDHL-4细胞和U2932细胞增殖抑制的影响；绘制细胞生长曲线，并计算出24h药物的IC25、IC50、IC75。 2、采用流式细胞术检测YY-20394对SUDHL-4细胞和U2932细胞凋亡的影响。 3、采用高通量RNA测序技术(RNA-Seq)对细胞进行转录组表达定量，进行细胞基因表达差异分析，探讨YY-20394对DLBCL细胞基因表达的影响。 4、对差异基因进行KEGG信号通路富集分析和GO富集分析，探究YY-20394对DLBCL细胞生物学过程的影响。 5、对细胞基因表达数据进行肿瘤相关信号通路GSEA富集分析，进一步探究YY-20394对DLBCL细胞中的肿瘤相关信号通路活化水平的影响。结果 1、不同浓度YY-20394(0.875，1.75，3.5，7，14μmol/L)作用于SUDHL-4细胞24h后的细胞增殖抑制率分别为(29.19±0.75)%、(42.99±2.51)%、(52.37±2.98)%、(62.56±2.51)%、(72.72±2.53)%；48h的细胞增殖抑制率分别是(42.33±3.21)%、(54.55±4.01)%、(73.71±3.86)%、(82.83±3.32)%、(90.33±1.53)%；细胞增殖抑制剂率随着药物浓度增高和作用时间延长而增加，差异有统计学意义，P＜0.05。计算出药物24h的IC25、IC50、IC75分别为(0.69±0.71)μmol/L、(3.30±0.46)μmol/L、(15.79±2.31)μmol/L。 2、不同浓度YY-20394(0.875，1.75，3.5，7，14μmol/L)作用于U2932细胞，24h后的细胞增殖抑制率分别为(2.33±0.09)%、(2.95±0.15)%，(2.85±0.12)%、(2.52±0.06)%、(3.17±0.20)%；48h的细胞增殖抑制率分别为(2.56±0.21)%、(2.96±0.12)%、(2.85±0.55)%、(2.77±0.29)%、(2.93±0.34)%；细胞增殖抑制率不随着药物浓度增高和作用时间延长而增加，差异无统计学意义，P＞0.05。 3、分别使用增殖抑制实验中计算得到的YY-20394在24h的IC25(0.69±0.71)μmol/L、IC50(3.30±0.46)μmol/L、IC75(15.79±2.31)μmol/L浓度作用SUDHL-4细胞24h，细胞凋亡率分别是(6.87±0.37)%、(14.95±0.25)%、(40.58±0.52)%；48h的细胞凋亡率分别是(11.38±0.19)%、(21.84±0.31)%、(47.94±0.26)%。不同浓度(0.69μmol/L、3.30μmol/L、15.79μmol/L)不同作用时间(24h、48h)的细胞凋亡率差异均有统计学意义，P＜0.05。 4、不同浓度的YY-20394(0.875,1.75,3.5,7,14μmol/L)作用U2932细胞24h，细胞凋亡率分别为(4.42±0.15)%、(4.36±0.21)%、(4.31±0.22)%、(4.29±0.11)%、(4.32±0.14)%，各药物浓度组细胞凋亡率与对照组凋亡率(4.28±0.22)%无明显区别，差异无统计学意义，P＞0.05。 5、YY-20394作用SUDHL-4细胞后差异表达的上调基因有259个，下调基因有341个。KEGG富集分析结果显示，YY-20394对SUDHL-4细胞的抗肿瘤作用涉及mTOR信号通路、AMPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、Ras信号通路、NF-κB信号通路、BCR信号通路。GO分析表明PI3K抑制剂通过影响醇类物质合成、mRNA分解、细胞氨基酸代谢、细胞周期和细胞凋亡等重要细胞生物学功能发挥抗肿瘤作用。 6、GESA富集分析结果显示，YY-20394导致SUDHL-4细胞的Hedgehog(Hh)信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、Notch信号通路、PI3K-AKT信号通路、Wnt信号通路的活性下调。 7、YY-20394作用U2932细胞后差异表达的上调基因有12个，下调基因有3个。KEGG富集分析未富集到具有显著水平的信号通路。GO分析表明，细胞组分定位在信号识别颗粒、内质网上；生物过程方面，主要与共翻译蛋白、以内质网为靶点的蛋白质等蛋白质的生物过程相关；在分子功能方面，主要与异源生物跨膜转运蛋白活性、钠转运体活性调节相关。 8、GSEA富集分析结果显示，U2932细胞中PI3K-AKT信号通路活化水平显著低于SUDHL-4细胞。结论 1.PI3K抑制剂YY-20394对GCB-DLBCL细胞SUDHL-4有增殖抑制和诱导凋亡的作用，其效应呈药物剂量和药物作用时间依赖性。 2.YY-20394主要通过抑制PI3K-AKT信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路、Hedgehog信号通路等肿瘤相关信号通路的激活水平对SUDHL-4细胞发挥抗肿瘤作用。 3.YY-20394对ABC-DLBCL细胞U2932无明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用，GSEA富集分析结果显示U2932细胞中PI3K-AKT信号通路激活水平显著低于SUDHL-4细胞。收起

