中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王莉石河子大学 2018年硕士导师: 张惠荣共50页

摘要 : 背景和目的：德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长... 展开背景和目的：德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长智能迟滞、认知障碍、上肢畸形、多毛症、特殊面容、心脏瓣膜缺陷等多器官功能异常，严重影响了新生儿及儿童的健康成长，给家庭和社会造成了沉重的负担。其中，该病65%的患儿是由NIPBL、Smc1和Smc3这三个基因突变所导致，NIPBL基因突变是引起常染色体显性遗传性疾病德朗热综合征的主要病因，约60%的患儿由NIPBL基因突变引起。在胎鼠的肢芽发育阶段中，NIPBL基因对位于肢芽ZPA（Zone of Polarizing Activity）区域的Shh（Sonic Hedgehog）基因具有调控作用，影响Shh基因的表达，但具体两个基因之间的交互作用如何以及规律如何，还未可知。本实验，我们利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，在此模型的基础上，探讨Shh基因在胎鼠发育的不同时期的表达情况。方法： NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J,SPF级，购于浙江大学，全部小鼠饲养于石河子大学药学院实验动物中心。实验过程遵照石河子大学动物实验伦理委员会管理条例。本实验，我们首先建立NIPBL-Loxp小鼠模型，然后再利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，然后NIPBL+/-小鼠模型作为亲代鼠，挑选NIPBL+/-小鼠雄性35g左右，雌性30g左右，在晚上20:00点将雌、雄小鼠按2:1合笼，次日早上8点检查雌鼠的阴栓，将阴栓阳性者的雌鼠次日中午作为其胚胎E0.5天。经过相互杂交NIPBL+/-小鼠模型，在孕鼠的E10、E11、E12天，取出孕鼠放在超净台内，用颈部脱臼法处死孕鼠，在严格的无菌操作条件下，取出胎鼠。胎鼠被取出后，分别采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组，和6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作为对照组，然后分离胎鼠的四肢，放入液氮和-80℃冰箱备用；最后采用定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术分别检测实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因的表达情况。结果：用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，NIPBL+/-小鼠相互杂交通过RT-PCR技术鉴定出作为实验组和对照组的胎鼠。其中，实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10、11、12天均有表达，而且实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10天的ΔCt值>E12天的ΔCt值>E11天的ΔCt值（ΔCt值越高，Shh基因的表达水平越低），表明在不同的孕期（E10、11、12天）天数下相比较，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因表达趋势是先升后降，差异有统计学意义(P<0.01)；在相同的孕期(E10、11、12天）天数内，实验组Shh基因的ΔCt值大于对照组ΔCt值，表明实验组胎鼠肢芽内Shh基因的表达水平低于对照组，这种差异也有统计学意义(P<0.01)。结论：在孕鼠的E10、E11、E12天，NIPBL+/-基因剔除的胎鼠抑制其肢芽内Shh基因的表达，说明Shh基因在胎鼠肢芽发育中的特定时期进行表达，有助于人们更好地了解德朗热综合征中骨骼畸形的发病机制。收起

