中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 贾永蕊北京大学 2004年硕士导师: 库宝善;张永鹤共73页

摘要 : 目的:对赖金丝(贯叶连翘提取物:盐酸赖氨酸=2:1)的抗炎作用及其相关机制进行研究;为研究治疗量的赖金丝对中枢神经系统、心血管系统、消化系统等有无明显副作用,进行了一般药理试验;为研究赖金丝的毒性,进行了急性毒性试验.方法:甲醛致炎试验,观察小鼠... 展开

关键词 : 赖金丝 EHPL 盐酸赖氨酸抗炎抗炎机制

2. 乳香中大环二萜类成分的抗炎活性及机制研究

[学位论文] 王璐琼烟台大学 2022年硕士导师: 赵烽;孙晓燕共70页

摘要 : 橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.及同属植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.树皮渗出的树脂，其性温，味辛、苦，有活血定痛、消肿生肌功效，用于治疗胸痹心痛、胃脘疼痛、风湿痹痛、跌打损伤、痈肿疮疡等。目前已经证明乳香所含有的化学成分具... 展开橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.及同属植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.树皮渗出的树脂，其性温，味辛、苦，有活血定痛、消肿生肌功效，用于治疗胸痹心痛、胃脘疼痛、风湿痹痛、跌打损伤、痈肿疮疡等。目前已经证明乳香所含有的化学成分具有抗炎、抗肿瘤、免疫增强和神经保护等活性，但其抗炎机制尚不明确。乳香主要化学成分为萜类，其中五环三萜，四环三萜和大环二萜居多，大环二萜类化合物多具有环内氧环、三元氧环以及乙酞氧基，为西松烷型二萜化合物。通过MTT法和Griess法对乳香中分离得到的36个萜类化合物进行了细胞毒性测试和抗炎活性初筛，其中4个大环二萜化合物（2个新化合物）无明显细胞毒性且抗炎效果显著，对4个化合物的抗炎机制进行了深入研究，以期阐明乳香中大环二萜化合物的体外抗炎活性及其分子机制，为乳香药用资源合理的开发以及临床应用提供理论依据。通过ELISA法、WesternBlot法、免疫荧光法等实验方法检测了活性化合物对LPS诱导产生的炎症中炎症因子IL-6、TNF-α释放的影响；对炎症蛋白COX-2、iNOS调节作用；以及对炎性相关的MAPKs（ERK、JNK、p38）信号通路中蛋白磷酸化，对NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解，p65蛋白核转位的影响。 ELISA实验结果表明：4个大环二萜化合物RX-1、RX-2、RX-3、RX-4均能抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症因子IL-6和TNF-α。WesternBlot实验结果显示，化合物RX-1、RX-2、RX-3、RX-4均能显著下调LPS诱导的iNOS、COX-2蛋白高表达；化合物RX-1对MAPK/ERK蛋白的磷酸化有明显抑制作用，化合物RX-2、RX-3、RX-4在高浓度时有一定的抑制作用，4个化合物对MAPK/JNK、MAPK/p38蛋白的磷酸化均无影响；对LPS诱导的NF-κB/IκB-α降解有显著抑制作用，且能抑制NF-κB/p65蛋白核转位。综上所述，化合物RX-1、RX-2、RX-3、RX-4的抗炎作用显著，其抗炎机制主要是通过抑制NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解和p65蛋白核转位，以及抑制MAPK信号通路ERK蛋白磷酸化。收起