关键词 : 弥漫大B细胞淋巴瘤 PI3K抑制剂 YY-20394 PI3K-AKT信号通路 RNA-seq

8. 一种新型的PI3Kα/mTOR双抑制剂PI-103的抗肿瘤活性研究

[学位论文] 邹祖全浙江大学 2009年博士导师: 李铎;张晓宏共121页

摘要 : 恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，其中肺癌是死亡率和发病率都居于第一位的恶性肿瘤。结肠癌和原发性肝癌也是常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率也都居于恶性肿瘤的前列。目前对于恶性肿瘤的治疗方法还是传统的手术、化疗和放疗，但由于传统的肿... 展开恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，其中肺癌是死亡率和发病率都居于第一位的恶性肿瘤。结肠癌和原发性肝癌也是常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率也都居于恶性肿瘤的前列。目前对于恶性肿瘤的治疗方法还是传统的手术、化疗和放疗，但由于传统的肿瘤治疗方法无靶向特异性，在杀死肿瘤细胞的同时往往也会导致正常组织的损伤，从而有很强的副作用。随着肿瘤分子生物学的发展，针对恶性肿瘤的分子事件的靶向治疗越来越受到人们的重视。靶向治疗以及复合疗法将为恶性肿瘤的治疗开辟新的治疗途径。近年来的研究发现，P13K/Akt/mTOR和Ras/Erk信号通路在肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移中起关键作用，阻断细胞内相应的信号通路能抑制肿瘤细胞生长甚至促进肿瘤细胞凋亡。PI—103是由加州大学旧金山分校的研究人员合成的一种PI3Kα/mTOR抑制双靶点抑制剂， U0126是MEK激酶的抑制剂，两种抑制剂目前都处于细胞实验阶段，还没有用于临床肿瘤治疗。其中PI—103购自德国Merck公司，U0126购自Sigma公司。本文研究了PI—103单用以及和MEK抑制剂U0126、化疗药物紫杉醇和多不饱和脂肪酸DHA联用在非小细胞肺癌、肝癌和结肠癌中的抗癌效果。结果如下： 1．研究发现在非小细胞肺癌A549细胞和H460细胞中，双抑制剂PI—103有显著的抗癌活性。PI—103在PIK3CA基因(该基因编码P13K蛋白的催化单元p110α)突变的H460细胞有更明显的抗肿瘤作用。在A549和H460细胞中，PI—103和MEK抑制剂U0126联用其药物联用指数CI＜1，表明这两种药物有协同诱导细胞生长抑制的作用。PI—103和U0126协同诱导细胞生长抑制作用主要是通过阻断细胞内P13K/Akt/mTOR和Ras/Erk通路，而且PI—103阻断了因雷帕霉素抑制mTOR而导致的Akt活化。研究发现PI3K/Akt/mTOR和Ras/Erk通路会共同作用于mTOR激酶。