摘要: 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)，是一种常见的神经系统退行性疾病，以进行性记忆力减退、认识功能障碍、执行能力障碍、失语、失用、视空间障碍以及精神行为异常为主要临床特征。随着世界人口老龄化程度的不断加剧，AD的发病率逐年升高，在老... 展开 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)，是一种常见的神经系统退行性疾病，以进行性记忆力减退、认识功能障碍、执行能力障碍、失语、失用、视空间障碍以及精神行为异常为主要临床特征。随着世界人口老龄化程度的不断加剧，AD的发病率逐年升高，在老年人群中 AD 已成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第 4 位致死原因，给社会和家庭带来了沉重的负担。AD的发病机制复杂，至今尚未明确，目前存在的假说包括β淀粉样蛋白毒性学说、Tau蛋白代谢异常学说、基因突变学说、胆碱能缺乏学说、兴奋性氨基酸毒性学说、神经炎症学说、钙超载学说、代谢综合征学说等。因其发病机制复杂，AD仍缺乏有效的治疗手段。目前经FDA批准用于治疗AD的药物只有多奈哌齐和美金刚，然而这两种药物只能改变神经递质水平，不能改变AD的病理过程、阻止AD的病情进展，因此对AD的治疗仍是世界范围内医学研究者所面临的挑战之一。 研究证实AD患者脑内小胶质细胞在Aβ刺激下激活，被长期、慢性活化，进而合成和释放大量炎症介质，最终造成神经元的损伤和丢失。存在于小胶质细胞中的NF-κB 作为多效性的核转录因子，能够调控多种炎症因子的信号转导，其中一条重要的炎症信号通路就是NF-κB-NLRP3炎症体-caspase-1-IL-1β。NF-κB被激活后转移到细胞核内，一方面诱导IL-1β基因表达，产生大量无活性的IL-1β前体(pro-IL-1β)，另一方面诱导NLRP3表达。NLRP3在外界损伤刺激下，募集接头蛋白ASC和效应蛋白 caspase-1 组成 NLRP3 炎症体，后者会将 pro-IL-1β 剪切为有强烈促炎活性的 IL-1β，进而诱导其他炎症因子、趋化因子等的合成，导致脑内的炎症级联反应。目前已有多项研究证实，抑制 NLRP3 炎症体可以减少 Aβ 的沉积，改善认知功能。因此， NLRP3炎症小体成为了目前AD防治研究领域的热点。 临床流行病研究显示，长期服用非甾体抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)的患者AD的发病率明显减低。这一现象提示我们：以调控神经炎症为靶点来治疗 AD，可能会获得良好的治疗效果。然而，目前已开展的针对 NSAIDs治疗AD的数项临床试验大多因药物的胃肠道副作用而中止，从而限制了抗炎疗法在AD治疗领域中的探索性研究。 中医药是中华民族的伟大瑰宝之一，以其低毒、调节全身机体功能的整体观，以及多靶点、多环节的作用特点，在众多疾病的防治中起到了良好的效果。基于对痴呆的中医病机的理解和阅读经典中医古籍，结合前期的研究成果，我们在古代经方“不忘散”基础上，根据单味中药之间的有机配伍和协同作用，构建了由远志、石菖蒲、人参、茯苓、茯神、当归、白术和黄连组成的“加味不忘散”。该组方更加合理全面，既扶正又祛邪，切中、兼顾了AD的主要病机。目前已应用于临床，收到了较好的效果。在前期研究基础上，本研究以神经免疫炎症学说为根据，以信号转导通路途径为切入点，从体内实验和体外实验两个层次，验证加味不忘散治疗AD的有效性，并进一步观察该组方对AD神经炎症的影响。 第一部分 加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆功能及海马组织结构的影响 目的： 1. 观察加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆功能影响； 2. 观察加味不忘散对AD模型大鼠海马组织结构和神经元凋亡的影响。 方法： 1. 将SD大鼠分为假手术组、AD模型组、加味不忘散低剂量干预组、加味不忘散中剂量干预组、加味不忘散高剂量干预组和MCC950干预组； 2. 通过脑立体定位技术向双侧海马注射Aβ1-42制备AD大鼠模型； 3. 运用Morris水迷宫试验评估大鼠学习记忆功能； 4. 大脑切片进行HE染色，在光镜下观察大鼠海马的组织结构； 5. 利用透射电镜观察海马超微结构变化，并计数突触数量进行比较； 6. 运用TUNEL染色法观察海马神经元凋亡情况。 结果： 1. 加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆试验的影响：假手术组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为 69.79±13.54 s、52.16±3.87 s、34.75±17.10 s、19.71±5.39 s、10.57±3.85 s。AD 模型组大鼠第 1 天到第 5 天的逃避潜伏期分别为 79.21±16.37s、74.46±5.58 s、65.00±8.62 s、41.82±8.87 s、28.96±6.73 s，与假手术组相比，在第2-5天的逃避潜伏期均明显延长(p<0.01)。加味不忘散低剂量干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为77.96±13.83 s、75.78±7.92 s、62.91±7.99 s、38.82±10.93 s、25.75±6.77 s，与AD模型组相比无显著差异(p > 0.05)。加味不忘散中剂量干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为76.21±12.80 s、64.28±8.37 s、50.87±8.61 s、30.82±5.33 s、19.82±2.68 s，第2-5天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p < 0.05)。加味不忘散高剂量干预组大鼠第 1 天到第 5 天的逃避潜伏期分别为70.42±14.08 s、54.74±10.40 s、38.07±8.31 s、22.59±5.42 s、14.39±3.51 s，第2-5天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p<0.01)，较加味不忘散中剂量干预组也缩短(p<0.01)。