摘要: 本实验利用BMMSC作为载体细胞接受SHH基因转染，期待其移植到体内后能够在保持较良好的生物学特性基础上有效表达被转染基因，以达到增强治疗的目的;我们用电穿孔法将SHH基因转入大鼠骨髓间充质干细胞（以下简写BMMSCSHH），然后将转染后细胞植入大鼠... 展开 本实验利用BMMSC作为载体细胞接受SHH基因转染，期待其移植到体内后能够在保持较良好的生物学特性基础上有效表达被转染基因，以达到增强治疗的目的;我们用电穿孔法将SHH基因转入大鼠骨髓间充质干细胞（以下简写BMMSCSHH），然后将转染后细胞植入大鼠心梗周围区;SHH通过调节促血管生长因子促进血管新生，为说明BMMSCSHH能在细胞治疗的基础上促进治疗性血管生长，我们首先从分子生物学水平检测移植部位SHH信号传导通路、及其调节的VEGF、Ang-1等促血管新生因子的变化。最后，通过进行血管密度分析来验证梗死区与正常心肌组织之交界区的血管新生情况。本课题分为三个部分。 第一部分:利用Amaxa的Nucleofector核转染仪将SHH外源性基因转染入大鼠BMMSC，检测BMMSCSHH中目的蛋白表达、转染对细胞的损害等验证转染方式的可行性。第二部分:分别于移植后第1、2、4、8周取标本，通过qPCR检测移植后移植部位SHH下游基因、以及促血管再生因子的表达差异。第三部分:血管密度分析法分析各组间心梗与正常心肌组织之交界区血管密度差异。 第一部分SHH转染BMMSC细胞 目的:探讨SHH基因转染BMMSC可行性。 方法:1.通过电转法将SHH基因转染入BMMSC细胞，荧光显微镜观察转染效率;2.分别绘制未转染及转染后细胞生长曲线;3.PCR，RT-PCR、western-blot检测BMMSCSHH中SHH基因的表达。 结果:转染后48小时，经荧光倒置显微镜观察转染效率约为30％，PCR检测BMMSCSHH中SHH表达较未转染细胞明显升高，实时定量PCR检测其升高约7倍左右，通过western-blot检测转染后SHH蛋白产表达明显升高。转染后BMMSC生长曲线指数生长期及平台期延后，但转染后第12天能够重合。 结论:本实验能够有效将外源性SHH基因转染入BMMSC并能获得有效蛋白表达，能够满足实验要求。 第二部分BMMSCSHH对移植部位SHH下游通路的调节 目的:探讨BMMSCSHH移植后对下游信号通路的影响。 方法:以冠脉结扎法制作近交系Wistar大鼠急性心肌梗死模型，160只急性心肌缺血模型动物随机分为4组（每组40只）。转基因组（Transfection group）在建立急性心梗模型后即在梗死周边部位移植BMMSCSHH，细胞组(BMMSC group, B)在对等梗死周边部位移植等量的BMMSC，混合组(Mixed group, M)在对等梗死周边部位注射等量BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物，对照组(Controlgroup, C)在对等梗死周边部位注射等容积的低糖DMEM液。分别于移植后第1、2、4、8周取标本行1.qPCR检测移植后各组间移植部位Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ等SHH信号传导通路下游基因表达情况。2.qPCR检测移植后各组间移植部位VEGF、 Ang-1促血管再生因子的表达情况。 结果:移植后第七天，转染组移植部位SHH下游基因Ptc1、Gli-2、COUP-TFⅡ表达分别较对照组、细胞组、混合组上调(Ptc1:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; COUP-TFⅡ:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Gli-2:P＜0.01, P＜0.01,P＜0.01);转染组VEGF、 Ang-1等促血管再生因子也分别较对照组、细胞组、混合组表达上调(VEGF:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05; Ang-1:P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05)。但后续第2、4、8周检测上诉因子表达已无明显差异(P＞0.05)。 结论:本实验BMMSCSHH一定时间内上调移植部位SHH信号传导路径及促血管再生因子，为后续检测心梗后移植部位BMMSCshh血管再生情况提供了依据。 第三部分BMMSCSHH对移植部位血管再生的影响 目的:检测BMMSCSHH对移植部位血管再生的影响。 方法:通过免疫组化染色标记血管内皮细胞CD34抗原，显示心梗与正常心肌组织交界区血管，HE染色也能够显示各级血管。免疫组化染色和HE染色相互补充，通过血管密度分析法分析各组间交界区血管密度差异。 结果:CD34免疫组化染色后行血管密度分析转染组交界区血管密度分别较对照组、细胞组、混合组上调(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01); HE染色后行血管密度分析转染组交界区血管密度分别较对照组、细胞组、混合组上调(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。 结论:BMMSCSHH移植有利于心梗后血管再生，为缺血性心脏病的治疗提供新的探索。 收起