而且发现PI—103和U0126联用能同时抑制核糖体蛋白s6和真核起始因子4B(eIF4B)的磷酸化，从而抑制翻译复合物的组装和翻译起始，最终协同诱导细胞生长抑制，解释了为什么PI—103和U0126能协同诱导细胞的生长抑制。 2．在A549细胞和H460细胞中，PI—103诱导了G0/G1期细胞周期停滞，和在A549细胞中相比，PI—103在H460细胞中诱导更明显的细胞周期停滞。PI—103和U0126联用协同诱导了G0/G1期细胞周期停滞。PI—103和U0126联用协同诱导的G0/G1期细胞周期停滞与细胞内G0/G1期相关周期调节蛋白改变有关，如细胞周期激酶抑制因子p21和p27上调，以及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin El下调。 3．PI—103不仅在A549和H460细胞中协同加强了紫杉醇的细胞生长抑制作用，而且也协同加强了紫杉醇诱导的细胞凋亡。PI—103和紫杉醇联用诱导的细胞凋亡与细胞内凋亡蛋白协同改变有关，紫杉醇和PI—103联用和单用相比，肿瘤抑制因子p53和促凋亡蛋白Bad显著上调，抗凋亡蛋白Bcl—2显著下调。这些凋亡相关蛋白的改变诱发了线粒体凋亡相关途径，从而导致细胞凋亡。PI—103作为第一种合成的P13Kα/mTOR双抑制剂，其单用或者与U0126、紫杉醇联用都在非小细胞肺癌细胞A549和H460中显示了明显的抗癌活性。表明了复合治疗是一种有效的肿瘤治疗策略。我们的研究为吉非替尼抗性的非小细胞肺癌提供了一种崭新的治疗方案。 4．同时我们也研究了PI—103在结肠癌细胞系CaCO2和肝癌细胞系HepG2中的抗癌效果，发现PI—103单用也能明显地抑制CaCO2和HepG2细胞的生长。而且PI—103和U0126联用也能协同诱导细胞生长抑制。在HepG2细胞中，PI—103和U0126也协同诱导了G0/G1期细胞周期停滞。PI—103同样能协同加强化疗药物紫杉醇诱导的细胞凋亡作用。也说明PI—103在结肠癌和肝癌中，是一种潜在的靶向治疗药物。我们的研究也同样为结肠癌和肝癌的临床治疗提供了潜在的治疗方案。 5．DHA的抗癌活性与脂质过氧化有关，脂质过氧化产物对细胞有毒性从而抑制肿瘤细胞生长。另一方面DHA发生脂质过氧化因而减少了膜上DHA的水平，导致膜上磷脂酰丝氨酸减少，抑制了细胞内PI3K/Akt信号通路转导，从而抑制肿瘤细胞生长。血清能明显拮抗DHA的抗癌作用，10％的血清下，DHA反而促进肿瘤细胞生长，可能是血清中的生长因子或者牛血清白蛋白阻碍了膜上富集的DHA发生脂质过氧化反应，从而促进了细胞存活通路PI3K/Akt的信号转导。PI—103通过阻断磷脂酰丝氨酸介导的PI3K/Akt信号传导，有效地拮抗了DHA在正常培养下对A549细胞的生长促进作用。我们的研究进一步阐明了DHA的抗癌机制，而且为DHA作为一种辅助抗癌药物的研发具有一定的指导意义。收起