关键词 : 乳香抗炎活性大环二萜抗炎机制 MAPK通路 NF-&kappa B通路

3. 老鼠簕生物碱A与乙酰老鼠簕生物碱A抗炎镇痛活性及抗炎机制的研究

[学位论文] 王宗英广西医科大学 2011年硕士导师: 龙盛京共64页

摘要 : 目的:研究老鼠筋生物碱A(4-羟基苯并恶唑-2-酮，4-hydroxy-2-benzoxazolone，简称HBOA)，英文名:IlicifoliusalkaloidsA(IA)及其衍生物乙酰老鼠筋生物碱A(4-乙酰氧基苯并恶唑-2-酮，4-Acetoxy-2-benzoxazolone，简称AcO-BOA)，英文名:AcetylIlicifoli... 展开目的:研究老鼠筋生物碱A(4-羟基苯并恶唑-2-酮，4-hydroxy-2-benzoxazolone，简称HBOA)，英文名:IlicifoliusalkaloidsA(IA)及其衍生物乙酰老鼠筋生物碱A(4-乙酰氧基苯并恶唑-2-酮，4-Acetoxy-2-benzoxazolone，简称AcO-BOA)，英文名:AcetylIlicifoliusalkaloidsA(AcO-IA)的抗炎镇痛作用及对小鼠的急性毒性、胃肠刺激作用，并对其抗炎作用机制进行初步研究，致力寻找一种既有良好药效又能最低限度降低毒副作用的新抗炎药。方法:采用改良寇氏法计算小鼠LD50并观察其毒性作用，采用二甲苯致小鼠耳肿胀法、小鼠热板法、腹腔注射醋酸诱导的小鼠扭体法观察其抗炎镇痛作用，采用毛细管法和剪尾法观察两个化合物对小鼠出血一凝血时间的影响，并观察连续灌胃给药对小鼠胃肠的影响。在研究抗炎作用机制的试验中，用体外人全血分析方法测定老鼠簕生物碱A及其衍生物乙酰老鼠筋A对COX-1和COX-2活性的影响。抽取健康志愿者全血标本加入钙离子载体A23187予以刺激，以阿司匹林为对照，通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血栓素B2(thromboxane，TXB2)含量考察不同浓度的老鼠簕生物碱A及其衍生物乙酰老鼠簕A对COX-1活性的影响;抽取志愿者全血经阿司匹林灭活COX-1后，予脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，以塞来昔布为对照，通过ELISA检测前列环素I2(postaglandinI2，PGI2)含量考察不同浓度的老鼠筋生物碱A及其衍生物乙酰老鼠筋A对COX-2活性的影响结果:IA的对小鼠的半数致死量即LD50值为2198.87mg/kg，其95％可信区间为1690.68mg/kg～2544.46mg/kg;AcO-IA对小鼠的LD50值为2009.43mg/kg，其95％可信区间为1113.49mg/kg～2606.47mg/kg。 NSAIDs的胃肠道的副作用与其对COX-1的抑制有关。本实验研究显示，IA和AcO-IA的100mg/kg、50mg/kg两个剂量组的胃粘膜损伤程度与同等剂量的阿司匹林(100mg/kg)相比，均小于阿司匹林，且差异显著(p＜0.05，p＜0.01)。 IA和AcO-IA灌胃给药对冰醋酸所引起的小鼠炎性疼痛有显著抑制作用，两个化合物高剂量组400mg/kg的疼痛抑制率分别为69.41％和68.04％与CMC-Na对照组相比有极显著性差异(p＜0.01)。对二甲苯所致的小鼠耳肿胀程度，IA和AcO-IA4个剂量组均能明显抑制作用，且中剂量组(100mg/kg)抑制作用与阿司匹林相似。但从小鼠热板实验结果看出两个化合物基本上无抑制热板刺激所致的小鼠疼痛反应作用。毛细管法和剪尾法测定小鼠凝血一出血时间实验显示，IA和AcO-IA均表现出抗凝现象，对小鼠凝血和出血时间起到延长作用。人全血分析实验结果显示IA和AcO-IA有效抑制全血中PGI2的升高，且成浓度依赖性。而对COX-1的表达或活性抑制实验里，只有高浓度AcO-IA组与空白对照组相比，差异有显著意义(P＜0.05)，其对COX-1的活性或表达的抑制作用不是很强。结论:按毒性分级标准两个化合物属于低毒性的药物，且均具有抗炎镇痛作用，能够减轻小鼠胃粘膜的损伤程度。IA和AcO-IA能够通过抑制COX-2的活性，减少PGI2等炎性介质的释放。收起

