中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 高诗娟北京协和医学院(中国医学科学院) 2006年博士导师: 高友鹤共429页

摘要 : Erbin(ErbB2 interacting protein)可通过其PDZ结构域介导ErbB2定位到上皮细胞基底外侧膜。为了深入研究Erbin PDZ结构域的配体识别特性，本实验以ErbinPDZ为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统来筛选新型随机多肽文库Ⅱ。研究发现，除了报道的Ⅰ类配体-[E/D... 展开

关键词 : PDZ Erbin 酵母双杂交随机多肽文库磷酸化酪氨酸病理生理学

2. 高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的建立及其应用

[学位论文] 宋婀莉北京协和医学院(中国医学科学院) 2007年博士导师: 高友鹤共213页

摘要 : 结构域是蛋白质相互作用研究的一个简单高效的入手点在蛋白质组学规模上研究蛋白质相互作用网络是全面了解蛋白质功能、揭示疾病发病机制的有效手段之一。节点蛋白在相互作用网络中占据关键位置，在生命调控机制中发挥重要功能，可作为研究相互作用网... 展开结构域是蛋白质相互作用研究的一个简单高效的入手点在蛋白质组学规模上研究蛋白质相互作用网络是全面了解蛋白质功能、揭示疾病发病机制的有效手段之一。节点蛋白在相互作用网络中占据关键位置，在生命调控机制中发挥重要功能，可作为研究相互作用网络的一个有效突破点。很多蛋白由单个或多个结构域组成；绝大多数蛋白质相互作用是通过相互作用结构域(如PDZ，SH2，WW，SH3等)与其识别模体的结合完成的。深入研究节点蛋白的相互作用结构域，不仅可以了解详细的相互作用分子机制，为蛋白质相互作用的药物研发提供理论基础，而且可以在全蛋白质组水平上发现其所有的潜在配体蛋白，绘制以节点蛋白的相互作用为骨架的蛋白质相互作用网络图，从而系统地揭示蛋白质在复杂体系中的多样功能。本研究中，我们以最重要的蛋白质相互作用结构域之一的PDZ结构域作为入手点，建立了高效研究结构域结合特性的新策略，全面系统地研究了数个PDZ结构域的结合特性，发现了它们潜在的新配体蛋白。研究结果表明，PDZ结构域的结合特性同时具有较强的规律性和一定的多样性。由于我们研究的PDZ在多种组织和细胞结构中均有各种功能的潜在新配体被发现，提示PDZ蛋白在不同的体系中执行不同的功能具有生物化学基础，可能是一个相当普遍的现象。PDZ蛋白潜在的多功能性超过了我们的预期。我们猜想可能许多具有常见蛋白质相互作用结构域的蛋白也会具有超过我们以往估计的配体数量和功能多样性。这个猜想需要更多结构域的系统研究方法和大规模研究才能证实。高效研究多肽结合结构域(peptide-binding domain)结合特性新策略的提出近年来常用的高通量研究结构域的方法主要有定向肽库(oriented peptidelibrary)、SPOT合成、噬菌体展示(phage display)和酵母双杂交(yeast two-hybrid)等。但是这些传统方法都是针对某一个特定结构域所进行的大规模筛选，相对费时费力。为了适应于在蛋白质组学规模上研究结构域的结合特性、提高研究通量和效率，我们提出了一种高效地验证性筛选目的结构域结合配体文库的新研究策略。先用目的结构域家族中有代表性的成员筛选随机多肽文库，收集得到的阳性克隆构建成一个配体库，其它成员直接验证筛选配体库研究其识别特性。根掘验证筛选得到的阳性和阴性结合序列推知识别规律，再以此识别规律在蛋白质数据库中预测潜在的天然配体，最后在酵母双杂交系统中验证并发现新的配体蛋白。如果直接验证筛选配体库得到的阳性配体数量不足以得出某个结构域的识别特性，该结构域就从头筛选随机多肽文库，所获得的新阳性克隆添加到配体库，作为对配体库的补充，可提高以后通过直接验证筛选来研究此类PDZ的效率。另外在验证预测的天然配体时，构建的克隆也添加到配体库中，这也是对配体库的重要补充，这样直接验证筛选就有可能找到新的配体蛋白。验证筛选体系最大的优点是，与传统筛选相比研究效率得到了极大的提高，而且整个体系是动态发展的，配体库会在体系的应用过程中不断得到补充，扩充后的配体库又会进一步提高研究效率。高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的建立我们首先将验证筛选的研究策略应用于PDZ结构域结合特性的研究。首先，我们收集ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ筛选随机多肽文库得到的阳性克隆，构建成一个初始的配体库。通过验证筛选该配体库快速研究了HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的识别特性。MAGI3 PDZ4等PDZ通过验证筛选没有得到满意的结果，因此从头筛选随机多肽文库研究其结合特性，并将得到的阳性克隆补充到配体库中，作为对配体库的补充和发展。在验证筛选体系建立和初步发展的过程中，我们对上述目的PDZ结构域的结合特性进行了详细的分析。研究结果不仅涵盖了以往大规模研究方法报道的结果，而且还发现了新的PDZ结构域识别特性，即：ZO-1 PDZ3在配体．5位偏好疏水性氨基酸，ZO-1PDZ3、LNX1 PDZ2和MAG13 PDZ4在配体的0位可选择极性氨基酸，除MAGI3 PDZ4外的五个PDZ在配体-1位都强烈偏好芳香族氨基酸，除ZO-1 PDZ3和：MAGI3 PDZ4外的四个PDZ都可识别Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型的PDZ配体，HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的选择特异性都呈现出一定的前后氨基酸之间的连锁关系。这些新的PDZ结合特性的揭示，为PDZ结构域的重新定义和分类提供了有价值的信息。同时，我们发现了以此六个目的PDZ结构域为节点的40对新的蛋白质相互作用，为深入研究这些PDZ蛋白的生物学功能提供了重要线索。 ●高效研究多肽结合结构域结合特性新策略的应用 LNX蛋白是第一个被发现的含有PDZ结构域的RING类型的泛素连接酶E3，但是其PDZ结构域的生物学功能还不清楚。为了揭示LNX PDZ结构域的功能，我们应用已建立的高效验证筛选体系对人类LNX家族的4个蛋白含有的9个PDZ结构域的结合特性和相互作用蛋白进行了系统的研究。 LNX1 PDZ1、LNX1 PDZ2、LNX1 PDZ3、LNX2 PDZ2和LNX4 PDZ通过验证筛选和/或随机多肽文库筛选得到的阳性配体在C末端呈现明显的规律，经分析发现这5个PDZ结构域的结合特性有共性但也有显著的不同。同时，我们发现了LNX家族PDZ结构域之间的三对相互作用，即：LNX1 PDZ1和LNX1 PDZ4、LNXl PDZ1和LNX2 PDZ4、LNX2 PDZ1和LNX2 PDZ4之间的相互作用。另外，根据总结的LNXPDZ结构域的识别规律，我们在人类蛋白质组水平上发现了新的LNX配体蛋白。这些配体蛋白种类多样且分布广泛，提示LNX可能在多种复杂体系中发挥多样的功能。同时，在PDZ结构域高效验证筛选体系应用的过程中，我们对原PDZ配体库又补充了新的配体，这是对配体库的再次发展，将会使验证筛选体系的高效性在更大规模的PDZ结构域研究中得以体现。 ● Liddle综合症分子治疗的初步探索 Liddle综合症是一种上皮细胞钠离子通道相关的遗传性疾病，是1963年由Liddle等人首先发现的一种常染色体显性、盐敏感型的高血压综合症。Liddle综合症的分子发病机制现已较为明确地认为是上皮钠离子通道(epithelial Na收起

