摘要: 背景和目的： 德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长智... 展开 背景和目的： 德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长智能迟滞、认知障碍、上肢畸形、多毛症、特殊面容、心脏瓣膜缺陷等多器官功能异常，严重影响了新生儿及儿童的健康成长，给家庭和社会造成了沉重的负担。其中，该病65%的患儿是由NIPBL、Smc1和Smc3这三个基因突变所导致，NIPBL基因突变是引起常染色体显性遗传性疾病德朗热综合征的主要病因，约60%的患儿由NIPBL基因突变引起。在胎鼠的肢芽发育阶段中，NIPBL基因对位于肢芽ZPA（Zone of Polarizing Activity）区域的Shh（Sonic Hedgehog）基因具有调控作用，影响Shh基因的表达，但具体两个基因之间的交互作用如何以及规律如何，还未可知。本实验，我们利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，在此模型的基础上，探讨Shh基因在胎鼠发育的不同时期的表达情况。 方法： NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J,SPF级，购于浙江大学，全部小鼠饲养于石河子大学药学院实验动物中心。实验过程遵照石河子大学动物实验伦理委员会管理条例。本实验，我们首先建立NIPBL-Loxp小鼠模型，然后再利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，然后NIPBL+/-小鼠模型作为亲代鼠，挑选NIPBL+/-小鼠雄性35g左右，雌性30g左右，在晚上20:00点将雌、雄小鼠按2:1合笼，次日早上8点检查雌鼠的阴栓，将阴栓阳性者的雌鼠次日中午作为其胚胎E0.5天。经过相互杂交NIPBL+/-小鼠模型，在孕鼠的E10、E11、E12天，取出孕鼠放在超净台内，用颈部脱臼法处死孕鼠，在严格的无菌操作条件下，取出胎鼠。胎鼠被取出后，分别采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组，和6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作为对照组，然后分离胎鼠的四肢，放入液氮和-80℃冰箱备用；最后采用定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术分别检测实验组和对照组胎鼠 肢芽内Shh基因的表达情况。 结果： 用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，NIPBL+/-小鼠相互杂交通过RT-PCR技术鉴定出作为实验组和对照组的胎鼠。其中，实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10、11、12天均有表达，而且实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10天的ΔCt值>E12天的ΔCt值>E11天的ΔCt值（ΔCt值越高，Shh基因的表达水平越低），表明在不同的孕期（E10、11、12天）天数下相比较，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因表达趋势是先升后降，差异有统计学意义(P<0.01)；在相同的孕期(E10、11、12天）天数内，实验组Shh基因的ΔCt值大于对照组ΔCt值，表明实验组胎鼠肢芽内Shh基因的表达水平低于对照组，这种差异也有统计学意义(P<0.01)。 结论： 在孕鼠的E10、E11、E12天，NIPBL+/-基因剔除的胎鼠抑制其肢芽内Shh基因的表达，说明Shh基因在胎鼠肢芽发育中的特定时期进行表达，有助于人们更好地了解德朗热综合征中骨骼畸形的发病机制。 收起