关键词 : 儿童患者德朗热综合征 NIPBL基因 Shh基因肢芽ZPA

2. 鸡胚胸腺和法氏囊发育过程中Shh和Bmp2表达的研究

[学位论文] 吕艳杰山东大学 2005年硕士导师: 陈忠科共64页

摘要 : Sonichedgehog(Shh)是脊椎动物中果蝇体节极性基因Hedgehog(Hh)的同源基因之一，它所编码的分泌性糖蛋白是一类重要的信号传导分予，在胚胎发育和器官形成过程中发挥重要作用。Bonemorphogeneticproteins(Bmps)是TGF-β信号分子超家族的成员，在多种发... 展开 Sonichedgehog(Shh)是脊椎动物中果蝇体节极性基因Hedgehog(Hh)的同源基因之一，它所编码的分泌性糖蛋白是一类重要的信号传导分予，在胚胎发育和器官形成过程中发挥重要作用。Bonemorphogeneticproteins(Bmps)是TGF-β信号分子超家族的成员，在多种发育过程发挥调控功能。胸腺和法氏囊属于中枢免疫器官，而且法氏囊是鸟类所特有的，它们在机体的免疫防御方面发挥重要作用。在多种组织和器官的发生过程中，Shh和Bmp2共同参与上皮细胞与间质细胞之间的相互作用，在器官发生过程中发挥调控功能。近年来对于Shh和Bmp2在胸腺中的研究集中于Shh和Bmp2对人和小鼠胸腺中T淋巴细胞分化的调控作用，而在鸡胚胸腺、法氏囊发育过程中Shh和Bmp2的研究尚未见报道。本试验首先利用RT-PCR的方法获得了鸡的Shh摹因490bp片段，将其克隆入pGEM-Teasy载体。利用重组的含Shh的质粒和已有的含Bmp2基因片段的质粒，分别进行酶切制备成线性化DNA，体外转录制备DIG标己的正义和反义RNA探针。采用切片原位杂交方法，研究Shh和Bmp2在鸡胚胸腺和法氏囊发育过程的时空表达图式。结果表明，在鸡胚胸腺的发育过程中，孵化11天时，Shh主要在被膜下上皮细胞和血管周围的上皮细胞中表达，Bmp2在被膜下上皮细胞和间质中未分化、初分化的淋巴细胞中表达；孵化13天时，Shh在胸腺小叶间被膜下上皮细胞和间质中的网状细胞中表达，Bmp2在胸腺小叶间的上皮细胞、结缔组织的异嗜性粒细胞和胸腺小叶内淋巴细胞样细胞中表达；孵化15天时，Shh在胸腺小叶间网状上皮细胞和间质中的网状细胞中表达，Bmp2在胸腺小叶内中、小淋巴细胞和胸腺小叶间网状上皮细胞中表达；孵化17天时，Shh在胸腺小叶间星型网状上皮细胞和血管周围网状上皮细胞中表达，Bmp2在包绕血管的上皮细胞和皮质内中、小淋巴细胞以及髓质的淋巴细胞中都有表达；孵化20天时，Shh在围绕微血管的星型网状上皮细胞和结缔组织网状细胞中表达，Bmp2在淋巴细胞样细胞、淋巴细胞和胸腺小体周围的网状上皮细胞中表达，在淋巴细胞中的表达较强烈。从孵化11天到20天，Shh在胸腺淋巴细胞中几乎不表达。在法氏囊发育过程中，孵化13天时，Shh在上皮芽内上皮细胞和结缔组织中的网状细胞中表达，Bmp2在上皮芽内上皮细胞和侵入上皮细胞间隙的生血干细胞以及散在分布、大小不等、圆形或椭圆形淋巴细胞样细胞中表达；孵化15天时，Shh在粘膜下上皮细胞、滤泡内扁平上皮细胞以及间质中的网状细胞中表达，Bmp2在滤泡内淋巴细胞，粘膜下上皮细胞和中、小淋巴细胞以及间质中的淋巴细胞样细胞、网状细胞中表达；孵化16天时，Shh在附着滤泡上皮(follicle-associatedepitheliumFAE)和滤泡间表面上皮细胞(interfollicularsurfaceepitheliumISE)以及滤泡内未分化的基质上皮细胞中均表达；孵化17天时，Shh在粘膜下扁平上皮细胞、滤泡内网状上皮细胞中表达，Bmp2在滤泡内间质细胞、淋巴样细胞，淋巴细胞和粘膜下上皮细胞中表达；孵化20天时，Shh在粘膜下扁平上皮细胞、滤泡内网状上皮细胞和间质网状细胞中表达，Bmp2在滤泡内的中、小淋巴细胞和滤泡间间质淋巴样细胞以及扁平上皮细胞中表达。通过本试验，研究了Shh和Bmp2这两个基因在鸡胚胸腺和法氏囊发育过程的时空表达图式，提示Shh和Bmp2有可能参与了鸡胚胸腺和法氏囊微环境的形成。为进一步研究Shh和Bmp2在鸡胚胸腺和法氏囊发育以及T、B淋巴细胞分化中的调控作用奠定了基础，并为探讨上皮细胞与间质细胞之间相互作用这一发育生物学基本问题提供了定的实验依据。收起