关键词 : 蛋白质相互作用多肽结合结构域 PDZ结构域酵母双杂交 LNX蛋白 Liddle综合症遗传性疾病分子治疗发病机制

3. 离体大鼠肝脏灌流液蛋白质组研究

[学位论文] 张扬北京协和医学院(中国医学科学院) 2009年博士导师: 高友鹤共164页

摘要 : 离体大鼠肝脏灌流是一项广泛应用于肝脏生理功能研究的技术，在合适的灌流条件下，灌流肝脏可在一定的时间窗内保持结构完整。蛋白质组学技术具有大规模、高通量的特点。本论文第一部分将这两种技术结合，尝试在器官水平上全面完整地研究肝脏的分泌功... 展开离体大鼠肝脏灌流是一项广泛应用于肝脏生理功能研究的技术，在合适的灌流条件下，灌流肝脏可在一定的时间窗内保持结构完整。蛋白质组学技术具有大规模、高通量的特点。本论文第一部分将这两种技术结合，尝试在器官水平上全面完整地研究肝脏的分泌功能。在该类型研究中，主要有两大问题：一是如何保持肝脏器官的结构完整，二是控制灌流液中的血污染。我们一方面调整并控制了器官灌流条件来减少灌流损伤和降低血污染，另一方面以灌流液中的谷_内转氨酶量来评判肝脏损伤情况，以灌流液中的免疫球蛋白IgG量作为灌流液血污染程度的指标。我们选取谷丙转氨酶水平较低和肉眼观没有明显血污染的灌流液进行了后续研究。同时Western Blot和后续的质谱鉴定均显示灌流液中的IgG水平较低，提示灌流液中血污染较少。应用二维毛细管液相色谱（强阳+反相）与质谱联用方法，在鉴定假阳性率约1％的基础上，共获得了886个灌流液蛋白鉴定。在这些蛋白中有423个蛋白被Swiss-Prot注释，其中分泌蛋白的比例相对于肝脏全组织蛋白组数据有高达5倍的富集；在富集指数方法富集的部分，分泌蛋白的比例则有约10倍的富集。应用信号肽预测方法和富集指数方法，我们共获得357个可能分泌蛋白，其中有49个非经典途径分泌蛋白被富集指数方法以较高可信度富集。在这些分泌蛋白中，我们发现有71个蛋白参与信号传导通路，其中61个蛋白在胞外发挥作用。通过对这些蛋白的功能分析，我们实现了在器官水平和蛋白质组学广度上研究肝脏分泌功能。灌流液含有在灌流条件下器官水平的组织间隙液蛋白，其富含疾病标志物。正常大鼠肝脏灌流液蛋白中胞内蛋白部分为肝脏灌流损伤所致。在这些蛋白中，我们发现许多蛋白有文献报道与损伤相关或已为肝脏损伤标志物。我们认为在离体器官灌流液中寻找潜在的标志物而在血液或尿液中进行验证，可能是寻找疾病标志物的较好策略。在论文的第二部分，我们建立了Walker-256肿瘤细胞肝脏转移模型，通过比较模型组与对照组之间的离体大鼠肝脏灌流液的差异，获得了该肿瘤细胞转移后肝脏灌流液中的差异蛋白。结果显示：110个蛋白在模型组中增高，其中分泌蛋白为46个；70个蛋白在模型组中降低，分泌蛋白为60个。下降的蛋白主要为分泌蛋白且为常见的肝脏分泌蛋白，提示肿瘤转移后肝脏的分泌功能下降，这可能与Walker-256转移所致恶液质有关。我们挑取了4个在灌流液中明显增高的蛋白，应用Western、Blot方法在血清中进行验证，拟探讨离体大鼠肝脏灌流液在肝脏疾病标志物研究中的价值。收起

