摘要: 背景： 急性心肌梗死是指因持久而严重的心肌急性缺血、缺氧所引起的部分心肌坏死，临床上表现为急性循环功能障碍、胸痛和一系列反映心肌损伤的心电图改变，是人类心血管疾病发展至心肌衰竭的重要原因之一。急性心肌梗死后，由于心肌细胞严重丧失... 展开 背景： 急性心肌梗死是指因持久而严重的心肌急性缺血、缺氧所引起的部分心肌坏死，临床上表现为急性循环功能障碍、胸痛和一系列反映心肌损伤的心电图改变，是人类心血管疾病发展至心肌衰竭的重要原因之一。急性心肌梗死后，由于心肌细胞严重丧失，直接导致心脏舒张和收缩功能下降，血流动力学改变，心室重构及其他器官的继发性病变。因此，提高急性心肌梗死心脏梗死周边区心肌细胞存活和促进心肌修复对逆转心梗患者病情的发展有着重要的意义。 我们认为激活Shh信号通路改善急性心肌梗死心脏功能，减少细胞凋亡，Brg1是其保护急性心肌梗死心脏的核内效应分子。本文利用C57BL/6小鼠构建急性心肌梗死模型和原代培养新生大鼠心肌细胞构建氧葡萄糖剥夺模型进行实验，第一部分主要探讨Shh信号通路活性改变对急性心肌梗死的心脏保护作用和对Brg1表达调控的影响；第二部分主要研究Brg1活化在急性心肌梗死心脏功能障碍和心肌细胞凋亡的保护作用，并从分子水平研究Brg1对心脏Shh信号通路的调控作用及其机制。明确Shh信号通路与Brg1的关系，及其在改善急性心肌梗死心肌细胞凋亡和心脏功能的作用，为临床防治提供新的思路和线索。 第一部分 Sonic Hedgehog信号通路对急性心肌梗死心脏的保护作用及对染色质重塑复合物Brg1表达的调控作用 目的： 本实验通过整体、细胞、分子水平探讨Shh信号通路和Brg1在急性心肌梗死中的变化情况，改变Shh信号通路活性对急性心肌梗死的心脏保护作用和对Brg1的影响。 方法： 1.体内实验：SPF级C57BL/6小鼠建立急性心肌梗死模型，分别在术后第1，3，7，14和21天取材，Western blot法检测小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路和Brg1的表达情况；在小鼠心肌梗死术后10min分别腹腔注射给予Shh信号通路受体激动剂SAG1.3（5mg/kg/d）和拮抗剂SANT（3.3mg/kg/d），每天一次，连续七天给药处理，用TTC染色法检测心肌梗死面积，Masson三色染色法检测心肌纤维化，小动物超声成像系统检测小鼠心脏收缩功能；采用TUNEL法标记小鼠心脏梗死周边区心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1的蛋白表达水平； 2.体外实验：SPF级新生Sprague Dawley大鼠原代培养的心肌细胞，采用氧葡萄糖剥夺（OGD）方式模拟体外心肌缺血模型，分别在OGD3h、6h、12h、24h、48h采用MTT法检测细胞存活率，Western blot法检测心肌细胞Brg1和Shh信号通路的表达水平；在心肌细胞培养至第三天，给予不同浓度的Shh信号通路受体激动剂SAG1.3和拮抗剂SANT-1，之后对细胞进行氧葡萄糖剥夺处理，采用MTT法检测细胞存活率，TUNEL法标记心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1的蛋白表达水平； 结果： 1.急性心肌梗死小鼠在第7、14、21天Shh信号通路（Ptc1、Gli、Gli2、Shh）和Brg1蛋白表达明显升高； 2.与Sham组相比，AMI组小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低；而与AMI组相比，激动剂SAG1.3使AMI小鼠心重比、心肌梗死面积、心肌纤维化显著减少，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著降低，短轴缩短率和射血分数显著增加，给予拮抗剂SANT-1则使AMI小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低。 3.与Sham组相比，AMI组小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目明显增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低；与AMI组相比，激动剂SAG1.3使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目减少，Bcl-2/Bax蛋白比值明显升高，给予拮抗剂SANT-1则使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低。 4.