关键词 : Shh基因 Bmp2基因胸腺发育法氏囊发育表达图式鸡胚基因表达

3. 牦牛角的形态发生及其SHH和β-catenin的表达

[学位论文] 任强西北农林科技大学 2008年硕士导师: 郁枫共38页

摘要 : 本研究用胚龄(Ed)60～240和Ed 0.5～5y牦牛角(原)基皮肤为实验材料，相同胚龄牛角(原)基皮肤样品作为对照，通过石蜡组织切片HE染色和EnVision免疫组化法，研究牦牛角形态发生过程中的形态学变化，并定性和定量检测SHH(Sonic Hedgehog)β-eatenin在牦... 展开本研究用胚龄(Ed)60～240和Ed 0.5～5y牦牛角(原)基皮肤为实验材料，相同胚龄牛角(原)基皮肤样品作为对照，通过石蜡组织切片HE染色和EnVision免疫组化法，研究牦牛角形态发生过程中的形态学变化，并定性和定量检测SHH(Sonic Hedgehog)β-eatenin在牦牛角形态发生中的表达，结果如下： 1.牦牛角的形态发生按照角(原)基毛囊和角质外鞘发生与否分为五个阶段：角原基前期(Ed≤60)表皮增厚，无毛囊发生；角原基中期(Ed60～140)表皮持续增厚，有少量毛囊发生；角原基后期(Ed140～250)表皮变薄，大量毛囊发生；肉角期(Ed≤0.5y)真皮乳头发生；成角期(Ed≥0.5y)形成角质外鞘。 2.牦牛角原基毛囊形态发生的顺序是从角缘部分开始，然后由外向内向扩散至角原基正中。毛囊与皮肤的角度排列成漩涡状，左角毛纤维排列为顺时针旋转，右角为逆时针旋转；牦牛角边缘毛囊在Ed240d～5y发生退行、凋亡，并在特定信号诱导下向上部迁移变为角鞘表皮；成年牦牛角顶部真皮乳头长而密，中部真皮乳头短而稀，角缘部真皮乳头短而密。黄牛角原基毛囊形态发生的模式与牦牛不同，毛囊形态发生是在角原基范围内同时发生，角的其它发育阶段与牦牛的相似。 3.SHH与β-catertin在牦牛角原基期的顶部和角缘表皮与间充质表达趋势相同，均为强一弱一强的过程；SHH与β-catenin在肉角期和成角期的角缘基底层同时表达，间充质无表达，β-catenin仅在肉角顶部基底层表达；SHH与β-catenin在成角期顶部均无表达，SHH与β-catenin在黄牛角的形态发生过程中的表达模式与牦牛相似。研究结果表明，SHH和β-catenin信号在牦牛角的形态发生过程的表皮一间充质相互作用中可能起着重要作用。我们推测，牦牛角的形态发生可能在SHH和β-catenin信号的调控下，由毛囊的形态发生开始，经过毛囊的密集化，角基表皮迅速增厚，角原基的毛囊不断的变成角质，角开始突起和生长，角基边缘毛囊并入角鞘。这可能是牦牛角生长迅速的细胞生物学基础。收起