关键词 : 离体肝脏灌流分泌蛋白组肝脏分泌功能疾病标志物

4. 两种高效研究泛素连接酶底物的新策略

[学位论文] 郭正光北京协和医学院 2012年博士导师: 高友鹤共163页

摘要 : 泛素化是真核生物中最重要的翻译后修饰之一。泛素化过程除了参与蛋白酶体降解之外，还参与调节许多生物学过程，包括细胞内转运，DNA修复，信号传导和蛋白质蛋白质相互作用。泛素化过程通过多步酶促级联反应实现。在这一过程中，泛素连接酶(E3)决定了... 展开泛素化是真核生物中最重要的翻译后修饰之一。泛素化过程除了参与蛋白酶体降解之外，还参与调节许多生物学过程，包括细胞内转运，DNA修复，信号传导和蛋白质蛋白质相互作用。泛素化过程通过多步酶促级联反应实现。在这一过程中，泛素连接酶(E3)决定了泛素化底物识别的特异性。然而多数E3的底物尚不清楚。鉴定这些底物是当前泛素化研究的主要难点。目前，多数底物的是在不同实验室用不同的方法逐一鉴定出来的，需要更好，更快，更经济的高通量方法鉴定E3底物。目前已经有几种高通量研究E3底物的方法，包括，1.利用蛋白质芯片作为底物高效筛选E3底物;2.体内（in vivo）非标记定量或SILAC(Stable IsotopeLabeling by Amino Acid)标记定量质谱的方法;3.体内GPSP(Global ProteinsStability profiling)的方法。在本研究中，我们建立了与上述方法不同的两种较高通量鉴定泛素连接酶底物的新策略。许多E3特异性识别底物是通过他们的蛋白质相互作用结构域实现的，在本论文的前一部分，我们建立了一套在蛋白质组水平上系统鉴定含蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶底物的策略（见图1）。本策略通过筛选随机多肽文库鉴定蛋白质相互作用结构域的配体结合特性。通过构建了一系列人工底物(artificialdegron)，包括一个可以被泛素化的序列和一系列识别底物的序列用于体外泛素化实验。通过这一策略，除了底物之外还能鉴定到非底物调节蛋白。该策略还能鉴定到底物识别的详细机制，这对于药物的研发很有帮助。本课题中以LNX(Ligand of Numb protein X)家族E3（一组含有PDZ结构域的RING-type泛素连接酶）为例，来阐述和验证这一策略。我们鉴定到大量LNX1的潜在底物;在选出的9个候选底物中，8个在体外泛素化实验中被LNX1泛素化。在进一步的细胞内验证中，本研究验证出两个LNX1内源底物—PBK和BCR。进一步实验证明LNX1催化PBK的泛素化和降解，抑制细胞增殖，促进阿霉素诱导的细胞死亡。我们还描述了LNX1识别底物的详细机制，即LNX1通过哪个PDZ结合底物。这一策略作为一个在蛋白质组水平上系统鉴定E3底物的有力工具，能够扩展到其他含有蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶的研究。在本文的后一部分，我们建立了另一套较高通量鉴定E3底物的新策略（见图2）。该策略利用活噬茵体展示文库做为E3底物进行筛选。本研究以MDM2为例阐述和验证该策略。通过4次不同方法的筛选，本策略鉴定到MDM2的16个天然潜在底物和许多非天然潜在底物。有些底物可以在不同的实验中重复筛选到。在选出的12个候选底物中，10个在体外泛素化体系中被MDM2泛素化。在进一步的细胞内验证中，本实验验证出三个MDM2的新底物蛋白—DDX42，TP53RK和RPL36a。进一步的研究发现了MDM2促进TP53RK泛素化导致其被蛋白酶体的降解。在本策略中，除了多聚底物之外，还能鉴定到更多的MDM2单泛素化或寡聚泛素化底物。只要某一个E3适合体外泛素化系统，且不泛素化空噬菌体，这一策略就能够推广到该泛素连接酶底物的筛选中。收起

