摘要:
目的： 合成双氢青蒿素二聚体（以下简称二聚体），确定其绝对构型；考察二聚体在体外各环境中的稳定性及主要降解产物；测定二聚体的平衡溶解度和表观油水分配系数；考察二聚体对恶性疟原虫3D7株的体外抗疟活性；建立约氏疟鼠模型，考察二聚体对约...
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目的： 合成双氢青蒿素二聚体（以下简称二聚体），确定其绝对构型；考察二聚体在体外各环境中的稳定性及主要降解产物；测定二聚体的平衡溶解度和表观油水分配系数；考察二聚体对恶性疟原虫3D7株的体外抗疟活性；建立约氏疟鼠模型，考察二聚体对约氏鼠疟的体内抗疟活性；初步研究二聚体在大鼠体内的可能代谢产物及主要代谢途径。 方法： 1.二聚体的合成及理化表征 以双氢青蒿素(Dihydroartemisinin， DHA）为原料药，三氟化硼乙醚（BF3 Et3O）为催化剂，通过醚化反应合成二聚体。经高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定，采用面积归一化法计算其纯度。并以高分辨质谱（HR-MS）法、核磁共振氢谱（1H-NMR）法对其结构进行鉴定。在室温条件下用石油醚对其重结晶后，培养单晶体，采用单晶X射线衍射（SXRD）确定其绝对构型。建立LC-MS/MS法，考察二聚体在pH1.2～8.0缓冲液、血浆和培养基中（37℃孵育24 h）的稳定性；测定二聚体在pH4.0～8.0缓冲液中的平衡溶解度和在正辛醇-水/磷酸缓冲盐中的表观油水分配系数。此外，采用高效液相-高分辨质谱联用（HPLC-HRMS）法鉴定二聚体在pH1.2缓冲液中的降解产物。 2.二聚体的体外抗疟活性考察 以恶性疟原虫3D7株为模型，经山梨醇同步化法同步疟原虫生长周期，以DHA为阳性对照组，采用SYBR GreenⅠ法测定不同浓度的二聚体对疟原虫增殖的抑制情况。并以 IC50（50%抑制浓度）和 IC95（95%抑制浓度）评价药物的体外抗疟活性。 3.二聚体的体内药效学研究 以约氏疟鼠为模型，采用皮尔逊四天抑制法分别经灌胃、尾静脉注射途径给予不同剂量的二聚体，以DHA为阳性对照组。停药1 d后，取血、镜检，计算其感染率、抑制率、ED50（50%有效剂量）、ED90（90%有效剂量）和转阴率。停药1周后，再次取血、镜检，计算并比较各剂量组间感染率。停药一个月，比较各组间的复燃率、治愈率、死亡率、平均存活天数，并观察存活鼠的肝脾组织病理变化。 4.二聚体的大鼠体内代谢初步研究 采用HPLC-HRMSn技术对二聚体和DHA的体内代谢进行初步研究。通过对比二聚体组与空白组、DHA对照组的大鼠体内代谢情况的异同，初步推断二聚体在体内的可能代谢产物和代谢途径，并与DHA的体内代谢进行比对。 结果： 1.二聚体的合成及理化表征 HR-MS、1H-NMR图谱解析表明合成的二聚体结构正确无误，其收率约为75%，熔点为160.5℃～161℃，且其纯度大于98%。SXRD分析表明合成产物为非对称型二聚体，即为 a dimer ofα- andβ-DHA: bis(3,6,9-trimethyl-3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。二聚体 LC-MS/MS含量测定方法的精密度小于5.58%；准确度为98.54%～105.70%；基质效应和提取回收率均为96.21%～104.11%。二聚体在各环境中孵育24 h后，剩余浓度百分比分别为69.94%±3.37%（血浆）、85.54%±1.40%（培养基）、76.95%±0.61%（pH4.0）、76.86%±1.75%（pH6.8）、80.94%±0.65%（pH7.4）、85.75%±0.68%（pH8.0）。二聚体在pH1.2缓冲液中反应6 h，几乎完全降解，并鉴定到主要降解产物为α-DHA和β-DHA。二聚体的平衡溶解度分别为（54.02±3.36）μg/ml（纯化水）、（128.79±9.31）μg/ml（pH4.0）、（230.33±17.79）μg/ml（pH5.0）、（313.76±17.32）μg/ml（pH6.8）、（425.94±35.07）μg/ml（pH7.4）、（466.06±21.76）μg/ml（pH8.0），表观油水分配系数lgP分别为1.55±0.19（纯化水）、1.12±0.05（pH4.0）、1.41±0.28（pH5.0）、1.48±0.20（pH6.8）、1.36±0.02（pH7.4）、1.22±0.26（pH8.0）。 