关键词 : 牦牛角角原基形态发生 SHH基因 &beta -catenin基因

4. SHH转染骨髓间充质干细胞对心梗后血管再生的影响

[学位论文] 伍明中南大学 2012年硕士导师: 杨进福共58页

摘要 : 本实验利用BMMSC作为载体细胞接受SHH基因转染，期待其移植到体内后能够在保持较良好的生物学特性基础上有效表达被转染基因，以达到增强治疗的目的;我们用电穿孔法将SHH基因转入大鼠骨髓间充质干细胞（以下简写BMMSCSHH），然后将转染后细胞植入大鼠... 展开本实验利用BMMSC作为载体细胞接受SHH基因转染，期待其移植到体内后能够在保持较良好的生物学特性基础上有效表达被转染基因，以达到增强治疗的目的;我们用电穿孔法将SHH基因转入大鼠骨髓间充质干细胞（以下简写BMMSCSHH），然后将转染后细胞植入大鼠心梗周围区;SHH通过调节促血管生长因子促进血管新生，为说明BMMSCSHH能在细胞治疗的基础上促进治疗性血管生长，我们首先从分子生物学水平检测移植部位SHH信号传导通路、及其调节的VEGF、Ang-1等促血管新生因子的变化。最后，通过进行血管密度分析来验证梗死区与正常心肌组织之交界区的血管新生情况。本课题分为三个部分。第一部分:利用Amaxa的Nucleofector核转染仪将SHH外源性基因转染入大鼠BMMSC，检测BMMSCSHH中目的蛋白表达、转染对细胞的损害等验证转染方式的可行性。第二部分:分别于移植后第1、2、4、8周取标本，通过qPCR检测移植后移植部位SHH下游基因、以及促血管再生因子的表达差异。第三部分:血管密度分析法分析各组间心梗与正常心肌组织之交界区血管密度差异。第一部分SHH转染BMMSC细胞目的:探讨SHH基因转染BMMSC可行性。方法:1.通过电转法将SHH基因转染入BMMSC细胞，荧光显微镜观察转染效率;2.分别绘制未转染及转染后细胞生长曲线;3.PCR，RT-PCR、western-blot检测BMMSCSHH中SHH基因的表达。结果:转染后48小时，经荧光倒置显微镜观察转染效率约为30％，PCR检测BMMSCSHH中SHH表达较未转染细胞明显升高，实时定量PCR检测其升高约7倍左右，通过western-blot检测转染后SHH蛋白产表达明显升高。转染后BMMSC生长曲线指数生长期及平台期延后，但转染后第12天能够重合。结论:本实验能够有效将外源性SHH基因转染入BMMSC并能获得有效蛋白表达，能够满足实验要求。第二部分BMMSCSHH对移植部位SHH下游通路的调节目的:探讨BMMSCSHH移植后对下游信号通路的影响。方法:以冠脉结扎法制作近交系Wistar大鼠急性心肌梗死模型，160只急性心肌缺血模型动物随机分为4组（每组40只）。转基因组（Transfection group）在建立急性心梗模型后即在梗死周边部位移植BMMSCSHH，细胞组(BMMSC group, B)在对等梗死周边部位移植等量的BMMSC，混合组(Mixed group, M)在对等梗死周边部位注射等量BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物，对照组(Controlgroup, C)在对等梗死周边部位注射等容积的低糖DMEM液。分别于移植后第1、2、4、8周取标本行1.qPCR检测移植后各组间移植部位Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ等SHH信号传导通路下游基因表达情况。2.qPCR检测移植后各组间移植部位VEGF、 Ang-1促血管再生因子的表达情况。结果:移植后第七天，转染组移植部位SHH下游基因Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ表达分别较对照组、细胞组、混合组上调(Ptc1:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; COUP-TFⅡ:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Gli-2:P＜0.01, P＜0.01,P＜0.01);转染组VEGF、 Ang-1等促血管再生因子也分别较对照组、细胞组、混合组表达上调(VEGF:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Ang-1:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05)。但后续第2、4、8周检测上诉因子表达已无明显差异(P＞0.05)。结论:本实验BMMSCSHH一定时间内上调移植部位SHH信号传导路径及促血管再生因子，为后续检测心梗后移植部位BMMSCshh血管再生情况提供了依据。第三部分BMMSCSHH对移植部位血管再生的影响目的:检测BMMSCSHH对移植部位血管再生的影响。方法:通过免疫组化染色标记血管内皮细胞CD34抗原，显示心梗与正常心肌组织交界区血管，HE染色也能够显示各级血管。免疫组化染色和HE染色相互补充，通过血管密度分析法分析各组间交界区血管密度差异。结果:CD34免疫组化染色后行血管密度分析转染组交界区血管密度分别较对照组、细胞组、混合组上调(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01); HE染色后行血管密度分析转染组交界区血管密度分别较对照组、细胞组、混合组上调(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。结论:BMMSCSHH移植有利于心梗后血管再生，为缺血性心脏病的治疗提供新的探索。收起

关键词 : SHH转染骨髓间充质干细胞心肌梗塞血管再生 SHH基因血管密度分析

5. SHH蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

[学位论文] 陈小鱼重庆医科大学 2010年硕士导师: 王子卫共30页

摘要 : 目的：SHH(Sonic hedgehog)是一种在多种人类组织中广泛表达的锌指转录因子,在许多不同的生理活动中具有重要作用,研究表明SHH基因与多种肿瘤的发生发展有关,本研究中通过检测癌组织中SHH蛋白的表达,探讨SHH蛋白与胃癌临床病理间的关系。方法：... 展开