关键词 : 泛素连接酶底物蛋白质相互作用结构域噬菌体展示高通量筛选阿霉素

5. PDZ结构域结合中间序列结合特性的研究

[学位论文] 牟一北京协和医学院 2012年博士导师: 高友鹤共150页

摘要 : 第一部分研究了PDZ结构域结合中间序列的结合特性蛋白质-蛋白质相互作用在生命活动中广泛存在，主要由蛋白质结构域来高效介导。大规模的蛋白质相互作用可以通过研究结构域的结合特性来实现。PDZ、SH3、SH2、WW等结构域通过一个或多个识别“口袋... 展开第一部分研究了PDZ结构域结合中间序列的结合特性蛋白质-蛋白质相互作用在生命活动中广泛存在，主要由蛋白质结构域来高效介导。大规模的蛋白质相互作用可以通过研究结构域的结合特性来实现。PDZ、SH3、SH2、WW等结构域通过一个或多个识别“口袋”来识别和结合配体蛋白的一段保守的短肽序列。然而蛋白质相互作用可能比我们现在认识到的复杂，还有很多的相互作用未被研究清楚。就PDZ结构域而言，它通常结合配体蛋白C末端4～5个氨基酸残基，近来研究发现其也能够结合配体蛋白的中间序列，与自身或其他结构域聚合，或与膜上的脂类结合。这些结合方式使蛋白质的相互作用呈现出多样性与复杂性。首先，为了系统地高通量地研究PDZ结构域结合中间序列的结合特性，我们在酵母双杂交系统中构建了中间序列随机八肽文库。文库的构建策略是将所有序列的C末端设计成相同的序列，从而保证PDZ结构域结合的是中间序列。而后，使用文库筛选了24个PDZ结构域，其中包括已知文献报道的能够结合中间序列的PDZ结构域;实验室已经构建好的PDZ结构域和一些能够结合脂类的PDZ结构域。实验表明有14个结构域具有结合中间序列的特性，其中6个结构域未曾被报道。序列具有偏好性，偏好较强的具有一致序列。与C末端序列的结合特性相比，中间序列的结合特性表现出多样性，只有ZO1-PDZ1结构域的中间序列特性与其C末端特性相似。筛选结果也反映出PDZ结构域对于中间序列和C末端序列的偏好性。另外，HtrA2-PDZ的偏好性较弱，没有一致序列，表现为结合疏水多肽。中间序列的筛选结果说明有更多的PDZ结构域可以结合中间序列。此外，应用中间序列的结合特性可以来寻找已知相互作用的结合位点，也可以利用中间序列或一致序列来搜索数据库发掘潜在的天然相互作用蛋白。第二部分研究了日本血吸虫蛋白GIPC3的分子特征及其PDZ结构域的配体结合特性血吸虫病仍然是一个全球性的严重的公共卫生问题，流行于77个国家和地区，感染者超过2.3亿。依赖于单一药物吡喹酮大规模长期治疗引起对抗药性问题的关注。PDZ结构域蛋白被认为是下一代药物开发的潜在靶点。在本论文的第二部分主要研究日本血吸虫PDZ结构域蛋白SjGIPC3的分子特征及利用随机多肽文库探索其PDZ结构域的结合特性。 SjGIPC3是含有单个PDZ结构域的蛋白。多重序列比对分析显示SjGIPC3与其同源物在GH1与PDZ结构域相对保守，但PDZ结构域中的C末端结合环处并不保守，其中的经典的GLGF模体被SFGL替代。进化分析表明日本血吸虫SjGIPC3与吸虫同源物形成一分支，而与其他物种相距较远。分期转录分析显示，SjGIPC3基因在侵入宿主后转录水平显著升高;在雄性成虫的转录水平为最高。在酵母双杂交系统中，我们初步探索了SjGIPC3-PDZ结合C末端序列的结合特性。用SjGIPC3全长蛋白或其PDZ结构域为诱饵蛋白，筛选了本室利用人基因组构建的新型随机多肽文库，实验表明sjGIPC3 PDZ结构域主要结合Ⅰ类和Ⅱ类配体，但以结合Ⅰ类配体为主;用SjGIPC3全长蛋白为诱饵筛选文库得到的C末端序列比用PDZ结构域为诱饵得到的序列的规律性更强，提示SjGIPC3蛋白的N端和C端区域可能对PDZ结构域的配体结合特性产生影响。根据PDZ结构域的结合规律，利用本室开发的Tailfit软件预测并在酵母双杂交系统中验证了4个潜在的SjGIPC3的天然配体，其中之一为NMDA受体。收起