关键词 : 老鼠簕生物碱A 乙酰老鼠簕生物碱A 抗炎镇痛活性抗炎机制

4. 栎瘿酸的抗炎作用及机制研究

[学位论文] 陈玉芬天津医科大学 2017年硕士导师: 孔德新共89页

摘要 : 目的: 本论文利用肥大细胞及巨噬细胞研究了栎瘿酸(roburic acid)的抗炎作用及分子机制,为将此类化合物开发成抗炎新药提供初步实验依据和理论基础. 方法: 1.利用MTT比色法(MTT assay)测定栎瘿酸对骨髓来源肥大细胞(bone marrow-deriv... 展开目的: 本论文利用肥大细胞及巨噬细胞研究了栎瘿酸(roburic acid)的抗炎作用及分子机制,为将此类化合物开发成抗炎新药提供初步实验依据和理论基础. 方法: 1.利用MTT比色法(MTT assay)测定栎瘿酸对骨髓来源肥大细胞(bone marrow-derived mast cell,BMMC)、人肥大细胞(human mast cell,HMC-1)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞,mouse leukaemic monocyte macroph)不产生细胞毒性的浓度范围. 2.利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测栎瘿酸在IgE/Ag激活的BMMC内对组胺(histamine)释放、白三烯C4(leukotriene C4,LTC4)合成、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)生成的影响;检测栎瘿酸对LPS诱导的RAW264.7内IL-6生成的影响.利用免疫荧光的方法检测栎瘿酸对激活的BMMC内钙离子动员的影响. 3.利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7建立炎症反应模型,利用Griess试剂法检测栎瘿酸对一氧化氮(nitric oxide,NO)生成的影响 4.利用Western blot方法研究栎瘿酸对经IgE/Ag作用的BMMC、以及经过PM和A23187作用的HMC-1内各种信号通路蛋白包括p38、c-Jun氨基端激酶(c-jun n-terminal kinase,JNK)、胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-reg-ulated kinase,ERK1/2)、蛋白激酶B(Akt,protein kinase B)、核转录因子抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)、核转录因子(nuclear factor of kappa B,NF-κB)、细胞内磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)等的影响;并考察了栎瘿酸对经LPS作用的RAW264.7内信号蛋白p38、JNK、ERK、IκB、NF-κB等的影响. 5.利用小鼠被动皮肤过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)研究了栎瘿酸对IgE/Ag处理的小鼠耳朵内皮染色深浅及肿胀程度的影响,并利用组织切片、甲苯胺蓝染色实验观察PCA反应小鼠致敏耳朵组织内的肥大细胞数目. 结果: 1.栎瘿酸抑制IgE/Ag激活的BMMC内组胺的释放、LTC4的合成、IL-6的生成;其抑制作用是通过抑制钙离子动员,MAPKs的激活而抑制cPLA2的磷酸化,且抑制Akt/IκB/NF-κB通路的激活而实现的.另外,栎瘿酸抑制PMA和A23187诱导的HMC-1的激活,该作用是通过降低MAPKs通路的激活而抑制cPLA2的磷酸化及抑制Akt/IκB/NF-κB通路的激活而实现的,此结果与对BMMC的作用一致.此外,栎瘿酸使IgE/Ag诱导的PCA试验小鼠耳廓内皮染色蓝斑的范围变小、颜色变浅并耳朵的肿胀程度减轻,提示栎瘿酸具有良好的体内抗炎作用. 2.栎瘿酸显著抑制LPS诱导的RAW264.7内NO和IL-6的生成、iNOS的合成;下调NF-κB抑制蛋白激酶α/β(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKKα/β)的磷酸化水平,抑制IκB磷酸化及降解,继而抑制NF-κB p65的核转移.同时,栎瘿酸对MAPKs中p38和JNK的磷酸化具有抑制作用,但对ERK1/2的磷酸化未显示出明显的抑制作用. 结论: 在BMMC中,栎瘿酸抑制IgE/Ag激活BMMC内的组胺释放、钙离子动员、LTC4合成、IL-6生成,其机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活及降低p38MAPKs的磷酸化有关.另外,栎瘿酸抑制PMA及A23187激活的HMC-1内NF-κB通路的激活,且抑制p38MAPKs的磷酸化,上述结果与在BMMC内结果是一致的.在RAW264.7中,栎瘿酸抑制LPS诱导的NO及IL-6的生成,该作用可能与抑制NF-κB及MAPKs信号通路有关.PCA反应证明栎瘿酸具有较好的体内抗炎活性,提示栎瘿酸在预防和治疗炎症相关疾病具有潜在的应用价值,有望成为防治炎症的候选化合物.本课题组首次系统的报道栎瘿酸的抗炎作用及机理. 收起

关键词 : 栎瘿酸抗炎活性分子机制

5. 海洋蛇毒活性肽Hydrostatin-SN10体内外抗炎效应及其作用机制的研究

[学位论文] 张川华东理工大学 2019年硕士导师: 马兴元共66页

摘要 : 目的: TNF-α是一种重要的炎症因子，TNF-α/TNFR信号通路在炎症性疾病中扮演着重要的角色。本课题组前期利用青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选得到抗炎活性肽Hydrostatin-SN10，具有TNFR1靶点选择性。本文拟利用巨噬细胞炎症模型与IL-10基因敲除... 展开目的: TNF-α是一种重要的炎症因子，TNF-α/TNFR信号通路在炎症性疾病中扮演着重要的角色。本课题组前期利用青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选得到抗炎活性肽Hydrostatin-SN10，具有TNFR1靶点选择性。本文拟利用巨噬细胞炎症模型与IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型，研究Hydrostatin-SN10的体内外抗炎作用，并探讨其抗炎作用机制。方法: 1、体外细胞模型RAW264.7和BMDM评价Hydrostatin-SN10的抗炎效果:CCK-8检测LPS诱导的RAW264.7细胞增殖活性;Griess试剂、RT-PCR检测LPS诱导的RAW264.7与BMDM细胞的NO生成、炎症因子的表达水平。 2、Hydrostatin-SN10抗炎机制的研究:Western Blot技术检测IκB-α的水平;免疫荧光技术检测NF-κB的核转移水平;RT-PCR检测NF-κB调控基因的表达水平。将未标记的Hydrostatin-SN10、重组TNF-α、抗TNFR1单抗分别与已结合荧光标记Hydrostatin-SN10的细胞孵育1h后，观察荧光强度。 3、IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型评价Hydrostatin-SN10体内抗炎效果:建立IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型后，观察Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药后小鼠体重、结肠长度与脾重指数变化，评价其对小鼠结肠炎症状的影响;HE染色观察小鼠结肠组织病理情况;免疫组化观察小鼠结肠组织中TNF-α水平与Treg细胞。结果: 1、Hydrostatin-SN10体外抗炎效果:RAW264.7炎症细胞模型结果表明:Hydrostatin-SN10(100μg/mL)能抑制LPS诱导的细胞增殖活性，且本身不具有细胞毒性;也能抑制LPS刺激的NO生成以及炎症因子的表达;原代巨噬细胞BMDM炎症细胞模型结果表明:Hydrostatin-SN10(100μg/mL)能抑制LPS诱导的NO生成与炎症因子表达水平。 2、Hydrostatin-SN10抗炎机制:Hydrostatin-SN10(100μg/mL)能很好的抑制TNF-α诱导的IκB-α的降解、NF-κB的核转移以及其下游调控基因的表达水平;荧光标记Hydrostatin-SN10结果表明Hydrostatin-SN10能与细胞表面的TNFR1结合。 3、Hydrostatin-SN10体内抗炎活性效果:IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型结果表明:Hydrostatin-SN10（800μg/kg）给药组小鼠体重明显增长，结肠长度增加，脾重指数也有所缓解，疾病症状明显得到改善;HE染色结果表明:Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药组的结肠黏膜完整性明显增加，隐窝排列完整;免疫组化结果表明:Hydrostatin-SN10（800μg/kg）给药组的小鼠结肠组织中TNF-α水平明显下降，Treg细胞水平增加。结论: Hydrostatin-SN10具有明显的体内外抗炎活性，且Hydrostatin-SN10能结合细胞表面的TNFR1，从而抑制TNF-α的生物活性。收起