关键词 : 胃脏肿瘤 SHH蛋白基因表达病理细胞学

6. Shh与Wnt5a基因在NIPBL+/-小鼠模型肢芽的表达研究

[学位论文] 邢蓬蕊石河子大学 2019年硕士导师: 张惠荣共45页

摘要 : 目的：CorneliadeLange综合征（Cdls）为基因缺陷性疾病，多认为NIPBL基因突变可引起Cdls。NIPBL基因的突变可能对其调控的相关Shh、Wnt5a基因转录发生变化，从而对Wnt信号通路中关键因子功能产生影响，从而改变了成骨细胞的分化的方向等，最终导致长... 展开目的：CorneliadeLange综合征（Cdls）为基因缺陷性疾病，多认为NIPBL基因突变可引起Cdls。NIPBL基因的突变可能对其调控的相关Shh、Wnt5a基因转录发生变化，从而对Wnt信号通路中关键因子功能产生影响，从而改变了成骨细胞的分化的方向等，最终导致长骨发育异常。因此，本研究以小鼠胚胎肢芽组织为研究对象，研究Shh、Wnt5a基因在NIPBL基因缺陷小鼠肢芽的表达情况，揭示Wnt信号通路相关因子在NIPBL+/-基因敲除小鼠中的作用，探讨两个基因与Cdls综合征的关系，从而为Cdls综合征的发病机制提供相关理论依据。方法：选择实验动物为NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠，57BL/6J，SPF级，购于浙江大学动物实验中心，动物饲养于石河子大学药学院动物实验中心，饲养条件平均温度25℃，湿度40%左右。NIPBL+/-小鼠，雄性体重35g，雌性体重30g，20：00时将雌雄小鼠按2∶1合笼，晨8:00检查雌鼠的阴栓，阳性阴栓小鼠当天12:00作为其胚胎0.5天。分别于胚胎10天、11天、12天取胎鼠进行实验验证。实验组，利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定后，可得到36只NIPBL+/-胎鼠肢芽，10天（n=12）、11天（n=12）、12天（n=12）。对照组，利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定，可得到36只NIPBL+/+胎鼠肢芽，10天（n=12）、11天（n=12）、12天（n=12），将胎鼠肢芽组织放入液氮中，15-20min后，取出肢芽组织将其冷冻保存于-80℃冰箱内，备用。real-timePCR检测Shh、Wnt5a基因转录及表达水平。实验数据均为正态分布，均数±标准差（-用单因素方差分析，且各组数据间Pearson相关分析，P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著差异。(x)±s）表示，经SPSS17.0统计软件分析，各组比较均采结果：通过NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠获得NIPBL+/-小鼠模型，然后NIPBL+/-小鼠杂交，通过RT-PCR鉴定出实验组胎鼠及对照组胎鼠。利用real-timePCR检测Shh、Wnt5a基因转录水平，实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高，第11d达到最大值，第12d有下降。实验组各时间点与对照组各时间点比较，基因表达量较对照组表达量低，差异有统计学意义（P＜0.01），组内各不同时间段之间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。利用Westernblot检测Shh、Wnt5a蛋白表达水平，实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高，第11d达到最大值，第12d有下降，实验组各时间点与对照组各时间点比较，基因表达量较对照组表达量低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：通过检测NIPBL+/-基因敲除胎鼠肢芽中Shh及Wnt5a基因的表达发现在孕鼠第10、11、12天两基因表达受到抑制，说明NIPBL对Wnt5a和Shh基因表达有影响，有助于人们更好的了解NIPBL+/-基因缺陷引起CdLs综合征骨畸形的发病机制。收起

关键词 : 基因缺陷性疾病 Shh基因 Wnt5a基因 NIPBL+/-动物模型肢芽表达

7. SHH基因突变与先天性肛门直肠畸形的相关性研究

[学位论文] 段利琼山西医科大学 2017年硕士导师: 任红霞共35页

摘要 : 目的：本研究通过分析先天性肛门直肠畸形患儿及健康体检儿童SHH基因突变情况，探讨SHH基因突变与山西地区先天性肛门直肠畸形的相关性，为阐明其病因及有效预防其发生提供研究方向及理论依据。方法：收集就诊于山西省儿童医院并确... 展开