关键词 : 蛋白质相互作用 PDZ结构域中间序列结合酵母双杂交随机多肽文库日本血吸虫

6. 尿液是疾病标志物的理想来源

[学位论文] 李梦林北京协和医学院 2014年博士导师: 高友鹤共146页

摘要 : 生物标志物是指与生理或者病理生理过程相联系的可监测的变化，更好的寻找标志物对疾病的预防、诊断、治疗具有重要的意义。作为寻找疾病标志物的“金矿”，尿液是研究疾病标志物的理想来源。与最常用于检测标志物的血液来源相比，它可以无创、大量的... 展开生物标志物是指与生理或者病理生理过程相联系的可监测的变化，更好的寻找标志物对疾病的预防、诊断、治疗具有重要的意义。作为寻找疾病标志物的“金矿”，尿液是研究疾病标志物的理想来源。与最常用于检测标志物的血液来源相比，它可以无创、大量的获取，并且由于不受稳态的调节，可以容纳并积累更多、更大的变化。尿液的一部分组成成分来源于血液滤过物，因此它不仅可作为研究泌尿系统生物标志物的理想来源，也在一定程度上可以反映血液或者整个机体的状态。本论文第二章节我们先探讨了尿液作为标志物来源的优势，即在相同的条件下，尿液中可以找到更多的变化信息。通过抗凝剂肝素或阿加曲班改变雌性SD大鼠的凝血状态，用蛋白质组学的方式检测给药前后血液和尿液中蛋白的改变。在同样的鉴定策略及分析条件下，尿液中发现更多的变化蛋白。在阿加曲班干预组中，检测到尿液中变化的蛋白有62个，血液中变化的蛋白仅有1个。在肝素干预组中，尿液中变化的蛋白有27个，血液中变化的蛋白仅有3个。Western blot显示转铁蛋白(transferrin)和血红素结合蛋白（hemopexin)在血液和尿液中的变化趋势与质谱结果一致。本实验提示尿液是更敏感的蛋白生物标志物的来源。因为尿液可以累积机体的很多变化，它更容易受到各种因素如性别、年龄、生活方式等的影响，造成尿液在尿量、蛋白含量等方面的动态波动。研究影响尿液蛋白质组的因素，弄清各因素对尿液的具体干扰，将有助于我们在进行其它尿液蛋白研究时，人为地减少这些因素带来的影响，进而获得更为准确的疾病标志物信息。进食、应激、手术后常引起短暂性血糖升高，这可能是疾病标志物研究的一个干扰因素。所以在本论文第三章节，我们研究了短暂高血糖对尿液的影响，发现正常人在血糖短暂升高后，尿中仅有一个蛋白发生改变。表明在正常人中，短暂高血糖的影响很小，基本可以忽略不计。既然尿液是重要的标志物来源，对尿液蛋白质组进行准确且深入的鉴定，全面了解尿液中蕴含的蛋白种类、来源、功能等信息，对尿液中疾病标志物的研究非常有必要。在本论文第四章节，我们通过三维分离的方式，对正常人尿液蛋白进行有效分离，并结合高精度质谱，对人尿液蛋白质组进行了全面深入的鉴定。在将标准设为每个蛋白至少有两条多肽得到鉴定且FDR收起

关键词 : 疾病标志物尿液蛋白质组生理功能

7. 蛋白质相互作用结构域PDZ结合特性的研究方法

[学位论文] 黄海明北京协和医学院(中国医学科学院) 2004年博士导师: 高友鹤共142页

摘要 : 本部分介绍了一种新的随机多肽文库的构建方法,即用基因组DNA为原料来构建随机多肽文库.一般认为,基因组DNA是不能够直接用来表达出有生物学意义的蛋白质或多肽.但是,如果我们需要的是随机多肽,基因组DNA就可以被认为是非常有用的资源.当大的基因组DN... 展开本部分介绍了一种新的随机多肽文库的构建方法,即用基因组DNA为原料来构建随机多肽文库.一般认为,基因组DNA是不能够直接用来表达出有生物学意义的蛋白质或多肽.但是,如果我们需要的是随机多肽,基因组DNA就可以被认为是非常有用的资源.当大的基因组DNA被仅识别4个核苷酸的限制性内切酶酶切后,产生的短片段DNA可以近似的认为是随机序列的片段,这样的短的随机片段在本实验中被用来直接表达随机多肽,成为随机多肽文库.例如人的基因组DNA为2.91×10(2.91×10),理论上在随机多肽文库有可能找到能与一个PDZ结构域相互作用的所有C-末端序列,通过此序列检索数据库则可以得到所有的能与此PDZ结构域相互作用的配体蛋白.而用常规的筛选cDNA文库的方法,有可能需要筛选多个文库才能得到PDZ结构域所有的配体蛋白.并且当配体蛋白在cDNA文库中的丰度很低时,或者有丰度高低不同的几种配体同时存在时,用这种方法筛选到低丰度配体蛋白的难度相当大.PDZ(PSD95/Dlg-A/ZO-1)是一种重要的蛋白质相互作用结构域.它在细胞信号转导、蛋白质复合物的组装及细胞膜的组织方面都有重要的作用.PDZ通常是识别并结合其配体C-末端的4个氨基酸.但是,除了已经在实验中证实的能与已知PDZ相互作用的配体蛋白含有这样的C-末端外,还有可能有其它的蛋白也含有这个相同的C-末端,这些蛋白也有与已知PDZ相互作用的能力,但未被实验所证实.所以通过检索相同C-末端的蛋白可以推测与已知PDZ相互作用的所有可能的配体.此外,为了知道我们在第二部分中所得到的16个C-末端序列分别是那些蛋白的C-末端也需要对数据库进行检索.BLAST是一种常用的同源检索的工具,但是在检索C-末端短序列时有局限性.在本文中我们利用Word 2000中的"查找"功能,实现了检索特定C-末端短序列的目标.根据已知PDZ配体蛋白的C-末端4个氨基酸序列,我们用Word 2000中的"查找"检索整个Swissprot数据库,以找到更多的可能与已知PDZ结构域结合的蛋白.我们的结果显示,有些PDZ结构域除了能结合那些在实验中已经证实了的配体蛋白以外,还有可能可以结合在实验中没有证实的配体蛋白.这一结果也为研究某些假定蛋白(hypothetical protein)的功能提供了一个有益的线索. 收起

