摘要:
目的: 青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物，然而随着广泛使用，在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株，导致其药效下降。有研究发现，恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类药...
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目的: 青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物，然而随着广泛使用，在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株，导致其药效下降。有研究发现，恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类药物耐药直接相关。PfK13蛋白突变导致PfK13蛋白与疟原虫磷脂酰肌醇3-激酶(PfPI3K)结合力下降，PfPI3K泛素化降解减少，PfPI3K水平升高继而介导磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)过量。PfPI3K 与 PI3P抑制了血红蛋白向疟原虫的转运，使疟原虫环状体期发育停滞，对ARTs敏感性下降,另外，血红蛋白内吞减少使得亚铁血红素含量降低，ARTs活化受阻，导致其耐药性的出现，疗效下降。 PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源，尤其与Ⅲ型PI3K的结构更为相似，3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)作为一种广谱的PI3K抑制剂，可通过抑制P13K/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，下调PI3K的表达，鉴于PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源，利用3-MA的抑制作用有望逆转ARTs的耐药性。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)作为广泛使用的抗疟一线药物，同样受到耐药性困扰,为了解决恶性疟原虫对ARTs的耐药性，提高ARTs的抗疟疗效，拟将二者联合用药。首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并对其进行抗性诱导，而后将两者单独给药得到各自ED50并进行联合给药，得到其联合用药指数。二者呈现协同给药,后续拟设计DHA与3-MA前药，由于DHA羟基不易与3-MA氨基反应，但是DHA前药青蒿琥酯(artesunate,AS)有羧基，容易发生酰胺化反应，以AS为原料药，通过与3-MA酰胺化反应得到DHA-3-MA的前药 AS-3-MA(artesunate-3-Methyladenine,AS-3-MA)。 恶性疟原虫在感染红细胞后，会在红细胞膜表面表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP-1), 肝素能够与之特异性结合，为提高后续制剂对恶性疟原虫感染红细胞的靶向性，我们在此利用肝素修饰纳米脂质体以提高其靶向性。首先制备了双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,AMLs)及肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(heparin-modified artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,HAMLs),并对HAMLs进行了处方优化。并考察了 HAMLs制剂学特性、抗吞噬、体外靶向性、长循环等，为其后续用于抗疟治疗提供了基础依据。 方法: 1.DHA与3-MA协同给药评价 首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并通过动物模型对其进行抗性诱导，在诱导到十代后检测抗性指数呈中度抗性。然后构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型，并将DHA与3-MA单独给药得到，各自的ED50值。依据得到的ED值，设置二者以等摩尔比方式给药及等ED50给药两种方式下的给药剂量，二者按照等摩尔比给药时的剂量为:(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg;按照等ED50给药时的剂量分别为:1/4ED50、1/2ED50、ED50、2ED50、4ED50。利用动物模型，根据给药剂量及停药后的抑制率得到二者协同作用指数(combination index,CI)。2.AS-3-MA的合成 以AS与3-MA为原料药，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N''，N''-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)为缩合剂，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)为质子清除剂，通过酰胺化反应合成AS-3-MA。