关键词 : 先天性肛门直肠畸形 SHH基因基因突变相关性

8. Shh信号通路对急性心肌梗死心脏的保护作用及其机制研究

[学位论文] 李素娟广州医科大学 2016年博士导师: 罗健东共109页

摘要 : 背景：急性心肌梗死是指因持久而严重的心肌急性缺血、缺氧所引起的部分心肌坏死，临床上表现为急性循环功能障碍、胸痛和一系列反映心肌损伤的心电图改变，是人类心血管疾病发展至心肌衰竭的重要原因之一。急性心肌梗死后，由于心肌细胞严重丧... 展开背景：急性心肌梗死是指因持久而严重的心肌急性缺血、缺氧所引起的部分心肌坏死，临床上表现为急性循环功能障碍、胸痛和一系列反映心肌损伤的心电图改变，是人类心血管疾病发展至心肌衰竭的重要原因之一。急性心肌梗死后，由于心肌细胞严重丧失，直接导致心脏舒张和收缩功能下降，血流动力学改变，心室重构及其他器官的继发性病变。因此，提高急性心肌梗死心脏梗死周边区心肌细胞存活和促进心肌修复对逆转心梗患者病情的发展有着重要的意义。我们认为激活Shh信号通路改善急性心肌梗死心脏功能，减少细胞凋亡，Brg1是其保护急性心肌梗死心脏的核内效应分子。本文利用C57BL/6小鼠构建急性心肌梗死模型和原代培养新生大鼠心肌细胞构建氧葡萄糖剥夺模型进行实验，第一部分主要探讨Shh信号通路活性改变对急性心肌梗死的心脏保护作用和对Brg1表达调控的影响；第二部分主要研究Brg1活化在急性心肌梗死心脏功能障碍和心肌细胞凋亡的保护作用，并从分子水平研究Brg1对心脏Shh信号通路的调控作用及其机制。明确Shh信号通路与Brg1的关系，及其在改善急性心肌梗死心肌细胞凋亡和心脏功能的作用，为临床防治提供新的思路和线索。第一部分 Sonic Hedgehog信号通路对急性心肌梗死心脏的保护作用及对染色质重塑复合物Brg1表达的调控作用目的：本实验通过整体、细胞、分子水平探讨Shh信号通路和Brg1在急性心肌梗死中的变化情况，改变Shh信号通路活性对急性心肌梗死的心脏保护作用和对Brg1的影响。方法： 1.体内实验：SPF级C57BL/6小鼠建立急性心肌梗死模型，分别在术后第1，3，7，14和21天取材，Western blot法检测小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路和Brg1的表达情况；在小鼠心肌梗死术后10min分别腹腔注射给予Shh信号通路受体激动剂SAG1.3（5mg/kg/d）和拮抗剂SANT（3.3mg/kg/d），每天一次，连续七天给药处理，用TTC染色法检测心肌梗死面积，Masson三色染色法检测心肌纤维化，小动物超声成像系统检测小鼠心脏收缩功能；采用TUNEL法标记小鼠心脏梗死周边区心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1的蛋白表达水平； 2.体外实验：SPF级新生Sprague Dawley大鼠原代培养的心肌细胞，采用氧葡萄糖剥夺（OGD）方式模拟体外心肌缺血模型，分别在OGD3h、6h、12h、24h、48h采用MTT法检测细胞存活率，Western blot法检测心肌细胞Brg1和Shh信号通路的表达水平；在心肌细胞培养至第三天，给予不同浓度的Shh信号通路受体激动剂SAG1.3和拮抗剂SANT-1，之后对细胞进行氧葡萄糖剥夺处理，采用MTT法检测细胞存活率，TUNEL法标记心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1的蛋白表达水平；结果： 1.急性心肌梗死小鼠在第7、14、21天Shh信号通路（Ptc1、Gli、Gli2、Shh）和Brg1蛋白表达明显升高； 2.与Sham组相比，AMI组小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低；而与AMI组相比，激动剂SAG1.3使AMI小鼠心重比、心肌梗死面积、心肌纤维化显著减少，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著降低，短轴缩短率和射血分数显著增加，给予拮抗剂SANT-1则使AMI小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低。 3.与Sham组相比，AMI组小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目明显增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低；与AMI组相比，激动剂SAG1.3使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目减少，Bcl-2/Bax蛋白比值明显升高，给予拮抗剂SANT-1则使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低。 