关键词 : PI-103抑制剂信号通路 PI3K&alpha mTOR 细胞凋亡抗肿瘤活性

9. PI3K抑制剂ZSTK474对乳腺癌细胞MCF-7的作用及分子机理

[学位论文] 王耀晨天津医科大学 2016年硕士导师: 孔德新共69页

摘要 : 目的： ZSTK474是一种泛PI3K抑制剂，可抑制Ⅰ型PI3K的四种不同亚型。在前期实验中发现，ZSTK474对39种人体癌细胞系均表现出较好的抗肿瘤活性。本文深入研究了其诱导人体乳腺癌MCF-7细胞周期阻滞和自噬等的活性及作用机理，同时还考察了ZSTK474... 展开目的： ZSTK474是一种泛PI3K抑制剂，可抑制Ⅰ型PI3K的四种不同亚型。在前期实验中发现，ZSTK474对39种人体癌细胞系均表现出较好的抗肿瘤活性。本文深入研究了其诱导人体乳腺癌MCF-7细胞周期阻滞和自噬等的活性及作用机理，同时还考察了ZSTK474所诱导的自噬对其抗肿瘤作用的影响，以期为临床研究提供理论依据与指导。方法： 1.采用MTT法检测不同浓度ZSTK474对MCF-7细胞增殖的影响。 2.采用流式细胞术分析ZSTK474对细胞周期和凋亡的影响。 3.采用MDC染色法考察ZSTK474对细胞自噬体形成的影响。 4.采用透射电镜观察ZSTK474作用后MCF-7细胞内所形成自噬体的微观形态结构。 5.采用mRFP-GFP-LC3质粒转染MCF-7细胞，观察ZSTK474对自噬潮的影响。 6.采用Western Blot方法检测ZSTK474对周期相关蛋白p27、cyclin D1、pRb、p-GSK-3β水平的影响、对自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、SQSTM1/p62表达水平的影响以及对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子磷酸化水平等的影响。 7.通过MTT法检测应用自噬抑制剂3-MA、CQ抑制自噬后，ZSTK474抗肿瘤活性的变化。结果： 1. ZSTK474能够抑制MCF-7细胞的生长增殖，48小时的IC50为1.08μM，且抑制作用呈剂量依赖性；流式细胞仪分析显示ZSTK474将MCF-7细胞周期阻滞在G1期，但无诱导MCF-7细胞凋亡的作用。 2. MDC染色结果表明ZSTK474作用后MCF-7胞质中出现亮绿色荧光囊泡；电镜下观察到细胞内形成了双层膜结构的自噬体， mRFP-GFP-LC3质粒转染MCF-7细胞后ZSTK474诱导自噬潮的发生。由此可推断出ZSTK474具有诱导MCF-7细胞发生自噬的作用。 3.ZSTK474可增加乳腺癌细胞中周期相关蛋白p27的表达水平，降低cyclin D1的表达水平，降低Rb、GSK-3β的磷酸化水平。 4. ZSTK474可增加自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Atg5的水平、降低SQSTM1/p62的表达，并且ZSTK474可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中PDK-1、Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平，但对Akt的表达没有影响。 5.利用自噬抑制剂3-MA和CQ阻断自噬作用后，ZSTK474对MCF-7细胞抑制作用减弱。结论： 1. PI3K抑制剂ZSTK474剂量依赖性抑制人体乳腺癌细胞MCF-7的生长增殖，并显示较强的抗肿瘤活性。 2. ZSTK474诱导MCF-7细胞周期阻滞在G1期，其诱导周期阻滞的机制可能与调控周期相关蛋白p27、cyclin D1、pRb等有关，同时与下调GSK-3β的磷酸化水平有关。ZSTK474无明显的诱导凋亡作用。 3. ZSTK474通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路引起细胞发生自噬，该自噬进一步增强其抑制癌细胞增殖作用。收起