关键词 : 活性肽抗炎效应分子机制

6. 甘桔汤总皂甙抗炎作用及其机理研究

[学位论文] 齐云成都中医药大学 1999年博士导师: 沈映君共31页

摘要 : 甘桔汤是中医临床治疗咽喉肿痛的常用祖(剂),本论文通过对该方应用历史及化裁方适应下的研究,确定以抗炎为该方药理研究的突破口,选定以甘桔泌总皂甙(Ganjietang Total Saponins,简称GJTTS)为研究对象,采用放射免疫、荧光分光、紫外分光、酶联免疫和高... 展开

关键词 : 甘桔汤甘桔汤总皂甙抗炎抗炎机理

7. 人羊膜治疗家兔皮肤Ⅲ度烧伤的作用与抗炎机制研究

[学位论文] 惠学玲遵义医学院 2013年硕士导师: 赵春华；余丽梅共41页

摘要 : 目的:探索人羊膜治疗家兔皮肤Ⅲ度烧伤的作用和抗炎机制。方法:热铜棒烫伤致兔腹背部皮肤Ⅲ度烧伤。切痂后，左侧创面分别帖敷新鲜人羊膜、涂抹rhEGF凝胶，右侧创面仅涂生理盐水。观测烧伤创面愈合率和创面痊愈时间，并行创面组织病理学检查。E... 展开