关键词 : 蛋白质多肽文库人工多肽 PDZ结合

8. 蛋白质-配体及蛋白质-细胞相互作用的研究策略

[学位论文] 朱莉思北京协和医学院 2013年博士导师: 高友鹤共134页

摘要 : 蛋白质几乎参与所有的生物学过程。他们通过与其他蛋白质或者其他分子发生相互作用行使功能。本论文建立了两个研究蛋白质相互作用的蛋白质组学新策略：4Facts策略用于鉴定实时的蛋白质一配体相互作用；4S策略用于整体分析蛋白质一细胞相互作用。 ... 展开蛋白质几乎参与所有的生物学过程。他们通过与其他蛋白质或者其他分子发生相互作用行使功能。本论文建立了两个研究蛋白质相互作用的蛋白质组学新策略：4Facts策略用于鉴定实时的蛋白质一配体相互作用；4S策略用于整体分析蛋白质一细胞相互作用。 4Facts策略——快速固定(Fast Fix)、亲和捕获(Fish)、分子量筛选(Filter)，可以在不对生物学样品进行预先干预的条件下全面、灵敏而准确地研究实时原位的蛋白质，配体相互作用。在本策略中，SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）被用于打断非共价结合以去除未被共价交联的复合物，以及提供分子量信息用于筛选配体蛋白。候选蛋白被认定为靶蛋白的配体蛋白，需要同时满足以下三个条件：第一，必须与靶蛋白在同一胶条中被鉴定；第二，必须在实验组胶条中被鉴定，而不出现在相同、相邻或更高分子量范围的对照组胶条中；第三，所在胶条的分子量范围包含或大于它与靶蛋白的理论分子量之和。我们将4Facts策略应用于人血液中的蛋白质．配体相互作用，以血浆白蛋白以及转铁蛋白为例展示该策略的可行性。人血液不经任何处理被直接加入10%的甲醛溶液中进行5秒的快速交联反应。运用该策略，我们鉴定到35个白蛋白的配体以及52个转铁蛋白的配体。与此前三个主要的白蛋白相互作用蛋白质组学研究进行比较，本研究鉴定到的35个白蛋白配体中的68.57%在其他研究中也被鉴定到。该策略实现了5秒的短时间交联，未来可能被应用于研究动态的蛋白质一蛋白质相互作用。 4S策略——表面酶切(Surface Shaving)结合种属特异性(Species Specificity)，可以被用于整体分析不同物种间的蛋白质，细胞相互作用。我们以牛血清-人Ca Ski细胞相互作用为例来说明4S策略。牛血清培养的Ca Ski细胞在经过三次PBS洗涤之后与胰酶孵育。表面酶切上清以及作为对照的牛血清和细胞裂解液被收集，用于质谱分析。一些蛋白质因为共享多肽而无法被定量。我们把共享多肽的谱图数按照各蛋白所含种属特异的多肽的谱图数的比例，分配给各个蛋白，然后通过NSAF值对牛源蛋白（包含牛种属特异的肽）以及人源蛋白（包含人种属特异的肽）进行定量。运用该策略，30个牛源蛋白相对于牛血清被富集，我们认为这些牛血清蛋白与人Ca Ski细胞发生相互作用，可能在细胞培养中起着重要作用。基因注释显示它们之中的大部分具有结合功能。另外，216个人源蛋白相对于细胞裂解液被富集，它们可能是细胞膜蛋白或者分泌蛋白。该策略实现了对不同物种间蛋白质．细胞相互作用的整体分析，未来可能被应用于病原一宿主微环境相互作用。收起

