中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 黄海明北京协和医学院(中国医学科学院) 2004年博士导师: 高友鹤共142页

摘要 : 本部分介绍了一种新的随机多肽文库的构建方法,即用基因组DNA为原料来构建随机多肽文库.一般认为,基因组DNA是不能够直接用来表达出有生物学意义的蛋白质或多肽.但是,如果我们需要的是随机多肽,基因组DNA就可以被认为是非常有用的资源.当大的基因组DN... 展开本部分介绍了一种新的随机多肽文库的构建方法,即用基因组DNA为原料来构建随机多肽文库.一般认为,基因组DNA是不能够直接用来表达出有生物学意义的蛋白质或多肽.但是,如果我们需要的是随机多肽,基因组DNA就可以被认为是非常有用的资源.当大的基因组DNA被仅识别4个核苷酸的限制性内切酶酶切后,产生的短片段DNA可以近似的认为是随机序列的片段,这样的短的随机片段在本实验中被用来直接表达随机多肽,成为随机多肽文库.例如人的基因组DNA为2.91×10(2.91×10),理论上在随机多肽文库有可能找到能与一个PDZ结构域相互作用的所有C-末端序列,通过此序列检索数据库则可以得到所有的能与此PDZ结构域相互作用的配体蛋白.而用常规的筛选cDNA文库的方法,有可能需要筛选多个文库才能得到PDZ结构域所有的配体蛋白.并且当配体蛋白在cDNA文库中的丰度很低时,或者有丰度高低不同的几种配体同时存在时,用这种方法筛选到低丰度配体蛋白的难度相当大.PDZ(PSD95/Dlg-A/ZO-1)是一种重要的蛋白质相互作用结构域.它在细胞信号转导、蛋白质复合物的组装及细胞膜的组织方面都有重要的作用.PDZ通常是识别并结合其配体C-末端的4个氨基酸.但是,除了已经在实验中证实的能与已知PDZ相互作用的配体蛋白含有这样的C-末端外,还有可能有其它的蛋白也含有这个相同的C-末端,这些蛋白也有与已知PDZ相互作用的能力,但未被实验所证实.所以通过检索相同C-末端的蛋白可以推测与已知PDZ相互作用的所有可能的配体.此外,为了知道我们在第二部分中所得到的16个C-末端序列分别是那些蛋白的C-末端也需要对数据库进行检索.BLAST是一种常用的同源检索的工具,但是在检索C-末端短序列时有局限性.在本文中我们利用Word 2000中的"查找"功能,实现了检索特定C-末端短序列的目标.根据已知PDZ配体蛋白的C-末端4个氨基酸序列,我们用Word 2000中的"查找"检索整个Swissprot数据库,以找到更多的可能与已知PDZ结构域结合的蛋白.我们的结果显示,有些PDZ结构域除了能结合那些在实验中已经证实了的配体蛋白以外,还有可能可以结合在实验中没有证实的配体蛋白.这一结果也为研究某些假定蛋白(hypothetical protein)的功能提供了一个有益的线索. 收起

关键词 : 蛋白质多肽文库人工多肽 PDZ结合

2. 结肠癌特异性噬菌体多肽筛选与鉴定的初步研究

[学位论文] 俞杨东南大学 2006年硕士导师: 张建琼共43页

摘要 : 结肠癌是一种严重危害公众健康的常见恶性肿瘤。其病因尚未完全清楚，目前认为是环境因素与遗传冈素综合作用的结果。其发病率以北美洲最高，约24-34/10万；在中国，东南沿海明显高于北方。近20多年来，世界大多数国家结肠癌发病率呈上升趋势；由于饮... 展开

关键词 : 噬菌体随机多肽文库噬菌体多肽结肠癌

3. 噬菌体展示技术体内筛选小鼠肾脏特异性多肽

[学位论文] 阳艳丽东南大学 2008年硕士导师: 王自正共38页

摘要 : 目的：本课题旨在利用噬菌体随机多肽文库对小鼠进行体内筛选，获得小鼠肾脏血管特异性多肽。方法：1、小鼠的体内筛选实验动物为6-8周的SPF级雌性Balb/c鼠，乙醚麻醉小鼠后尾静脉注射C7C噬菌体多肽文库200μl，循环10分钟后，将小鼠再次麻醉，... 展开

