摘要: 蒿甲醚（AM）在水中几乎不溶，现有的制剂主要有油针、片剂、胶丸、胶囊等。蒿甲醚的口服制剂吸收快但不完全，前期研究表明多剂量口服给药后药物在体内的总体清除率增大、血药浓度下降，导致疟疾的复发率较高，研究表明可能是药物的自身诱导代谢所致... 展开 蒿甲醚（AM）在水中几乎不溶，现有的制剂主要有油针、片剂、胶丸、胶囊等。蒿甲醚的口服制剂吸收快但不完全，前期研究表明多剂量口服给药后药物在体内的总体清除率增大、血药浓度下降，导致疟疾的复发率较高，研究表明可能是药物的自身诱导代谢所致，而静脉注射给药没有自身诱导代谢现象。其油针用于恶性疟的急救时通过肌内注射给药，虽然可能也不存在自身诱导作用，但该类药物主要作用于红内期的疟原虫，通过静脉注射给药更有利于药物快速发挥作用。本研究使用微乳法和高压乳匀法分别制备了蒿甲醚的脂质纳米粒（AM-NLC），所得NLC粒径小，稳定性好，体外释放表现出缓释特征，且无明显的体外溶血效应，通过大鼠尾静脉注射及腹腔注射给药后血药浓度平稳，有缓释作用。 一．蒿甲醚脂质纳米粒的处方前研究 建立了高效液相色谱法（HPLC）测定蒿甲醚含量的方法。以Agilent-C18柱（150×4.6mm，5μm）为分析柱，以甲醇-水-冰醋酸（85.4:37.6:1，v/v/v，pH3.4）为流动相，检测波长为230nm，柱温30℃，流速为1.0mL·min-1。该方法的线性范围为100～900μg·mL-1。 使用摇瓶法测定蒿甲醚在正辛醇-水/缓冲体系中的表观油水分配系数。在37℃下，蒿甲醚在正辛醇-水及pH5、pH6.8、pH7.4、pH8的磷酸盐缓冲液中的表观油水分配系数（lgP）分别为：2.2、1.6、1.5、2.6、2.2。结果表明，蒿甲醚的脂溶性较大。pH在一定范围内变化时，蒿甲醚的表观油水分配系数不同，但变化幅度不大。 采用高效液相色谱法（HPLC）法测定蒿甲醚在各种介质如注射用油、乳化剂及助乳化剂中的平衡溶解度。在37℃时，蒿甲醚在注射用油中链甘油三酯（MCT)、橄榄油、大豆油、蓖麻油及肉豆蔻酸异丙酯（IPM)中的平衡溶解度依次为：306.9，246.6，222.8，265.0，273.3mg·mL-1；在乳化剂(6mg·ml-1的胶束溶液)泊洛沙姆188（F68）、壬基酚聚氧乙烯醚（OP乳化剂）、聚山梨酯80、大豆卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40)中的平衡溶解度依次为：0.1，1.4，0.5，0.6，0.6mg·mL-1。在助乳化剂无水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、异丙醇、正丁醇中的平衡溶解度依次为：177.3，37.0，3.4，204.1，303.1mg·mL-1。结果表明蒿甲醚在注射用油MCT、OP乳化剂、助乳化剂正丁醇中的平衡溶解度比较大。 二．蒿甲醚脂质纳米粒的处方筛选及优化 本文使用微乳法(方法1）和高压乳匀法（方法2）两种方法制备蒿甲醚脂质纳米粒（AM-NLC），并将高压乳匀法制得的NLC进行冷冻干燥得到其冻干粉，以增加制剂的储存稳定性。 在微乳法制备AM-NLC时，依据处方前研究的结果选择三种备用的油、乳化剂、助乳化剂，并以单硬脂酸甘油酯（GMS）为固态脂质，在一定的相比下制备空白NLC并绘制伪三元相图，依据相图中微乳区面积的大小进行处方筛选。结果确定以GMS为固态脂质、MCT为液态脂质（油）、RH40为乳化剂、乙醇为助乳化剂、去离子水为水相来制备NLC，并使用正交设计，以粒径和包封率两个指标对处方进行了优化。 高压乳匀法制备AM-NLC时，从辅料的安全性出发，并结合处方前研究结果，确定以GMS为固态脂质、MCT为液态脂质、RH40及F68为乳化剂、去离子水为水相来制备NLC。通过单因素试验考察了制备工艺（温度、剪切速度、乳匀压力及循环次数、乳化剂加入方式等）和处方因素（脂质含量、乳化剂含量、两种乳化剂的比例、AM的含量等）对NLC粒径的影响，并使用正交设计，以粒径和包封率为指标对处方进行优化。将优化后的NLC进行冷冻干燥，使用复合冻干保护剂蔗糖和甘露醇，得到外观良好、再分散性好的冻干粉。 三．蒿甲醚脂质纳米粒理化性质的测定 由微乳法和高压乳匀法制备的AM-NLC均为淡蓝色的半透明液体，粒径小且分布均匀。通过透射电镜扫描，得到NLC的粒径分布特征。通过超滤法测定优化NLC的包封率，使用激光粒度仪对其粒径及zeta电位进行测定。微乳法制备的AM-NLC包封率为92.8%，平均粒径为30.0nm，zeta电位为-39.0mv；高压乳匀法制备的AM-NLC包封率为83.8%，平均粒径为61.5nm；高压乳匀法制备的NLC冻干粉的包封率为72.2%，平均粒径为225.1nm。 