关键词 : 羊膜烧伤抗炎机制创面愈合率

8. 长梗瑞香的活性成分研究

[学位论文] 许文争上海交通大学 2008年硕士导师: 张卫东;金慧子共73页

摘要 : 我国瑞香科瑞香属植物约有44种,资源丰富。该属中多种植物韧皮纤维发达，可供制造高级纸张及作为人造棉的原料，有些种类经引种庭园栽培，是较好的观赏植物，少数种类可供药用。瑞香科瑞香属植物黄瑞香（Daphne giraldii Nitsche），唐古特瑞香... 展开我国瑞香科瑞香属植物约有44种,资源丰富。该属中多种植物韧皮纤维发达，可供制造高级纸张及作为人造棉的原料，有些种类经引种庭园栽培，是较好的观赏植物，少数种类可供药用。瑞香科瑞香属植物黄瑞香（Daphne giraldii Nitsche），唐古特瑞香（D. Tangutica Maxim.），凹叶瑞香（D. Retusa Hemsl.），长白瑞香（D. Koreana Nakai）为我国著名传统中药祖师麻入药品种。祖师麻民间广泛用于治疗疼痛、跌打损伤、风湿性关节炎和支气管炎等。长梗瑞香(Daphne pedunculata H. F. Zhou ex C. Y. Chang)，瑞香科瑞香属植物，常绿直立灌木。为了找到有药理活性的化合物，为瑞香科瑞香属植物研究及植物开发利用提供物质基础,本文采用抗炎镇痛活性跟踪指导分离的方法研究了长梗瑞香的化学成分，同时讨论了部分单体化合物的抗炎镇痛活性和抗炎机制。本课题以采自云南安宁的长梗瑞香茎皮为研究对象，从其中分离得到45个化合物，运用光谱分析技术IR，EI-MS，ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR等鉴定了其中的34个化合物，分别为：CG-1：β-谷甾醇CG-2：胡萝卜苷CG-3：对羟基苯甲酸CG-4：对羟基苯甲酸乙酯CG-5：正十二烷CG-6：瑞香素CG-7：7-甲氧基-8-羟基香豆素CG-8：正十二烷醇CG-9：7-甲氧基香豆素CG-10：伞形花内酯CG-11：正十八烷醇CG-12：双白瑞香素CG-13：2-甲基四十三烯CG-14：正二十八烷醇CG-15：瑞香新素CG-16：异瑞香新素CG-17：左旋松脂酚CG-18：HorsfieldinCG-19：丁香松脂酚CG-20：瑞香酮CG-21：芹菜素CG-22：瑞香醇酮CG-23：木犀草素CG-24：芫花素CG-25：紫丁香苷*CG-26：3-（3-羟基-4-丙酸乙酯基-苯基）-氧-6-甲氧基-7-羟基香豆素CG-27：瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷CG-28：瑞香苷CG-29：伞形花内酯-7-O-β-D-葡萄糖苷CG-30：双白瑞香素-7-O-β-D-葡萄糖苷CG-31：3',7-二甲氧基-木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷CG-32：7-甲氧基-木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷CG-33：芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷CG-34：芫花苷其中CG-26为新化合物，其余全部为首次从该植物中分得到。药理活性筛选：以阿司匹林为阳性对照药，对长梗瑞香的总提物及其各萃取部位进行了抗炎和镇痛的活性筛选实验。实验结果表明总提物、石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位高低剂量组，乙酸乙酯的高剂量组对二甲苯引起的耳肿胀有明显的抑制作用；长梗瑞香石油醚，乙酸乙酯高低剂量组，总提物高剂量对醋酸引起的小鼠疼痛有明显的抑制作用，具有良好的镇痛作用。以氢化可的松为阳性对照药，选择单体成分进行了抗炎镇痛活性筛选，实验结果表明CG-6，CG-10，CG-22能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，显示一定的抗炎活性。考察了CG-22对RAW264.7巨噬细胞NO代谢的影响，石油醚和乙酸乙酯部位对腹膜巨噬细胞PGE2代谢的影响。实验结果表明抗炎活性较好的单体CG-22浓度依赖性地抑制RAW264.7巨噬细胞NO的生成，镇痛活性良好的石油醚和乙酸乙酯部位依赖性地抑制腹膜巨噬细胞PGE2的生成。收起