关键词 : 噬菌体随机多肽文库体内筛选肾脏血管特异性多肽

4. 食管癌特异性噬菌体多肽筛选与鉴定的初步研究

[学位论文] 邹畅东南大学 2007年硕士导师: 张建琼共34页

摘要 : 本文利用人食管癌细胞系SHEEC为靶分子，用这一细胞相同起源的人正常食管上皮细胞SHEE作为对照，对噬菌体展示随机多肽文库(Ph．D．-12... 展开本文利用人食管癌细胞系SHEEC为靶分子，用这一细胞相同起源的人正常食管上皮细胞SHEE作为对照，对噬菌体展示随机多肽文库(Ph．D．-12以上的细胞数量和不严格的洗涤条件，以避免低含量的特异性克隆因强洗涤而丢失。待扩增之后，在后两轮的筛选过程中逐渐降低细胞数量，并增加洗涤次数，力争得到高亲和力的特异性噬菌体多肽。经过三轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，可以看出，从肿瘤细胞上洗脱下来的噬菌体滴度呈现出明显增加的趋势。在多肽文库中，噬菌体滴度从第一轮到第三轮增加了416倍，说明特异性的噬菌体多肽得到了富集。随后用每轮筛选后的次级库细胞结合试验，结果证实这些多克降噬菌体多肽都能与SHEEC细胞结合。为了进一步说明这些单克隆是否具有与食管癌细胞结合的肿瘤特异性，首先进行了细胞水平的鉴定。采用人食管鳞状上皮细胞SHEE作为对照。采用了上述的策略验证多肽克隆的细胞水平的肿瘤特异性：挑取第三轮洗脱液铺板的单克隆46个，分别与SHEEC和SHEE做细胞结合实验。利用这一方法，得到了43个与SHEEC结合能力明显高于SHEE的克隆。由于SHEE是存人乳头瘤病毒18(human papil-lomavirus 18,HPV18)E6 E7 病毒癌基因作用下由人正常胎儿食管上皮转化来的人永生化食管上能上能下细胞第，这株细胞在传代会有少数细胞恶性转化，85代左右会表现出明显的恶性化。为了进一步验证这些克隆的食管癌细胞特异性，选取了人鳞状上皮细胞HACAT和作为埘照，通过细胞结合试验从上述克隆中鉴定得到5个不与HACAT结合的阳性克隆。由于SHEEC是在促癌物TPA(12-0--tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)作用下由SHEE恶性转化来的肿瘤，为了考查这些克隆是否能结合恶性程度不同的食管癌细胞系，选取了恶性程度与SHEEC不同的EC9706做细胞结合实验。结果表明，在以上得到的克降中有相当一部分克隆可以结合恶性程度不同的食管癌细胞系而不识别人正常上皮细胞。随后，对得到的这些克隆进行测序，通过测序结果推导出相应多肽的氨基酸组成。为了考察这五个克隆与非鳞状上皮起源的细胞的结合能力，利用人肝癌细胞第HepG2及小鼠成纤维细胞系NIH3T3做细胞结合试验，从中鉴定出3个在结合人食管癌细胞系SHEEC的同时不与这两株细胞结合的噬菌体多肽。为了考查这3个克降是否会在机体内与其它的正常3组织结合，利用小鼠体内实验检测了该克隆在体内的生物学分布。将1.0×10/mL.g.这就表明在体内噬菌体多肽克隆2.15-18C几乎不与其它正常组织结合。计划下一步利用食癌肿瘤模型考查其在体内的肿瘤靶向性。收起