4.与Con相比，OGD组3h、6h、12h、24h、48h时间依赖性降低乳鼠心肌细胞活性，OGD12h时Brg1和Shh信号通路表达水平达高峰，OGD24h到48h缓慢下降； 5.Shh信号通路激活提高OGD心肌细胞存活率，并减少凋亡心肌细胞，升高Bcl-2/Bax蛋白比值；而抑制Shh信号通路活性降低OGD心肌细胞存活率，并增加凋亡心肌细胞，降低Bcl-2/Bax蛋白比值。 6.分别在AMI小鼠模型和OGD心肌细胞模型中给予激动剂SAG1.3和拮抗剂SANT-1改变Shh信号通路活性，Brg1蛋白表达没有明显变化。小结： 1.急性心肌梗死小鼠、氧葡萄糖剥夺心肌细胞中Shh信号通路被激活。 2.激动Shh信号通路改善急性心肌梗死小鼠心功能和心肌凋亡，改善氧葡萄糖剥夺心肌细胞凋亡、提高细胞存活率； 3.急性心肌梗死小鼠、氧葡萄糖剥夺心肌细胞中Brg1表达上调；但改变心肌Shh信号通路活性对Brg1表达无明显影响。第二部分染色质重塑复合物Brg1通过激活Sonic Hedgehog信号改善急性心肌梗死心脏功能目的：探讨Brg1活化对急性心肌梗死心功能和心肌细胞的保护作用及其对Shh信号通路的影响方法： 1.构建腺病毒载体Ad-Brg1上调Brg1的表达和慢病毒载体Lenti-Brg1shRNA649沉默Brg1的表达；Western blot法检测其对Shh信号通路的调控作用； 2.体内实验：SPF级C57BL/6小鼠建立急性心肌梗死模型，术后分组在心肌内注射腺病毒Ad-Brg1和慢病毒Lenti-Brg1shRNA649，七天后取材，用TTC染色法检测心肌梗死面积，Masson三色染色法检测心肌纤维化，小动物超声成像系统检测小鼠心脏收缩功能；采用TUNEL法标记小鼠心脏梗死周边区心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1和Shh信号通路的蛋白表达水平，采用ChIP法检测Brg1与Shh信号通路核内启动子区域的结合情况； 3.体外实验：SPF级新生Sprague Dawley大鼠原代培养的心肌细胞，采用氧葡萄糖剥夺（OGD）方式模拟体内心肌缺血模型，分别给予50?l/ml腺病毒Ad-Brg1和30?l/ml慢病毒Lenti-Brg1shRNA649，对细胞进行氧葡萄糖剥夺处理，采用MTT法检测细胞存活率，TUNEL法标记心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1和Shh信号通路的蛋白表达水平；结果： 1.腺病毒载体Ad-Brg1特异性高表达心肌细胞Brg1，并上调心肌细胞Shh信号通路Ptc1、Gli1/2、Shh表达水平；慢病毒载体Lenti-Brg1shRNA649沉默心肌细胞Brg1，并降低心肌细胞Shh信号通路Ptc1、Gli1/2、Shh表达水平。 2.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心重比、心肌梗死面积、心肌纤维化显著降低，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著降低，短轴缩短率和射血分数显著增加，沉默Brg1则使AMI小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低。 3.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目减少，Bcl-2/Bax蛋白比值明显升高，沉默Brg1则使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低。 4.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路Ptc1、Gli1、Gli2、Shh蛋白表达升高，沉默Brg1则使AMI小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路Ptc1、Gli1、Gli2、Shh蛋白表达降低。 5.激活Brg1诱导氧葡萄糖剥夺心肌细胞Shh信号通路的表达，增加氧葡萄糖剥夺心肌新报存活率，并改善心肌细胞凋亡，而沉默Brg1降低氧葡萄糖剥夺心肌细胞存活率，加重心肌细胞凋亡。小结： 1.激动Brg1改善急性心肌梗死心功能和心肌细胞凋亡，沉默Brg1则加重急性心肌梗死心功能障碍并增加心肌细胞凋亡。 2.Brg1是心肌Shh信号通路的上游调控因子，心肌梗死时Brg1的上调激活Shh信号通路。全文结论： 1.急性心肌梗死小鼠和氧葡萄糖剥夺心肌细胞中改变Shh信号通路活性对Brg1没有明显影响。 2.激活Brg1改善急性心肌梗死小鼠心功能障碍和心肌细胞凋亡，并提高心肌细胞存活率。 3.Brg1是心肌Shh信号通路的上游调控因子，心肌梗死时Brg1的上调激活Shh信号通路。收起