关键词 : 韧皮纤维活性成分抗炎镇痛活性化学成分抗炎机制药理活性活性筛选

9. 海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrosttin-SN1的结构优化和抗炎机制研究

[学位论文] 江海龙第二军医大学 2016年硕士导师: 陆一鸣共60页

摘要 : 蛇毒成分复杂，含有丰富的活性肽和蛋白，这些蛋白和多肽类活性物质具有广泛的毒理和药理作用，其中就包括抗炎和免疫调节作用，但具体哪些成分起作用尚未有报道且机制更少有研究。中医自古就有以蛇入药治疗类风关等自身免疫疾病的历史，而青环海蛇作... 展开蛇毒成分复杂，含有丰富的活性肽和蛋白，这些蛋白和多肽类活性物质具有广泛的毒理和药理作用，其中就包括抗炎和免疫调节作用，但具体哪些成分起作用尚未有报道且机制更少有研究。中医自古就有以蛇入药治疗类风关等自身免疫疾病的历史，而青环海蛇作为我国珍贵的药用资源，是李时珍著《本草纲目》收集入药的17种蛇中的其中一种，已广泛用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、屈伸不利、皮肤瘙痒、体虚和小儿营养不良等病症。海蛇提取物多次被证明对免疫系统具有双向调节作用，对大鼠佐剂诱导的关节炎、巴豆油诱导的耳肿胀、醋酸致小鼠疼痛都有一定的治疗效果，临床上使用复方海蛇胶囊改善大脑认知功能障碍和风湿性关节炎，这些研究结果都表明海蛇中的活性物质具有抗炎作用。但其抗炎活性成分及其作用机理未明，且作为海洋生物活性物质，其分子结构有可能是最佳效力结构，能够为我们提供药物合成和筛选的导向。本课题组在前期工作基础中，利用噬菌体展示技术以人重组肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(hrTNFR1)为底物淘选青环海蛇蛇毒毒腺T7噬菌体展示文库，获得了一种靶标特异的活性肽(Hydrostatin-SN1)，体外结合实验表明:Hydrostatin-SN1能够与TNF-α的两种受体结合，BIAcore分析显示与TNFR1、TNFR2的结合解离常数分别为32μM和220μM，能显著改善小鼠急性结肠炎模型和小鼠急性休克模型的疾病进展。但SN1作为22个氨基酸的多肽，结构比小分子大、合成成本高;与传统抗体药物相比分子量小、半衰期短、易降解，而且结合能力弱，这些缺点制约了SN1的应用性。为进一步探究SN1是否含有与TNFR1特异性结合的关键序列，以便有针对性地对SN1进行结构优化以更好地选择性结合单一受体、提高活性、延长作用时间等，为研发选择性肿瘤坏死因子受体拮抗剂奠定基础。目的: 分析Hydrostatin-SN1中与TNFR1特异性结合的关键序列;通过结构优化获得活性更强的多肽;评价多肽在体内外的抗炎效果。方法: 1、使用结构模拟在线服务器对Hydrostatin-SN1的生物信息学进行分析，利用Discovery Studio2.5软件包中的Builder程序，以从头搭建的方法展示短肽。利用蛋白分子对接(Dock proteins)的方法模拟短肽与TNFR结合后所形成的复合物的结构，通过分子力学与分子动力学优化后，获得SN1与TNFR1的结合构象。分析构象中的结合位点，确定SN1与受体结合的关键序列，同时获取构象中氨基酸的作用方式及结合能量。 2、通过MTT方法分析短肽抑制TNF-α介导的细胞毒效应以初步筛选有活性的短肽，在体内应用LPS诱导的急性休克模型初步验证短肽的抗炎效果，分析这些短肽与SN1在序列上的关系。 3、蛋白质相互作用仪（BIAcore）分析短肽与TNFR1的结合能力，ELISA检测其与TNF-α竞争性结合TNFR的能力。 4、体外分析SN10对TNF-α激活HEK293A细胞的阻断作用，RealTime-PCR检测TNF-α诱导IL-8表达的变化，WesternBlot分析细胞中NFκB和MAPKs信号通路的变化。体内采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型进一步研究其抗炎效应和作用机制。 5、为提高多肽的半衰期和结合TNFR1的效价，决定构建SN10与人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白表达载体，利用真核和原核系统表达目的蛋白，在体外检测其拮抗TNF-α诱导的细胞毒效应。 6、为增强SN10对TNF-α的拮抗效应，将SN10与TNF-α拮抗肽WQ9的部分序列结合，形成突变肽SN12(DEFHLELHLYQSW)并分析SN12的体外抗TNF活性。结果: 1、根据分子对接的结果，按照均分片段法截短22个氨基酸的Hydrostatin-SN1，使用MTT方法检测各截短多肽抑制TNF-α的细胞毒效应，发现SN10的抑制率显著高于其他截短多肽(p＜0.05)，同时SN10能显著提高LPS诱导的急性休克模型中小鼠的生存率。提示DEQHLETELH是SN1结合TNFR1的一段核心序列。 2、通过RT-PCR技术检测HEK-293A细胞中IL-8的变化，结果表明SN10在10-20μM的剂量范围内能剂量依赖地抑制IL-8的表达。BIAcore证实SN10与TNFR1有结合能力(Kd=2.775μ M)，但竞争性结合实验却显示SN10不能直接抑制TNF-α与TNFR的结合。为验证SN10结合TNFR1后能否影响TNF-α激活的下游通路，通过Western blot技术分析了SN10对TNF-α诱导的NFκB和MAPK通路的影响，SN10对IκB、P38和ERK的磷酸化有显著的抑制作用。 3、采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型，探讨SN10的体内抗炎效应，发现SN10治疗组的小鼠急性结肠炎各项病征，如体重变化、结肠炎相关疾病活动指数、结肠长度变化等都要好于模型组。HE染色结果表明SN10能改善结肠的炎症程度和病变范围，Real-time PCR结果证实它对结肠组织中相关促炎因子的表达具有抑制效果。结肠组织中NF-κB及MAPKs信号通路的变化进一步说明SN10作为一种TNFR1结合肽，对TNF-α激活相关炎症信号通路的下调作用，从而起到减轻和治疗炎性肠道疾病。 4、为了增强SN10结合TNFR的效价并延长其半衰期，我们构建了SN10与hIgG-Fc原核和真核表达载体，对原核表达蛋白做了初步纯化，初步纯化的蛋白在100μg/ml的高浓度下能提高L929细胞的存活率(p＜0.05)。收集并检测不同时间点真核细胞表达的上清，真核表达的融合蛋白能在1-5μg范围内剂量依赖地抑制TNF-α介导的细胞毒作用。 5、将SN10的序列与WSQYL结合后获得多肽SN12，SN12的抗TNF细胞毒效应强于单独的SN10和WSQYL，能显著抑制TNF-α和TNFR的结合，显著下调TNF-α诱导的内皮细胞趋附分子ICAM和炎症因子IL-8的表达，抑制NFκB和MAPK通路的激活。结论: 对海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1的结构进行模拟分析，通过序列比对后截短多肽，利用MTT法检测细胞毒抑制效应，筛选获得10个氨基酸的短肽SN10。BIAcore证实SN10与TNFR1具有结合能力，体内外实验显示SN10具有一定的抗炎活性，机制主要通过抑制Ⅰ型受体下游通路的激活，从而影响炎症因子的表达。此外，将SN10与人免疫球蛋白IgG的Fc片段连接形成融合蛋白能提高其抗TNF-α活性，将SN10与WSQYL序列结合后获得突变肽SN12也进一步增强其抗炎效应。这些发现拓展了我们对海蛇蛇毒多肽抗炎机理的认识，也是寻找和改造TNFR1抑制剂的一次尝试。收起