关键词 : 食管癌噬菌体多肽随机多肽文库早期诊断

5. 缢蛏发育转录组文库及类胰岛素相关多肽基因功能的初步研究

[学位论文] 王飞上海海洋大学 2016年硕士导师: 李家乐;牛东红共63页

摘要 : 缢蛏（Sinonovacula constricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。对缢蛏生长相关基因进行研究，有助于缢蛏的良种选育，是提高缢蛏养殖经济效益的重要途径。类胰岛素相关多肽是类胰岛素超家族的重要成员之一，在生物体... 展开缢蛏（Sinonovacula constricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。对缢蛏生长相关基因进行研究，有助于缢蛏的良种选育，是提高缢蛏养殖经济效益的重要途径。类胰岛素相关多肽是类胰岛素超家族的重要成员之一，在生物体生长发育及代谢调控中发挥了重要作用。本研究建立了缢蛏发育转录组文库，同时获得了三个类胰岛素相关多肽（insulin-like peptide,ILP）基因。分析了ILPs基因的时空表达特征，初步探讨了其在生长发育过程中的生物学功能。 1.缢蛏发育转录组特征分析，基因注释及变态相关基因分析采用新一代Illumina HiSeq2000高通量测序技术，首次构建了缢蛏发育转录组文库，包括卵裂期、担轮幼虫期、D型期、壳顶幼虫期、匍匐期和稚贝期，共拼接得到了249795个短片段。长度在201bp到36941bp之间，平均为585bp。其中最长的注释基因是Nesprin-1（11087个氨基酸）。经过对比，在NCBI Nr、COG、Swiss-Prot和KEGG四个程序中分别注释了21920（8.78%）、8837（3.54%）、14036（5.62%）、15978（6.4%）个基因。GO分类发现，9205个基因可以归类于三个主要的功能域：生化过程、细胞组分和分子功能。筛选鉴定了与缢蛏发育变态相关的基因，荧光定量PCR分析初步证明了这些基因在缢蛏变态发育过程中发挥了重要作用。缢蛏发育转录组文库丰富了缢蛏的基因信息，对进一步研究缢蛏幼虫生长发育的分子机制具有重要的参考价值。 2.缢蛏类胰岛素相关多肽基因的克隆及基因结构分析从缢蛏转录组中获得了类胰岛素超家族成员 ILP1、ILP2和 ILP3基因片段，经克隆验证以及RACE技术获得了三个基因的cDNA全长。分别为1339bp、1017bp和2415bp，其中ILP1的ORF为525bp，编码174个氨基酸；ILP2的ORF为537bp，编码178个氨基酸；ILP3的ORF为438bp，编码145个氨基酸。基因序列分析发现，该三个基因都含有信号肽和保守结构域，并且分为三个肽链，B链、A链和C链，其中在B链和A链上存在非常保守的六个半胱氨酸，此六个半胱氨酸形成了三个二硫键，其中两个存在于B链和A链之间，属于链间二硫键，另一个存在于A链内，属于链内二硫键。这三个二硫键决定了ILP蛋白的空间结构和功能。3.缢蛏类胰岛素相关多肽基因的表达分析对缢蛏三个基因进行时空表达谱研究中，包括七个成体健康组织（血、外套膜、腹足、水管、鳃、消化腺和性腺组织）和6个幼虫发育时期（卵裂期、担轮幼虫期、D型期、壳顶幼虫期、匍匐期和稚贝期）。发现 ILP1基因在鳃和斧足中有较高的表达，而ILP2基因在水管和斧足中有较高的表达。ILP3基因在成体各组织中均没有表达。在不同的发育时期内，ILP1基因随着幼虫的发育，表达呈上升趋势，在稚贝期有最高的表达量。ILP2基因和ILP3基因都在发育的早中期有较高的表达量，ILP2基因主要在担轮幼虫和D型幼虫期表达高，ILP3基因在D型幼虫和壳顶幼虫期表达量高。 4.缢蛏类胰岛素相关多肽基因在性腺发育过程中的影响在不同时间采集缢蛏，取性腺组织进行冰冻切片，观察性腺发育情况。共观察到了四个性腺发育时期，包括形成期、生长期、成熟期和放散期。提取性腺总RNA，进行反转录，通过荧光定量PCR，获得ILP1基因和ILP2基因在性腺各发育时期的表达谱。发现两个基因的表达量在雌雄个体的性腺发育早期比后期高，在雌性个体中，基本集中在生长期表达量高。雄性中，ILP1基因主要集中在形成期，ILP2基因主要集中在形成期和生长期。 5.缢蛏ILP受体初步探测与细胞增殖分析通过氨基酸序列对比发现，缢蛏类胰岛素相关多肽受体与人的胰岛素受体相似度较IGF1和IGF2受体更高。将3个ILP基因连接到pEGFP-N1载体上，转染到人293T细胞中，进行3个基因的过量表达。分时间点取样，包括0h、12h、24h、48h和72h，提取细胞总RNA，反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测了经转染后，293T细胞中胰岛素受体、IGF1受体基因和 IGF2受体基因的表达量变化，发现胰岛素受体在转染后随时间延长表达量上调，而IGF1受体基因和IGF2基因受体的表达量无明显变化。细胞数量通过流式细胞仪计数发现，48h时，N1空载质粒对照组的细胞增长率为2.56；转染ILP1基因从0h到48h，细胞增长率为5.73；转染ILP2基因的细胞增长率为3.15；转染ILP3基因的细胞增长率为8.79。收起