四．蒿甲醚脂质纳米粒的体外释放试验及体外溶血试验 本文中采用透析袋扩散法考察AM-NLC的体外释放特征，透析袋的分子量阈值为10kDa。由于蒿甲醚在水中的溶解度较小，难以测定，所以以含20%乙醇的磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4）作为释放介质，并使用乙醚来萃取释放液中的蒿甲醚进行测定，低、中、高浓度下的萃取率均大于95%。微乳法制备的AM-NLC在48h内的累积释放率为80.6%，高压乳匀法制备的AM-NLC冻干粉在48h内的累积释放率为83.9%。由释放曲线可以看出，两种方法制备的AM-NLC在前4h内均有轻微的突释现象，累积释放率分别为27.2%，36.4%。之后随着脂质的不断溶蚀，呈现出缓释特征。 体外溶血试验考察NLC对家兔2%红细胞悬液的溶血作用，采用目视法进行检测。结果表明两种方法制备的AM-NLC在2h内均无明显的溶血作用，可供静脉注射使用。 五．蒿甲醚脂质纳米粒的初步药动学研究 建立了液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定大鼠血浆中蒿甲醚（Artemether,AM）浓度的方法。以青蒿素（Artemisinin,ART）为内标，以乙腈-10mmol·L-1醋酸铵（含0.1%甲酸）（85:15，v/v）为流动相，流速为0.6mL·min-1，以Agilent-C18（50×4.6mm,1.8μm）为色谱柱，采用电喷雾电离源（ESI），以多反应监测方式进行阳离子检测，用于定量分析的离子反应分别为m/z316.4→163.0（AM）和m/z300.8→209.0（ART）。该方法的线性范围为5.0-500.0ng?mL-1，定量下限为5.0ng?mL-1。 雄性SD大鼠30只，每组6只，随机分为5组，其中三组以尾静脉注射方式分别给与AM溶液即对照组、微乳法制备的AM-NLC及高压乳匀法制备的AM-NLC，其余两组以腹腔注射方式分别给予微乳法制备的AM-NLC及高压乳匀法制备的AM-NLC，各组给药剂量均为15mg?kg-1，在不同时间点从大鼠眼眶后静脉丛采集血浆样品，以LC-MS/MS法测定血浆药物浓度并计算主要的药动学参数，腹腔注射组的达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为实测值。静脉注射组的结果为：AM溶液组的t1/2为（2.3±1.1）h，AUC0-t为（885.4±295.3）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（919.5±314.3）h·ng·mL-1，CL为（4.4±1.4）L·h-1，V为（11±2.9）L；微乳法制备的AM-NLC组的t1/2为（7.7±2.4）h，AUC0-t为（1391.2±234.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1492.2±304.2）h·ng·mL-1，CL为（2.2±0.3）L·h-1，V为（12±2.4）L；高压乳匀法制备的AM-NLC组的t1/2为（9.5±2.2）h，AUC0-t为（1886.8±555.0）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（2127.5±717.9）h·ng·mL-1，CL为（2.3±0.8）L·h-1，V为（15±6.1）L。腹腔注射组的结果为：微乳法制备的AM-NLC组的Cmax为（290.6±58.6）ng?mL-1，Tmax为（0.8±0.3）h，t1/2为（9.2±0.8）h，AUC0-t为（1158.1±349.9）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1252.2±388.7）h·ng·mL-1，CL/F为（3.0±0.8）L·h-1，V/F为（15±2.6）L；高压乳匀法制备的AM-NLC组的Cmax为（341.8±53.2）ng?mL-1，Tmax为（0.7±0.3）h，t1/2为（9.6±4.1）h，AUC0-t为（1599.8±150.6）h·ng·mL-1，AUC0-∞为（1636.8±237.9）h·ng·mL-1，CL/F为（2.2±0.6）L·h-1，V/F为（13±3.8）L。 结果表明，与对照组相比，两种方法制备的AM-NLC通过静脉注射和腹腔注射给药后，AM在大鼠体内的半衰期均显著延长，且AUC增大，血药浓度相对平稳，这表明，将AM制成NLC后在大鼠体内均有缓释效果，延长了血中循环时间，提高了血药浓度整体水平。 收起