关键词 : 乳腺癌 PI3K抑制剂 MCF-7细胞分子机理

10. 阻断胶质瘤细胞AKT通路对Wnt通路影响的实验研究

[学位论文] 杨旸天津医科大学 2011年硕士导师: 康春生共69页

摘要 : 脑胶质瘤属常见原发性神经系统肿瘤，多呈浸润性生长，手术不易全切，综合疗效差。在国人全身肿瘤中，恶性胶质瘤5年死亡率仅次于胰腺癌和肺癌，居第三位，5年生存率不足5％。虽然我们对于胶质瘤尝试进行了各种综合治疗，但是效果仍不理想。这是由于肿... 展开脑胶质瘤属常见原发性神经系统肿瘤，多呈浸润性生长，手术不易全切，综合疗效差。在国人全身肿瘤中，恶性胶质瘤5年死亡率仅次于胰腺癌和肺癌，居第三位，5年生存率不足5％。虽然我们对于胶质瘤尝试进行了各种综合治疗，但是效果仍不理想。这是由于肿瘤是一种多因素影响、多基因参与、多阶段形成的复杂疾病。正因为如此，研究其发病机理、探索有效治疗方法一直是神经外科重要课题之一。我们应当认识到胶质瘤的发生发展与其他肿瘤一样，同样是涉及细胞周期调控、发育与分化、信号传导、凋亡与死亡和细胞代谢等等多种机制异常的病理过程。PI3K-Akt信号转导通路作为细胞内重要信号通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，它与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。作为此通路的第二信使，PI3K的3’磷酸化作用可以使PIP2生成PIP3。PI3K是一个脂质激酶，可以被许多不同的信号所激活，包括生长因子和细胞间的相互作用信号等。PI3K可以激活高度保守的信号传导通路，通过下游许多蛋白激酶，包括Akt/PKB、P70 S6激酶、PDKs(磷脂酰激酶依赖性激酶)等而影响生物体的许多细胞过程。作为一种丝氨酸-苏氨酸激酶，Akt/PKB可以磷酸化许多底物，参与体内许多重要的细胞代谢信号通路。Wnt信号通路是一条十分保守的信号传导通路，从低等生物(如果蝇)至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性。Wnt基因属于原癌基因，产物为分泌型糖蛋白，含一段信号肽以及23或24个位置保守的半胱氨酸残基。通常认为，经典的Wnt信号传导通路的组成成分主要包括：配体(Wnt家族分子)、跨膜受体(Fr izzled家族分子和LRP-5/6)、胞浆调节蛋白(Dsh、APC、Axin、GSK-3β、β-catenin等)以及核内转录因子(TCF/LEF1家族)等。当Wnt分子与跨膜受体结合后，通过受体与Dsh的相互作用以及一系列胞质蛋白的相互作用使β-catenin在胞浆内累积并转位入核，与核内转录因子TCF/LEF1共同作用，激活下游靶基因的转录，引发生物学效应。越来越多的研究结果表明Wnt信号通路不仅在胚胎发育过程中具有至关重要的作用，而且还与众多不同的组织干细胞自我更新和分化，以及多种人类疾病的发生发展密切相关。有文献报道，Akt/PI3K和Wnt信号通路在不同动物或不同器官的细胞增殖、发育及成瘤等多个过程都存在不同程度的相互影响过程。目前尚无通过特异性药物来阻断胶质瘤细胞内PI3K/Akt通路后对Wnt通路进行研究的报道。本研究对胶质瘤中PI3K/Akt对Wnt通路的作用进行了分析。本研究分为三个部分：第一部分：使用特异性Akt阻断剂LY294002对LN229与U251胶质瘤细胞进行处理，采用Western blot对Akt、p-Akt表达的变化进行验证，并对LY294002的使用浓度进行了梯度实验，寻找最佳抑制浓度。通过流式细胞仪、MTT实验、Transwell体外侵袭实验对胶质瘤细胞周期、增殖、侵袭的影响进行检测。第二部分：设计序列合成siRNA直接对胶质瘤细胞β-catenin表达进行敲低，通过Western blot对Wnt通路成员的蛋白表达变化进行测定，包括：β-catenin、CyclinD1、Fra-1、c-Myc。将结果与LY294002药物阻断Akt通路进行比对分析。并采用TOP/FOP flash系统来检测TCF的转录表达水平。通过免疫荧光对β-catenin完成细胞定位分析。第三部分：构建LN229裸鼠皮下荷瘤模型，进行LY294002的体内治疗，观察肿瘤生长情况并绘制生长曲线，将肿瘤组织进行免疫组化染色，对前面体外实验部分进行进一步的补充验证。本研究得出如下结论：⑴LY294002可阻断PI3K/Akt通路，并降低U251和LN229细胞增殖和侵袭能力。⑵肿瘤细胞增殖能力的的降低与Wnt/β-catenin通路一些成员表达降低有关，包括Fra-1，c-Myc和Cyclin D1。⑶在恶性胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin通路受到了PI3K/Akt通路的调节。⑷体内成瘤实验表明LY294002可以使LN229异体移植肿瘤的生长速度减慢。收起

关键词 : 脑胶质瘤生物疗法细胞调控 PI3K抑制剂