MCC950干预组大鼠第1天到第5天的逃避潜伏期分别为71.65±16.03 s、54.51±10.01 s、39.36±7.14 s、22.24±5.11 s、13.93±3.68 s，第2-5天的逃避潜伏期较AD模型组和加味不忘散低剂量干预组明显缩短(p<0.01)，较加味不忘散中剂量干预组也缩短(p<0.01)，与加味不忘散高剂量干预组相比无显著差异（p值分别为0.938、0.815、0.928、0.857）。 2. 加味不忘散对AD模型大鼠空间探索能力的影响：假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠的原平台象限停留时间分别为41.14±4.22 s、23.28±8.34 s、24.57±7.33 s、31.71±6.97 s、39.43±5.44 s、39.15±4.06 s。其中AD模型组大鼠的原平台象限停留时间明显短于假手术组(p < 0.001)，加味不忘散低剂量干预组大鼠的原平台象限停留时间也明显短于假手术组(p < 0.001)，与 AD模型组无明显差异(p=0.703)。加味不忘散中剂量组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(p=0.016)和加味不忘散低剂量干预组(p=0.040)均有所延长。加味不忘散高剂量组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(p < 0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p=0.027)均延长。MCC950干预组大鼠的原平台象限停留时间较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.033)均延长，与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p=0.933)。 假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠的跨台次数分别为 12.71±2.63、5.29±1.38、7.43±1.62、9.71±1.50、12.14±2.41、12.29±3.39。其中AD模型组大鼠的跨台次数明显少于假手术组(p<0.001)，加味不忘散低剂量干预组大鼠的跨台次数也明显少于假手术组(p < 0.001)，与AD模型组无明显差异(p=0.056)。加味不忘散中剂量组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)和加味不忘散低剂量干预组(p=0.042)均增多。加味不忘散高剂量组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p=0.031)均增多。MCC950干预组大鼠的跨台次数较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p=0.023)均显著增多，与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p=0.895)。 3. 加味不忘散对AD模型大鼠海马组织结构的影响：HE染色显示，AD模型组和加味不忘散低剂量组海马神经元数量明显减少，细胞体积缩小，核固缩，排列紊乱；加味不忘散中、高剂量干预组和 MCC950 大鼠海马神经元数量明显增多、排列变整齐、异常细胞减少。 4. 加味不忘散对AD模型大鼠海马超微结构的影响：通过透射电镜观察到，AD模型组大鼠海马大量神经元变性、坏死，核固缩，线粒体肿胀明显。与AD模型组相比，随着加味不忘散干预剂量的增加，大鼠海马神经元形态逐渐变完整，变性或坏死的神经元逐渐减少，细胞浆内细胞器数量逐渐增多、形态逐渐转为正常。 5. 加味不忘散对 AD 模型大鼠海马突触结构和数量的影响：通过透射电镜观察海马突触结构发现，AD模型组大鼠海马内的突触结构被破坏，突触结构不完整，突触间隙增大，突触后膜内的致密物质变薄。与AD模型组相比，随着加味不忘散干预剂量的增加，海马内突触结构逐渐由不完整变完整，突触间隙由大变小，突触后膜内的致密物也由少变多。 假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠海马的突触数量分别为27.31±6.99、10.76±3.19、13.64±3.53、19.61±3.69、25.77±7.21、24.93±5.97。其中AD模型组大鼠海马的突触数量较假手术组明显减少(p<0.001)，加味不忘散低剂量干预组大鼠海马的突触数量也明显少于假手术组(p < 0.001)，与 AD模型组无明显差异(p = 0.248)。加味不忘散中剂量组大鼠海马的突触数量较AD模型组(p=0.001)和加味不忘散低剂量干预组(p=0.015)均增多。加味不忘散高剂量组大鼠海马的突触数量较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p = 0.013)均增多。MCC950 干预组大鼠海马的突触数量较 AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和加味不忘散中剂量干预组(p=0.031)均显著增多，与加味不忘散高剂量组相比无统计学差异(p=0.709)。可见，加味不忘散对AD模型大鼠突触结构和数量具有改善作用，并具有剂量依赖性。 6. 加味不忘散对AD模型大鼠海马神经元凋亡的影响：TUNEL染色显示，假手术组、AD模型组、加味不忘散低、中、高剂量干预组和MCC950干预组大鼠海马的细胞凋亡率分别为 5.50±2.13 %、38.06±12.87 %、31.33±11.57 %、22.71±7.55 %、16.43±4.25%、14.38±5.28%。AD模型组可见到大量凋亡细胞，与假手术组相比明显增多(p < 0.001)。加味不忘散低剂量干预组大鼠海马内也可见到大量凋亡细胞与 AD模型组无明显差异(p=0.623)。加味不忘散中剂量干预组大鼠海马凋亡细胞，较AD模型组明显减少(p < 0.001)，较加味不忘散低剂量干预组有减少趋势，但无显著性差异(p = 0.058)。加味不忘散高剂量干预组大鼠海马的凋亡细胞明显少于较AD模型组(p<0.001)、加味不忘散低剂量干预组(p<0.001)和中剂量干预组 (p=0.16)。MCC950干预组大鼠海马的凋亡细胞数较AD模型组明显减少(p < 0.001)，与加味不忘散高剂量干预组相比无显著差异(p= 收起