与Con相比，OGD组3h、6h、12h、24h、48h时间依赖性降低乳鼠心肌细胞活性，OGD12h时Brg1和Shh信号通路表达水平达高峰，OGD24h到48h缓慢下降； 5.Shh信号通路激活提高OGD心肌细胞存活率，并减少凋亡心肌细胞，升高Bcl-2/Bax蛋白比值；而抑制Shh信号通路活性降低OGD心肌细胞存活率，并增加凋亡心肌细胞，降低Bcl-2/Bax蛋白比值。 6.分别在AMI小鼠模型和OGD心肌细胞模型中给予激动剂SAG1.3和拮抗剂SANT-1改变Shh信号通路活性，Brg1蛋白表达没有明显变化。 小结： 1.急性心肌梗死小鼠、氧葡萄糖剥夺心肌细胞中Shh信号通路被激活。 2.激动Shh信号通路改善急性心肌梗死小鼠心功能和心肌凋亡，改善氧葡萄糖剥夺心肌细胞凋亡、提高细胞存活率； 3.急性心肌梗死小鼠、氧葡萄糖剥夺心肌细胞中Brg1表达上调；但改变心肌Shh信号通路活性对Brg1表达无明显影响。 第二部分 染色质重塑复合物Brg1通过激活Sonic Hedgehog信号改善急性心肌梗死心脏功能 目的： 探讨Brg1活化对急性心肌梗死心功能和心肌细胞的保护作用及其对Shh信号通路的影响 方法： 1.构建腺病毒载体Ad-Brg1上调Brg1的表达和慢病毒载体Lenti-Brg1shRNA649沉默Brg1的表达；Western blot法检测其对Shh信号通路的调控作用； 2.体内实验：SPF级C57BL/6小鼠建立急性心肌梗死模型，术后分组在心肌内注射腺病毒Ad-Brg1和慢病毒Lenti-Brg1shRNA649，七天后取材，用TTC染色法检测心肌梗死面积，Masson三色染色法检测心肌纤维化，小动物超声成像系统检测小鼠心脏收缩功能；采用TUNEL法标记小鼠心脏梗死周边区心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1和Shh信号通路的蛋白表达水平，采用ChIP法检测Brg1与Shh信号通路核内启动子区域的结合情况； 3.体外实验：SPF级新生Sprague Dawley大鼠原代培养的心肌细胞，采用氧葡萄糖剥夺（OGD）方式模拟体内心肌缺血模型，分别给予50?l/ml腺病毒Ad-Brg1和30?l/ml慢病毒Lenti-Brg1shRNA649，对细胞进行氧葡萄糖剥夺处理，采用MTT法检测细胞存活率，TUNEL法标记心肌凋亡细胞，Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，以及Brg1和Shh信号通路的蛋白表达水平； 结果： 1.腺病毒载体Ad-Brg1特异性高表达心肌细胞Brg1，并上调心肌细胞Shh信号通路Ptc1、Gli1/2、Shh表达水平；慢病毒载体Lenti-Brg1shRNA649沉默心肌细胞Brg1，并降低心肌细胞Shh信号通路Ptc1、Gli1/2、Shh表达水平。 2.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心重比、心肌梗死面积、心肌纤维化显著降低，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著降低，短轴缩短率和射血分数显著增加，沉默Brg1则使AMI小鼠心重比升高、心肌梗死面积升高、心肌纤维化增加，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径显著增加，短轴缩短率和射血分数显著降低。 3.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目减少，Bcl-2/Bax蛋白比值明显升高，沉默Brg1则使AMI小鼠心脏梗死周边区凋亡细胞数目增多，Bcl-2/Bax蛋白比值明显降低。 4.与AMI+Ad-GFP组相比，激活Brg1使AMI小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路Ptc1、Gli1、Gli2、Shh蛋白表达升高，沉默Brg1则使AMI小鼠心脏梗死周边区Shh信号通路Ptc1、Gli1、Gli2、Shh蛋白表达降低。 5.激活Brg1诱导氧葡萄糖剥夺心肌细胞Shh信号通路的表达，增加氧葡萄糖剥夺心肌新报存活率，并改善心肌细胞凋亡，而沉默Brg1降低氧葡萄糖剥夺心肌细胞存活率，加重心肌细胞凋亡。 小结： 1.激动Brg1改善急性心肌梗死心功能和心肌细胞凋亡，沉默Brg1则加重急性心肌梗死心功能障碍并增加心肌细胞凋亡。 2.Brg1是心肌Shh信号通路的上游调控因子，心肌梗死时Brg1的上调激活Shh信号通路。 全文结论： 1.急性心肌梗死小鼠和氧葡萄糖剥夺心肌细胞中改变Shh信号通路活性对Brg1没有明显影响。 2.激活Brg1改善急性心肌梗死小鼠心功能障碍和心肌细胞凋亡，并提高心肌细胞存活率。 3.Brg1是心肌Shh信号通路的上游调控因子，心肌梗死时Brg1的上调激活Shh信号通路。 收起