关键词 : 缢蛏发育转录组文库类胰岛素相关多肽基因功能

6. 南美角蛙皮肤活性多肽资源发掘和南美角蛙镇痛肽结构与功能研究

[学位论文] 王乾斌南京农业大学 2010年硕士导师: 赖仞共51页

摘要 : 两栖类的皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质，这些活性物质可用来抵御有害环境因子的侵袭。是有待于开发的宝库。目前，已从两栖类动物中分离鉴定出许多具有多种生物活性的蛋白及多肽。南美角蛙(Ceratophryscranwelli)，属于细趾蟾科角花蟾... 展开两栖类的皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质，这些活性物质可用来抵御有害环境因子的侵袭。是有待于开发的宝库。目前，已从两栖类动物中分离鉴定出许多具有多种生物活性的蛋白及多肽。南美角蛙(Ceratophryscranwelli)，属于细趾蟾科角花蟾属，分布于阿根廷，玻利维亚，巴西大峡谷地带。其白化体也叫黄金角蛙，常被当成宠物饲养。本研究以南美角蛙为研究对象，通过生物化学、分子生物学等手段，对南美角蛙皮肤中活性多肽资源进行了研究，发现了南美角蛙皮肤镇痛肽并对其结构功能进行了研究。以来源于单个南美角蛙(Ceratophrys cranwelli)个体皮肤中提取的mRNA为材料，我们建立了南美角蛙皮肤cDNA文库，得到大约为1×106个独立的克隆。通过PCR的方法，以M13引物随机筛选插入片段在500-10001bp的克隆。共挑选了142个克隆并测序。测序结果通过NCBI数据库Blast，其中62条序列可以得同源性序列。其中11条为活性多肽的序列，例如半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)，溶菌酶(Lysozyme)，性信息素(sodefrin)等等。南美角蛙中编码这些活性多肽的基因与亲缘性较近的非洲爪蟾中基因同源性较高，相似性最高可达76％，具有一定的特异性。活性多肽基因也具有多样性的特点。通过对南美角蛙皮肤cDNA文库的随机筛选，发现了一个具有氨基酸序列多拷贝现象的基因。经过翻译发现，在编码区内有6个拷贝，每个拷贝长19个氨基酸残基，并且每个拷贝的氨基酸序列都不完全相同，有一定的多样性。每个拷贝N端前两位氨基酸序列为KR，是两栖动物典型的翻译后加工位点。除去该位点，还有17个氨基酸。通过固相合成法合成了三条多肽，分别为CCAP1(TNGKGYQVENEDDYGDY)、CCAP2(TNGKDYQVENEDDYGDY)和CCAP3(TSGNGYQEENENDYGDY)。并进行了抗菌活性、抗氧化活性、缓激肽活性和镇痛活性检测.发现该类多肽具有镇痛活性，是一种镇痛肽。通过鼠尾光照镇痛实验发现，CCAP2的镇痛活性较强，其痛阈提高率达到40％以上，且镇痛效果较为稳定，在60min内维持在一个较高的水平，具有潜在的临床应用价值。这是首次关于南美角蛙皮肤中活性多肽的报道。收起