后采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)对其结构进行了鉴定。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性 采用薄膜分散法制备AMLs,以粒径(Size)、多分散指数(PDI)为考察指标,进行单因素优化后进行了响应面优化，得到AMLs较优处方。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)对AMLs进行了表征，然后考察了 AMLs稀释稳定性、血清中物理稳定性、储存稳定性及体外释放。 结果: 1.DHA与3-MA协同抗疟作用 利用诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型，给与DHA与3-MA单独治疗，得到二者的 ED50值，分别为:(2.71±0.06)μmol/kg、(83.61±1.36)μmol/kg。按照等摩尔比方式给药，剂量由低到高(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg,DHA 与 3-MA 对疟鼠的抑制率分别为:35.6％、49.0％、70.0％、86.5％、94.0％,二者的协同作用指数分别为:0.68、0.87、0.85、0.86、0.74,呈现出较弱的协同作用;按照等ED50方式给药，剂量按照1/4ED50、1/2ED50、ED50、2 ED50、4 ED50由低到高，二者联合给药对疟鼠的抑制率分别为:47.1％、60.0％、74.0％、85.3％、94.8％,协同作用指数分别为:0.57、0.73、0.78、0.84、0.58表现出协同作用，为后续试验提供了基础。 2.AS-3-MA的合成 傅里叶红外光谱图中，1720 cm-1的吸收峰表示羰基上的N-H基团的伸缩振动，2928 cm-1处的吸收峰表示酰胺键上的N-H基团的伸缩振动，而1253 cm-1处的吸收峰表示酰胺键上的C-N键的伸缩振动;HR-MS测量得到的精确质量数与理论值的相对误差在一个数量级内;核磁共振氢谱1H-NMR和碳谱13C-NMR的谱图结果与所期望的化合物结构一致。综合表明成功合成了 AS-3-MA。酰胺化反应合成AS-3-MA的产率较低，不足10％,合成工艺有待优化。 3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性 成功建立了 AS-3-MA的HPLC方法，用于AS-3-MA含量测定及体外分析。在8.0～ 600 μg/mL的浓度范围内，AS-3-MA线性良好;其检测限为4 μg/mL,定量限为8 μg/mL;所建立的方法精密度与专属性及回收率均符合方法学要求。 通过单因素优化及响应面优化法，得到脂质体的较优处方，在该处方下制备得到的 AMLsSize 为(75.95±0.78)nm,PDI 为 0.30±0.02,粒径分布较为均匀，Zeta电位为(-21.63±1.59)mV,其绝对值较高，所测得的AMLs包封率为(80±0.03)％,制备的纳米脂质体混悬液显淡蓝色乳光。红外图谱中，AMLs冻干粉末在1720 cm-1有羰基上N-H基团的伸缩振动峰，在2928 cm-1处有酰胺键上N-H的伸缩振动峰，另有mPEG-PLGA、大豆磷脂、胆固醇特征峰，无新的峰形出现，显示脂质体成功制备。在稀释稳定性考察中，将AMLs在室温下利用超纯水稀释数倍后，测定其Size与PDI的变化，发现未发生较大改变，表明其具有较好的稀释稳定性;在血清稳定性试验中，将AMLs与胎牛血清共孵育24 h,于不同时间点测定混悬液吸光度，发现其未发生显著变化，表明AMLs具有较好的血清稳定性;将AMLs在4℃在储存，于第1、3、5、7、9天测定其Size与PDI,发现其未发生显著变化，表明AMLs具有较好的储存稳定性;在体外释放试验中，发现与AS-3-MA溶液相比，AMLs在48 h有44.59％释放，而AS-3-MA溶液则释放了接近75％,表明AMLs有缓慢释药的特性。 结论 1.DHA与3-MA协同作用评价 利用构建的伯氏疟原虫K173抗性虫株疟鼠模型，在单独给药得到各自ED50基础上，设置剂量，采用两种方式给药，以停药第一天的感染率计算得到二者联合给药协同作用指数，发现CI均小于1,二者表现出协同作用。2.AS-3-MA的合成 通过酰胺化反应合成AS-3-MA,并通过FT-IR、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR多种手段对结构进行确证，显示成功合成了该前药。 3.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及质量表征 肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体呈球形，粒径均匀，无团聚现象，具有较好的稀释稳定性，与胎牛血清(37±0.5)℃孵育24h,吸光度未发生明显变化，表明其在血清中具有较好的物理稳定性;在4℃环境下9天的储存时间内，其粒径与PDI未发生显著变化，表明其具有较好的初步储存稳定性体外释放实验中，观察到缓释特性，体外溶血实验中未观察或者检测到溶血现象，符合试验要求。
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