关键词 : 蛋白质-配体蛋白质-细胞 4Facts策略

9. 机器学习方法预测蛋白质相互作用应用Logistic回归提高质谱多肽鉴定的准确度

[学位论文] 邵晨北京协和医学院(中国医学科学院) 2008年博士导师: 高友鹤共128页

摘要 : 蛋白质组学成为后基因组时代的热点学科。生物质谱、蛋白质芯片等高通量实验技术的发明极大地推动了蛋白质组学的发展。本文致力于通过生物信息学的方法，进一步提高当前高通量实验技术的效率和精确程度，以更低的实验代价，获得更加全面、准确的实验... 展开蛋白质组学成为后基因组时代的热点学科。生物质谱、蛋白质芯片等高通量实验技术的发明极大地推动了蛋白质组学的发展。本文致力于通过生物信息学的方法，进一步提高当前高通量实验技术的效率和精确程度，以更低的实验代价，获得更加全面、准确的实验结果。蛋白质—蛋白质相互作用在生命过程中起着重要的作用。通过多年的生物学实验，已经积累了大量的蛋白质相互作用数据，但未知的相互作用还有很多。目前筛选蛋白质相互作用的实验方法既耗费人力物力，而且由于丰度抑制的原因而很难鉴定出低丰度的蛋白之间的相互作用。一条更简单的途径是通过生物信息学的方法首先用计算机筛选蛋白质数据库，预测出潜在的蛋白质相互作用，然后再用生物学实验进行验证。这个策略具有比实验手段高得多的通量，而且可以解决丰度抑制的问题。在蛋白质—蛋白质相互作用的类型中，有相当一部分相互作用是通过蛋白质的某个结构域与其配体蛋白上的一段短肽相结合来实现的，这种结构域被称为多肽识别元件（Peptide recognition module，PRM）。本文的第一章通过研究PRM结合多肽的结合特性，预测了蛋白质—蛋白质之间的相互作用。以PDZ结构域为例，结合了基于结构的和基于序列的预测方法，本文建立了一个整合的预测系统来预测结构域和配体间的相互作用。在这个系统中，提取了结构域和配体三维结构上相互接触的氨基酸残基来代替序列全长，利用三种新型的氨基酸编码方式，用支持向量机和人工神经网络两种机器学习算法分别建立了三个子预测系统，最后将它们的预测结果综合在一起。用交叉验证的方法来评价，预测系统的特异性为0．99，灵敏度为0．60。然而，由于已知的一个结构域的配体通常只有几十或几百个，远远小于蛋白质数据库的上万个蛋白的规模，仅仅建立在少量数据上的交叉验证的评价结果不一定能保证预测方法在筛选数据库时的成功。为了验证这一点，本文从Swissprot人类数据库中为3个PDZ结构域筛选了配体蛋白序列，预测结果的相当一部分与高通量的体外实验（peptide SPOT array）的结果重合，证明了预测系统的泛化能力。串联质谱技术（MS/MS）是常用的蛋白质组学研究方法。在这个方法中，蛋白质混合物首先被酶切为多肽混合物，在质谱仪中被离子化，再经过碎裂后产生大量的二级质谱图。数据库检索是常见的质谱数据处理方法。其主要思想是将实验谱图与数据库中的酶切多肽的理论谱图进行比对，通过特定的打分算法，找到匹配最佳的多肽。由于样品和实验原理的复杂性，质谱图带有很高的噪声，为后续的数据处理工作带来了很大的难度。目前已有多种算法用来优化多肽的鉴定，但阳性和阴性的多肽鉴定仍不能够被完美地区分。为了保证鉴定结果的可信，就不得采用更严格的参数限制来去除假阳性鉴定，与此同时不可避免地产生了大量的假阴性鉴定，降低了蛋白质组学研究的效率。本文的第二章建立了一个新的参数Oscore，对实验谱图与多肽的匹配进行打分。Oscore基于logistic回归模型建立，以18个标准蛋白数据集作为学习集，可以直接地计算出谱图与多肽的匹配为正确匹配的概率。回归模型的自变量包括：SEQUEST软件输出的参数Xcorr，△Cn，Sp（preliminary score）和实验室自制的AMASS（Sun et al．Mol Cell Proteomics．2004Dec；3（12）：1194—9）软件的输出参数Rscore，Cont，Matchpct，以及多肽电荷数和漏切位点数（numberofmissedinternalcleavagesites）。AMASS的三个参数考虑了子离子强度和b/y系列离子的连续性的信息，有助于区分阳性和阴性的多肽鉴定。由于上述的8个参数之间具有复杂的相关关系，将它们组合成Oscore可以提高鉴定的准确度。与常用的软件PeptideProphet相比，Oscore同时在多个数据集上表现出更好的特异性（低假阳性率）和灵敏度（低假阴性率）。这些数据集包括标准蛋白混合物数据集和3个蛋白质组水平的数据集，涵盖了不同的样品复杂度、数据库规模和分离方式，在一定程度上表明了Oscore的泛化能力。通过一个同样基于logistic回归，但只采用PeptideProphet所用参数的新模型，本文探讨了Oscore具有更好的判别能力的原因。目前的Oscore针对的是具有完全酶切的末端（即多肽的两端都是由胰酶酶切在氨基酸K或R之后产生）的多肽，提高非完全酶切的多肽的鉴定水平将是今后的工作。收起

