摘要: 目的：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrom,CDLS）是由于发育早期多种基因表达异常引起的临床罕见疾病，主要的临床特征是骨骼发育畸形。目前研究表明，NIPBL基因低表达与CDLS患者骨骼发育异常密切相关[1]。本实验通过敲低骨髓间充质干细胞（Bonem... 展开 目的：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrom,CDLS）是由于发育早期多种基因表达异常引起的临床罕见疾病，主要的临床特征是骨骼发育畸形。目前研究表明，NIPBL基因低表达与CDLS患者骨骼发育异常密切相关[1]。本实验通过敲低骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）中的NIPBL基因，使其低表达，探讨NIPBL基因对BMSCs在成骨分化方面的影响及可能的机制，为CDLS患儿骨骼畸形的可逆性治疗提供新的理论依据。 方法：C57BL/6的专用细胞培养基培养BMSCs至第3代，用细胞免疫荧光检测BMSCs表面抗原CD44的表达验证细胞种类。培养BMSCs至对数期后，按照慢病毒感染复数（multiplicityofinfection,MOI）为20、40、60、80分别预转染BMSCs，找到其最适MOI。按照最适MOI转染NIPBL-shRNA（5，-GCATCCGAGTCTAATGTTTGA-3，）和空载体慢病毒（shRNA-NC），观察细胞荧光量达80%-90%时筛选稳转细胞系，实时荧光定量PCR（QRT-PCR）检测细胞稳转后NIPBLmRNA的相对表达量，验证NIPBL低表达组的BMSCs细胞系是否构建成功。BMSCs分为空白组、空载体组及NIPBL敲低组，相同条件下用成骨诱导培养基培养，定期观察各组细胞形状、钙盐结节等变化情况。在成骨诱导第21天用茜素红染色（Alizarinstaining）检测细胞的钙盐成分，并用免疫印迹实验（Western-blot）检测β连环蛋白（β-catenin）及磷酸化β连环蛋白（P-β-catenin）的表达量，QRT-PCR检测Lrp5mRNA的表达情况。 结果： （1）与空载体组及空白组比较，经慢病毒转染后的敲低组中NIPBLmRNA的相对表达量明显降低，存在统计学差异（Plt;0.05）。空载体组与空白组NIPBLmRNA的相对表达量相当，无统计学差异（Pgt;0.05）。这表示已成功建立了NIPBL基因低表达的细胞系，并且病毒衣壳对NIPBL基因的正常表达没有明显影响。 （2）三组细胞在成骨分化过程中形态发生了明显变化，诱导第21天Alizarin染色发现NIPBL敲低组形成的红色钙盐颗粒比空白组和空载体组少，结果提示敲低NIPBL可以抑制BMSCs的成骨分化。 （3）在成骨定向诱导21天后，NIPBL敲低组的β-catenin蛋白、P-β-catenin蛋白以及Lrp5mRNA表达水平均低于空白组和空载体组，存在统计学差异（Plt;0.001）；空白组和空载体组的β-catenin蛋白、P-β-catenin蛋白以及Lrp5mRNA表达水平无统计学差异（Pgt;0.05）。 结论：慢病毒敲低BMSCs中NIPBL基因的表达抑制了其成骨定向分化，Wnt/β-catenin通路中表面受体Lrp5、转录共调节分子β-catenin表达也随之下降，但P-β-catenin（失活状态）表达上升。这表明Wnt/β-catenin通路可能参与了NIPBL基因突变所致的CdLS骨骼发育异常的过程。 收起