关键词 : 海蛇蛇毒抗炎活性肽肿瘤坏死因子Ⅰ型受体抗炎机制实验药理

10. 复方芒果叶干膏抗肺纤维化作用及抗炎机制研究

[学位论文] 刘颖成都中医药大学 2017年博士导师: 邓家刚共154页

摘要 : 肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是一种由多种因素引起的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。该病的主要病理特点是早期以下呼吸道急性炎症反应为主，并伴随着大量成纤维细胞病理性增生转型，导致后期某些细胞外基质(E... 展开肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是一种由多种因素引起的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。该病的主要病理特点是早期以下呼吸道急性炎症反应为主，并伴随着大量成纤维细胞病理性增生转型，导致后期某些细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分在肺泡和间质内沉积，纤维组织过度修复造成肺组织结构的紊乱、肺泡损伤、胶原沉积，最终导致肺纤维化。随着工业化的发展，肺纤维化发病率呈逐年上升趋势，因其缺乏有效的治疗手段，预后差、死亡率高，严重危害人类健康与生命。肺纤维化的发病机制欠清晰，其中炎症反应、免疫反应和胶原沉积是对肺纤维化发病机理的重要诠释。目前临床上以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主，但只能在一定程度上缓解某些症状，不能从根本上逆转和治疗，也不能防御肺纤维化，并有不同程度的毒副作用。对于肺纤维化，中医药以其丰富的临床用药经验以及多成分、多靶点、多通路治疗手段为特点，近年来受到了国内外学者的重视。复方芒果叶(Compound mango leaves，CML)干膏系广西终身教授、名中医邓家刚主任医师根据多年临床经验拟定的治疗肺纤疾患的复方。本研究以复方芒果叶干膏为研究对象，采用博莱霉素(Bleomycin，BLM)介导的肺纤维化动物模型对其相关病理学、细胞因子、差异蛋白等进行药效与机制的探讨，并利用细胞炎症模型筛选复方芒果叶干膏有效抗炎物质及研究复方对肺纤维化相关的炎症通路的作用。主要研究内容和结果如下： 1、复方芒果叶干膏抗肺纤维化药效研究：运用BLM气管注射法建立小鼠肺纤维化模型，观察小鼠的整体情况、病理表现以及检测肺组织中羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)、相关细胞炎症因子、相关抗氧化应激因子的表达水平，从体内水平上对复方芒果叶干膏抗炎、抗氧化以及抗纤维化药效进行评价。结果显示，复方芒果叶干膏高剂量组小鼠呼吸逐渐平稳、活泼好动、毛色整齐有光泽、进食正常、体重逐渐上升，中、低剂量组均有好转。另外，复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织的肺指数均显著性降低(P＜0.001)。以上提示：复方芒果叶干膏从整体水平上对肺纤维化小鼠的状态和肺组织具有保护作用。病理观察发现，苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)观察模型组肺组织结构破坏严重，损伤分布较广，部分支气管腔和肺泡腔内可见大量炎性渗出物，中度至重度肺泡炎伴纤维组织增生及纤维化致肺实变，给药组肺组织结构清晰、形态正常，肺泡炎和肺纤维化明显减少，未见弥漫性的炎症和纤维化，肺泡间隔增厚不明显。Masson染色可见高剂量组的纤维化程度明显减少，中、低剂量组纤维化程度亦相应减少。另外Szapiel评分结果显示复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织的肺泡炎程度均显著性降低(P＜0.001)，Ashcroft评分结果显示复方芒果叶干膏高、中剂量组小鼠肺组织的纤维化程度均显著性降低(P＜0.001)。此外，经过药物干预后，复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织中HYP含量显著性降低(P＜0.001)。以上提示：复方芒果叶干膏具有保护肺组织，明显降低肺泡炎、胶原沉积以及肺纤维化的作用。抗炎和抗氧化研究作用发现，复方芒果叶干膏高剂量组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均显著性降低(P＜0.001或P＜0.01)；中剂量组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α的含量均显著性降低(P＜0.001或P＜0.05)。复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平显著性降低(P＜0.001)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)水平均显著性升高(P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05)；高、中剂量组小鼠肺组织中还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)水平显著性升高(P＜0.001)。结果提示：复方芒果叶干膏对肺纤维化具有良好的抗炎和抗氧化作用。 2、复方芒果叶干膏抗肺纤维化机制研究：运用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)蛋白组学技术对肺纤维化小鼠肺组织进行差异蛋白的定量分析，通过基因本体论(Gene Ontology， GO)、蛋白相邻类的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG)、Pathway等功能注释以及富集分析来对复方芒果叶干膏抗肺纤维化的机制进行研究。