2.二聚体的体外抗疟活性 给药组对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用随浓度的增加而增强，呈浓度依赖性。二聚体的IC50值（（0.51±0.12）nmol/L）明显小于DHA的IC50值（（1.81±0.70）nmol/L）（P<0.001），二聚体的IC95值为（4.72±1.86）nmol/L，也小于DHA的IC95值（（6.40±2.05）nmol/L）（P<0.05）。 3.二聚体的体内药效学 灌胃给药，停药1 d后，测得的二聚体ED50值（（0.44±0.03）mg/kg/d）和ED90值（（1.95±0.10）mg/kg/d）均显著小于DHA的ED50值（（0.76±0.03） mg/kg/d）和ED90值（（4.15±0.32）mg/kg/d）（P<0.001）。尾静脉给药后，二聚体的ED50（（0.18±0.03）mg/kg/d）和ED90（（0.83±0.08）mg/kg/d）分别显著低于DHA的ED50（（0.32±0.03）mg/kg/d）和ED90（（1.87±0.11）mg/kg/d）（P<0.001）。两种途径给药后，给药组对约氏鼠疟的抑制作用均呈剂量依赖性。除正常空白（不感染）组外，其余各组小鼠的体重都呈降低趋势，但给药剂量越大，体重降低量越少。灌胃给药（7.80、15.6 mg/kg/d）后，二聚体组的转阴率（75%、100%）明显高于DHA组（37.5%、62.5%）（P<0.001）。尾静脉注射给药（3.0、6.0 mg/kg/d）后，二聚体组的转阴率（62.5%、100%）显著高于DHA组（37.5%、50%）（P<0.001）。停药一周，给予相同剂量的二聚体组小鼠的感染率显著低于DHA组（P<0.001）。 停药一个月，灌胃二聚体（15.6 mg/kg/d）组小鼠的复燃率为50%，存活率为75%。尾静脉二聚体（3.0、6.0 mg/kg/d）组小鼠的复燃率分别为60%、25%，存活率分别为62.5%、100%。灌胃和尾静脉DHA组小鼠的复燃率均为100%，存活率为0。所有存活下来的小鼠体重均显著增加，且无明显肝脾病变现象。4.二聚体的大鼠体内代谢初步研究 在灌胃DHA后的大鼠体内检测到18种可能代谢产物，包括11种Ⅰ相代谢产物和7种Ⅱ相代谢产物，Ⅰ相代谢物主要为DHA过氧桥断裂为单氧桥、羟基化和羰基化代谢产物，Ⅱ相代谢产物则为Ⅰ相代谢物的葡萄糖醛酸结合型代谢物。代谢产物主要出现在尿液和胆汁中。在给予二聚体后的大鼠体内检测到27种可能产物，其中包括DHA和11种DHA相关代谢产物，其余15种可能产物的代谢途径主要为过氧桥断裂为单氧桥、羟基化、羟基化脱水等，产物主要经粪便、尿液、胆汁排出。 结论： 1、成功合成非对称型DHA二聚体，化学名称为a dimer ofα-andβ-DHA:bis(3,6,9-trimethyl-3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。该化合物在水中溶解度较小，在pH4.0～8.0范围内，二聚体较稳定，且其平衡溶解度和稳定性均随pH的增大而增加，表观油水分配系数呈先增大（pH4.0～6.8）后减小（pH6.8～8.0）的趋势。二聚体在培养基中稳定，但在血浆中易降解，在pH1.2的缓冲液中极其不稳定，迅速降解成α-DHA和β-DHA。 2、体外药效学研究结果显示，给药组对恶性疟原虫3D7增殖的抑制作用随浓度的增加而增强。二聚体的IC50和IC95值均明显低于DHA，可知二聚体的抗疟活性优于DHA。 3、疟鼠体内药效学研究结果显示，两种途径给药后，各给药组对约氏鼠疟的抑制作用随剂量的增加而增强。二聚体的抗疟活性明显好于DHA。停药一个月，二聚体的复燃率低于DHA，转阴率和治愈率均高于DHA。 4、大鼠体内代谢初步研究结果显示，DHA在大鼠体内检测到的代谢产物、代谢途径与文献报道相符。二聚体除代谢成DHA及11种其相关代谢产物外，部分代谢成15种其他的相关可能产物。代谢产物主要为过氧桥断裂为单氧桥、羰基化、羟基化、羟基化脱水产物和葡萄糖醛酸结合型代谢物，最终主要经粪便、尿液、胆汁排出。 本课题为国家自然科学基金“基于代谢机制靶向红细胞内疟原虫的青蒿素类药物纳米递药系统研究（编号：81373364）”。
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