关键词 : 两栖动物南美角蛙 cDNA文库镇痛肽皮肤活性多肽结构功能

7. HBV POL-TP和HBC蛋白靶向多肽的筛选与研究

[学位论文] 代娟重庆医科大学 2019年硕士导师: 蔡雪飞共86页

摘要 : 目的：构建包含HBV POL-TP和HBC基因的原核表达重组质粒，转化至大肠杆菌诱导培养表达HBC和POL-TP重组蛋白。分别以两种重组蛋白为底物，通过噬菌体多肽文库筛选出能与重组蛋白 HBC 和 POL-TP 特异性结合的多肽，在HBV细胞模型中验证多肽在不同浓度作... 展开目的：构建包含HBV POL-TP和HBC基因的原核表达重组质粒，转化至大肠杆菌诱导培养表达HBC和POL-TP重组蛋白。分别以两种重组蛋白为底物，通过噬菌体多肽文库筛选出能与重组蛋白 HBC 和 POL-TP 特异性结合的多肽，在HBV细胞模型中验证多肽在不同浓度作用下对HBV复制的调控作用，从中筛选出具有抗病毒作用的靶向多肽。方法：分析HBC(183aa)和HBV POL-TP(192 aa)的DNA 序列并通过在线生物信息学软件进行稀有密码子优化后全序列人工合成。将合成后的HBC149 DNA和 POL-TP DNA 插入原核表达载体分别构建 pET28a(+)/HBC149 和pET28a(+)/POL-TP 重组质粒。将两种重组质粒转化至大肠杆菌后进行自诱导培养，收获重组HBC149蛋白和重组POL-TP蛋白并进行纯化鉴定。重组HBC149和POL-TP蛋白作为底物与噬菌体多肽文库结合并淘选，除去结合力低的噬菌体，保留下结合力高的噬菌体，最后富集得到与靶蛋白特异结合力最高的噬菌体。对噬菌体的多肽展示区测序并按照测序结果合成一批备选多肽。将多肽按照不同浓度加入稳定表达 HBV 的肝癌细胞 HepAD38 进行模拟药物处理，通过细胞活性检测仪检测不同的多肽对 HepAD38 细胞增殖的作用。通过荧光定量 PCR 和Southern blot检测细胞裂解液中HBV复制中间体的表达水平。结果：（1）通过对pET28a(+)/POL-TP和pET28a(+)/HBC149质粒进行双酶切电泳，测序验证重组质粒构建正确；通过重组大肠杆菌的自诱导培养，破菌上清中含有大量重组HBC149蛋白和POL-TP蛋白，经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定蛋白表达无误。（2）通过重组表达蛋白与噬菌体多肽库结合后进行三轮淘选最后富集得到与靶蛋白特异结合力最高的噬菌体（多肽）后测序合成，共获得 8条多肽。（3）在HBV稳定表达的细胞系HepAD38内检测多肽对细胞增殖的影响：将多肽进行不同浓度稀释并作用于HepAD38,每隔24小时换液以确保多肽浓度在工作范围内。结果表明：在低浓度时，8 条多肽对细胞增殖无明显作用，在较高浓度时有对细胞增殖存在一定作用。（4）通过荧光定量PCR和Southern blot检测多肽处理后的HepAD38中HBV复制中间体DNA的表达水平，结果表明TP-2， TP-3，TP-4，TP-5均具有一定的抑制作用，TP-8具有较明显的促进作用。结论：采取自诱导培养的方法，成功表达与 HBV 相关的可溶性的 HBC 和POL-TP重组蛋白，通过噬菌体多肽文库筛选获得一批与重组蛋白HBC或POL-TP蛋白特异性结合的多肽；在细胞水平筛选出 3条对 HBV复制具有抑制作用的多肽，同时筛选出1条对HBV复制具有促进作用的多肽。收起

关键词 : 乙型肝炎病毒噬菌体多肽文库靶向多肽 HBC蛋白 POL-TP蛋白细胞模型

8. Grb7蛋白SH2结构域结合新型非磷酸化模序的研究

[学位论文] 张丹北京协和医学院 2011年博士导师: 高友鹤共98页

摘要 : Grb7蛋白是一种接头蛋白，该蛋白是Grb7蛋白家族的成员之一，这个蛋白家族包括Grb7，Grb10和Grb14三个成员。现在研究发现，Grb7蛋白在一些恶性肿瘤组织中，尤其是高转移性肿瘤组织中处于高表达状态，比如乳腺癌，食管癌，胃癌等。编码Grb7蛋白的基因... 展开

关键词 : SH2结构域 Grb7蛋白非磷酸化肽段随机多肽文库酵母双杂交

9. 应用噬菌体递呈随机肽库研究EB病毒相关抗原表位

[学位论文] 张颖中山大学 2002年硕士导师: 肖锡宾共71页

摘要 : 目的：应用噬菌体肽库递呈技术,研究EB病毒相关的抗原表位,为基于抗原表位水平的鼻咽癌特异诊断试剂的研制、疫苗的设计及临床分期提供依据.结论：利用从鼻咽癌血清中洗脱的EB病毒相关抗体或用鼻咽癌血清和健康血清中的IgA抗体,均可以从随机肽库中筛选... 展开

关键词 : 抗原表位随机多肽文库多克隆抗体鼻咽肿瘤

10. 应用噬菌体肽文库筛选HFRSV优势B细胞结合表位肽

[学位论文] 王倩南方医科大学 2008年硕士导师: 俞守义共52页

摘要 : 目的：应用噬菌体展示肽文库筛选鉴定肾综合征出血热病毒优势B细胞结合表位肽。方法：以Protein-A纯化的肾综合征出血热病人恢复期血清为筛选配基，对经正常人血清预吸附的噬菌体展示随机12肽文库(或次级肽文库)进行生物亲和淘选：夹心ELISA、竞... 展开

关键词 : 噬菌体肽文库肾综合征出血热基因工程多肽疫苗