研究结果显示，参与复方芒果叶干膏治疗肺纤维化的差异蛋白有1700多个，存在于细胞外区、细胞外间隙、细胞外基质、细胞膜、核小体等细胞组分，具有肽酶调节活性、酶活抑制、分子结构活性、钙离子结合等分子功能，并参与防御反应、炎症反应、免疫反应、凝血系统调节等生物过程。复方芒果叶治疗肺纤维化的机制可能是通过影响Itgb1、FGF1等73个主要差异蛋白分别作用于PI3K-Akt、Focal adhesion等26条通路发挥作用，并分别与炎症反应、免疫反应、细胞外基质沉积、肌肉收缩以及氧化应激等生物过程相关。以上提示：肺纤维化的发病机制是一个多靶点蛋白、多信号转导通路、多生物功能因素共同构建的复杂生物过程。复方芒果叶可能从抗炎、调节免疫、减少细胞外基质沉积、缓解肌肉收缩以及抗氧化等生物功能方面对肺纤维化进行治疗。 3、复方芒果叶干膏化学物质组研究：本研究采用超高效液相联用四级杆串联飞行时间质谱(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-of-Flight/Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS)分析技术，根据全扫描质谱图一级质谱中测定得到的准分子离子峰，结合二级质谱中的碎片信息分析这些化合物的质谱裂解特征，并推测化合物可能的结构式，以此对复方芒果叶干膏的整体化学物质基础进行研究。本研究表征分析出48个化学成分，其中皂苷类化合物26个，二苯甲酮类化合物10个，黄酮类化合物3个，酚酸类化合物5个，蒽醌类化合物3个，香豆素类化合物1个。 4、复方芒果叶干膏抗炎物质筛选研究及机制预测：本研究利用肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞炎症模型和建立UPLC/Q-TOF结合双荧光素酶报告基因系统的筛选核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)抑制剂的分析方法，从细胞水平上对复方芒果叶干膏的抗炎活性成分进行筛选鉴定。利用PharmMapper、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)等生物信息手段对鉴定出的抗炎物质进行网络药理学研究，预测分析其靶点蛋白和作用通路。最后运用双荧光素酶和酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)等检测方法对抗炎成分芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1进行活性验证和协同作用研究。结果显示，复方芒果叶干膏共筛选出16个抗炎成分，包括鸢尾酮酚-3-C-β-D-葡萄糖苷、没食子酸甲酯、芒果苷、鸢尾酮酚-3-C-(2-O-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷、2,4’,6-三羟基-4-甲氧基苯甲酮-3-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、补骨脂素、大黄素甲醚、三七皂苷R2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rc、甲基异茜草素-1-甲醚、三七皂苷K。16个抗炎成分分别通过HRAS、MAP2K1等40个靶点作用于炎症反应相关的MAPK、Focal adhesion等11条通路，其中与复方芒果叶干膏关联性比较高的抗炎通路为MAPK、Focal adhesion、VEGF等通路。以上提示：复方芒果叶干膏是通过多成分、多靶点、多通路来发挥其抗炎作用。选择MAPK通路进行进一步研究，网络药理图显示，芒果苷(Mangiferin)、补骨脂素(Psoralen)、人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)三个化合物与MAPK通路相关，其中芒果苷作用于HRAS、FGFR1；人参皂苷Rg1作用于MAP2K1、BRAF，补骨脂素作用于MAP2K1、FGFR1。活性验证研究显示，芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1可显著性降低细胞中NF-κB、白细胞介素(IL)-6、IL-8的表达水平(P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05)。结果提示：芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1可分别通过MAPK通路发挥其炎症抑制作用。协同增效作用研究显示，芒果苷与人参皂苷Rg1协同作用后NF-κB表达水平明显低于芒果苷或人参皂苷Rg1单独给药(P＜0.01)；芒果苷与补骨脂素协同作用后IL-6表达水平明显低于芒果苷单独给药(P＜0.01)；补骨脂素与人参皂苷Rg1协同作用后NF-κB、IL-6、IL-8表达水平明显低于补骨脂素或人参皂苷 Rg1单独给药(P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05)。结果提示：芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1具有良好的协同抗炎作用。总结：本文首先从整体动物水平上初步证明复方芒果叶干膏具有保护肺组织损伤、抗肺纤维化的作用，其中抑制胶原沉积、抗炎均可能是其发挥药效的作用机制。其次从蛋白水平上阐释复方芒果叶干膏通过多靶点、多通路、多因素发挥治疗肺纤维化的生物学机制,其中抗炎信号通路与治疗肺纤维化关联性最大。再次利用UPLC-Q-TOF/MS分析技术对复方芒果叶干膏进行化学成分表征分析。然后从细胞水平上阐明了复方芒果叶干膏的抗炎物质基础,证明其所含的成分具有“协同所用”。最后,复方芒果叶干膏“成分-靶点-通路”的关联性提示其治疗肺纤维化的机制是一个复杂的的生物过程。所以,本研究具有重要的意义和应用前景,后续将按创新药物的要求进一步细化研究方案,以期将该有效组方开发成国家六类新药。收起

关键词 : 复方芒果叶干膏抗肺纤维化作用抗炎机制