关键词 : 急性心肌梗死 Shh信号通路 Brg1基因心脏保护

9. ISL1 通过 Hedgehog 通路调控肺分支发育的分子机制研究

[学位论文] 黄瑞琦杭州师范大学 2023年硕士导师: 李斐雪共64页

摘要 : 人体重要的呼吸器官肺的发育受到多种信号通路的调控，其具体的分子机理一直是研究的热点。Isl1 基因是一个 LIM 同源结构域转录因子，其在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。我们的实验结果显示 Isl1 基因在小鼠肺发育早期的上皮细胞中特异性表达。... 展开人体重要的呼吸器官肺的发育受到多种信号通路的调控，其具体的分子机理一直是研究的热点。Isl1 基因是一个 LIM 同源结构域转录因子，其在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。我们的实验结果显示 Isl1 基因在小鼠肺发育早期的上皮细胞中特异性表达。为了进一步研究Isl1基因在肺发育过程中的功能，我们利用ShhCre工具鼠与Isl1f/f小鼠交配，成功获得在肺上皮细胞中特异性敲除 Isl1 基因的突变型小鼠（Isl1ShhCre）。通过对突变型小鼠的表型分析，我们发现肺上皮细胞中 Isl1 的缺失会导致肺分支缺陷。与野生型小鼠相比，E11.5-E12.5 天 Isl1ShhCre突变型小鼠肺间充质细胞增殖显著降低，而上皮细胞的增殖没有显著差异。TUNEL结果显示突变型小鼠与野生型小鼠的肺部细胞凋亡没有明显差异。为了寻找Isl1基因的靶分子，我们利用RNA-Seq技术筛选E11.5天突变型小鼠肺组织中的差异表达基因。RNA-Seq 和原位杂交结果显示与肺发育密切相关的基因Shh、Ptch1、Sox9、Irx1、Irx2、Tbx2和Tbx3在Isl1ShhCre突变型小鼠肺中的表达明显下调。其中，Shh是在肺部分支形态发生中的重要信号分子，肺间充质细胞的增殖也受到 Shh 的调控。体外肺原代细胞中过表达 Isl1 可以明显上调Shh的表达，ChIP实验结果也证实转录因子ISL1可以与Shh基因增强子序列（MACS1）结合。这些结果都表明 Isl1 可以在转录水平上直接调控 Shh 的表达。我们利用体外器官培养实验证实Hedgehog信号通路的激活可以挽救Isl1缺失导致的肺间充质细胞增殖缺陷。体内激活Hedgehog信号通路也可以部分挽救Isl1基因敲除导致的肺分支形态发生缺陷。综上所述，Isl1基因在肺分支发育过程中起着关键作用，Isl1基因可能通过影响SHH信号通路调控肺分支发育过程。收起

关键词 : 肺分支发育 Isl1基因 Shh信号通路调控机制

10. 中国高度近视病人中候选基因的突变筛查和SNP分布研究

[学位论文] 杜艳蕾中山大学 2004年博士导师: 张清炯共83页

摘要 : 高度近视是指眼屈光度>-6.00D的屈光不正状态.高度近视可仅作为其他疾病,特别是某些遗传性综合征的一种伴发症状,这些疾病各自均有不同的遗传方式和致病基因/位点.但通常意义上的高度近视是指一种独立的疾病实体,又称为单纯性高度近视,这也是该课题的... 展开

关键词 : 高度近视 DLGAP1基因 SHH基因 NGFR基因单核苷酸多态性