关键词 : 蛋白质相互作用 Logistic回归分析串联质谱技术多肽机器学习算法

10. 大鼠单侧输尿管结扎模型和饥饿模型尿液蛋白质组研究

[学位论文] 袁媛北京协和医学院中国医学科学院 2015年博士导师: 高友鹤共127页

摘要 : 目的：生物标志物指的是与生理或病理性过程相关的可监测的变化。在受到多种生理或病理性的因素刺激时，机体内原有的平衡状态被打破，相关器官、组织或细胞会产生异常的代谢产物。机体总是趋向于恢复原有的平衡，故而会将这些异常的代谢产物排出体外... 展开目的：生物标志物指的是与生理或病理性过程相关的可监测的变化。在受到多种生理或病理性的因素刺激时，机体内原有的平衡状态被打破，相关器官、组织或细胞会产生异常的代谢产物。机体总是趋向于恢复原有的平衡，故而会将这些异常的代谢产物排出体外。尿液作为机体的一种排泄物很有可能承载和积累了这些来白于机体的多种变化，并可能是寻找生物标志物良好的生物学来源。在研究某种疾病特异性生物标志物时，为了排除尿液蛋白质组中其它生理或病理影响因素，应选择单一生理或病理因素变化所对应的尿液蛋白质组学的特异性变化进行研究，更有利于发现与该疾病直接相关的、有重要意义的尿液蛋白生物标志物。直接使用人的临床尿液样品来研究某种疾病所导致的尿液蛋白质特异性的变化存在着许多困难，尿液的诸多影响因素所引起的变化很可能掩盖或至少部分掩盖了疾病本身所引起的变化。直接使用这种方法来研究人类疾病尿液蛋白组学，往往需要大规模的样本量，极其耗时，而且难以获得可信的结果。因此选择动物模型这一更为简单、可控的研究系统进行研究，对于尿液蛋白组学的研究即寻找可信的尿液标志物来讲不失为一种更好的选择。进展性肾脏疾病多导致终末期肾损伤，而肾脏纤维化是其基本的病理学改变。临床上梗阻性肾病是肾脏纤维化的一大重要原因，以肾小管损伤和间质成纤维细胞的增殖为主要特征，因此寻找肾小管损伤和肾脏纤维化尿液生物标志物对于梗阻性肾病及其它慢性肾病的诊治具有重要意义。单侧输尿管结扎(UUO)模型被认为是梗阻性肾病经典的动物模型，其实验时间、造模严重程度可控性好。本研究采用UUO模型来研究梗阻性肾病不同病理状态下的尿液蛋白质组的变化，并验证了UUO模型大鼠肾小管损伤和肾间质纤维化两个病理过程所对应的尿液中几种显著变化的差异蛋白，为筛选和寻找梗阻性肾病潜在的尿液生物标志物提供了一定的线索。饥饿是生物体的一种正常生理现象，在此过程中，器官功能可发生不同程度的异常，而能量代谢亦会出现一系列的变化，引起体重下降、身体组成成分的变化以及代谢基因表达的改变。短期饥饿可能导致蛋白代谢的加速，引起尿液中氮排泄量增加、体内亮氨酸通量和氧化增加，这些均提示饥饿能够影响机体的蛋白质代谢，而这些变化很可能从尿液蛋白质组的变化中体现出来。蛋白质的翻译后修饰是指活细胞内的基因组经转录、翻译为蛋白质后，在蛋白质的一个或多个氨基酸残基上进行共价修饰的过程，在生命体中具有重要的意义。翻译后修饰的蛋白在细胞信号转导、酶活性调控等过程中发挥着重要的作用，并且翻译后修饰的类型和程度会因机体所处的不同环境、机体不同的生理和病理状态的影响而出现巨大的变化。因此，对于饥饿过程中尿液蛋白质组的研究不应只局限于对尿液蛋白质组成和含量变化的研究，还应关注这些尿液蛋白质的翻译后修饰类型、程度以及修饰位点的差异，这对于理解饥饿所导致机体的一系列变化有重要的意义。因此本实验主要研究了大鼠饥饿0、4、7d时尿液蛋白质组的变化以及蛋白质翻译后修饰的变化。方法： 1.实验分为假手术组和UUO模型组，其中UUO模型组采用分离大鼠左侧输尿管进行双结扎造模，假手术组只分离左侧输尿管不进行其它操作。造模成功后，尿液的采集是通过与肾脏相连的输尿管残端进行输尿管插管，共收取尿液3小时，其中前0.5小时尿液为肾脏在造模阶段储积的尿液，该部分尿液不进行分析;后2.5小时尿液为损伤肾脏新产生的尿液并用于后续蛋白组学研究。这种方法采集的尿液与梗阻性肾病患者的尿液有一定的相似性。尿液采集完成后，腹主动脉采血，并收取造模侧肾脏用于后续研究。提取尿蛋白进行膜上酶切，用质谱定量的方法研究模型不同病理变化所对应的尿液蛋白质组学的变化，筛选有意义的差异蛋白，在各组尿液、肾组织内进行western blot和免疫组织化学验证。 2.实验研究了大鼠饥饿不同时间后尿液蛋白质组的变化，分别在大鼠饥饿0、4、7d时测量大鼠体重，观察体重的变化，并收取大鼠的尿液和血液进行生化检测，观察生化指标的异常情况;质谱检测饥饿不同时间点大鼠尿液蛋白质组的变化，包括蛋白组成相对量的变化以及翻译后修饰的变化。结果： 1.HE和Masson染色证明造模成功后，采用质谱定量方法研究了肾小管损伤所对应的UUO模型较早阶段（UUO模型1w）和肾间质纤维化所对应的UUO模型较晚阶段（UUO模型3w）大鼠尿液蛋白质组的变化。共鉴定到尿蛋白500个，其中与对照组1w组相比，UUO模型1w组显著变化的蛋白共7个，与对照3w组比较，UUO模型3w组显著变化的蛋白共18个。选择5个在UUO模型中出现显著变化的尿蛋白，在尿液和肾组织中进行验证。尿液蛋白western blot验证以及肾组织western blot和免疫组织化学验证显示，Alpha-actinin-1和Moesin蛋白水平在UUO模型1w组即可出现升高，而Vimentin，Annexin A1和Clusterin蛋白水平在UUO模型3w组有所升高。 2.随饥饿时间延长，大鼠体重以及每日排尿量均降低，且差异具有统计学意义。尿液、血浆生化检测发现尿肌酐水平显著升高、血浆总蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义。采用质谱定量方法研究了饥饿不同时间点0、4、7d时大鼠尿液蛋白质组的变化。共鉴定到尿蛋白664个，其中与饥饿0天相比，饥饿4天显著变化的蛋白共5个，饥饿7d显著变化的蛋白共13个，其中有3个蛋白重合;同时，饥饿后尿蛋白的翻译后修饰也会发生一系列的变化。结论： 1.在UUO模型1w组出现显著变化的尿蛋白可能作为肾小管损伤这一病理过程潜在的尿液生物标志物，在UUO模型3w组出现显著变化的尿蛋白可能作为肾间质纤维化这一病理过程潜在的尿液生物标志物。 2.饥饿可能通过影响机体的代谢而引起尿液蛋白质组在量和翻译后修饰上的一系列变化。饥饿所对应的发生特异性改变的尿蛋白可作为疾病生物标志物研究中应被排除的干扰蛋白，更有利于发现特异性的疾病尿液生物标志物。翻译后修饰的变化主要是甲酰化和磷酸化的蛋白数量减少，对于探讨尿液中蛋白质存在的意义提供一定线索。收起

关键词 : 尿液蛋白质组单侧输尿管结扎饥饿模型生理病理性肾脏疾病肾脏纤维化