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2022年11月29日

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1. hc71基因的功能初步研究睫状神经营养因子在甲醇酵母中的表达

[学位论文] 张惠堂中国科学院上海生命科学研究院 2003年博士导师: 龚毅;杨胜利共82页

摘要 : 该论文第一部分是对hc71(C17orf25)基因的功能初步研究,hc71基因是肝癌组织染色体17p13.3杂合性缺失区的一个基因,全长1.8Kb左右,编码313个氨基酸的34.7KD的蛋白.免疫组化实验表明其在肝癌及癌旁组织均有高表达.将hc71基因与绿色荧光蛋白基因融合后确... 展开该论文第一部分是对hc71(C17orf25)基因的功能初步研究,hc71基因是肝癌组织染色体17p13.3杂合性缺失区的一个基因,全长1.8Kb左右,编码313个氨基酸的34.7KD的蛋白.免疫组化实验表明其在肝癌及癌旁组织均有高表达.将hc71基因与绿色荧光蛋白基因融合后确定了HC71蛋白在细胞中的亚定位在线粒体.利用酵母双杂交的方法筛选出一些与HC71蛋白相互作用的蛋白,其中近一半蛋白是线粒体蛋白,并且可能与细胞死亡有关.其中hbd291即ADP-ribose焦磷酸水解酶基因nudt9,可能与细胞凋亡有关.而与HC71蛋白同源的乙二醛酶与细胞凋亡也有一定的关系.利用MTT比色实验对瞬时转染hc71的细胞凋亡情况和细胞生存能力进行检测,发现HC71能够影响细胞的生长.与hbd291基因共转染细胞后对细胞的死亡表现出一定的抑制作用.因此,HC71能够影响细胞的生理活动.该论文的工作为将来进一步研究HC71的功能打下了基础.该论文第二部分是对睫状神经营养因子(CNTF)在甲醇酵母中的表达研究,比较CNTF分别在大肠杆菌中和在甲醇酵母中的表达情况,改善和提高CNTF的表达量,有助于日后以药用为目的的CNTF大规模生产. 收起

关键词 : HC71 C17orf25 酵母双杂交 CNTF 甲醇酵母

2. 水稻自主开花途径相关基因OsFY和OsFVE的克隆与功能分析

[学位论文] 陆奇上海大学 2006年硕士导师: 许政暟;宋任涛共94页

摘要 : 花发育的分子遗传学研究是90年代以来植物发育分子生物学的一个研究热点。水稻作为单子叶植物的代表植物，是最重要的粮食经济作物之一。水稻中的花发育研究直接决定着粮食的产量，此外，对水稻花发育的认识也将有助于我们了解在不同植物物种中进化的... 展开花发育的分子遗传学研究是90年代以来植物发育分子生物学的一个研究热点。水稻作为单子叶植物的代表植物，是最重要的粮食经济作物之一。水稻中的花发育研究直接决定着粮食的产量，此外，对水稻花发育的认识也将有助于我们了解在不同植物物种中进化的遗传和发育机制。目前人们发现水稻的开花促进途径有光周期途径和赤霉素途径，而是否存在内源性的自主开花促进途径人们并不确定。为此，我们克隆了水稻中的自主开花途径的同源基因OsFY、OsFVE，并对它们的功能进行了初步研究。我们分离了OsFYcDNA序列，该序列全长2,308bp，通过文献查阅和数据搜索我们发现，该OsFYcDNA序列是一条新的包含全长编码区的单子叶FYcDNA序列。我们预测的OsFY蛋白全长717个氨基酸，与拟南芥的FY蛋白有56％氨基酸同源性，并且包含了拟南芥FY蛋白中的所有保守结构域。在拟南芥中，FY蛋白通过与FCA发生蛋白相互作用来调节开花时间。我们利用酵母双杂交实验研究了OsFY蛋白和OsFCA蛋白的互作情况，结果发现，OsFY蛋白也能够与OsFCA蛋白发生互作，从而验证了这种互作模式在单子叶植物和双子叶植物进化上的保守性。通过网络数据挖掘，我们发现拟南芥自主开花途径中的其他基因在水稻中也有同源性较高的对应基因存在，并且都有表达，为水稻中自主开花途径的存在提供了强有力的证据。另外，我们分离了OsFVEcDNA序列，该序列全长1420bp，包含了OsFVE全长编码区，我们预测的OsFVE蛋白序列与拟南芥中的FVE蛋白序列有68％的氨基酸同源性，也具有保守的六个WD结构域。为了验证OsFVE与拟南芥FVE基因在开花调控功能上是否具有保守性，我们构建了OsFVE表达载体，通过农杆菌转化拟南芥晚花突变体fve-1，进行功能互补实验，但是，我们获得的转基因株最终都表现出晚花，而没有表现出早花的互补表型，说明OsFVEcDNA并不能互补拟南芥FVE基因的突变。同时我们发现，筛选培养基中的蔗糖对拟南芥晚花突变体fve-1的开花表型有影响，低浓度的蔗糖促进fve-1开花。通过本实验，我们继OsFCA的研究之后，验证了另外一个自主开花途径成员FY在单子叶植物水稻中的存在以及功能上的保守性。然而水稻中OsFVE的研究也告诉我们：并不是所有的自主开花途径成员在水稻中的同源物都保持了功能上的保守性，某些同源基因在功能上发生了一定程度的变异。综上所述，我们认为水稻中也存在自主开花途径，但相应基因的表达调控上已出现了分化。收起

关键词 : OsFY OsFCA OsFVE 酵母双杂交水稻

3. 小麦生理型雄性不育激素代谢通路差异基因挖掘及TaRVE6功能研究

[学位论文] 魏霁桐西北农林科技大学 2021年硕士导师: 宋瑜龙共81页

摘要 : SQ-1是我国自主研发的，具有自主知识产权的一类新型高效哒嗪类小麦化学杂交剂，对推动杂交小麦产业化应用起到了重要作用，然而其诱导小麦花粉败育机理仍不清楚。因此本研究拟利用RNA-seq技术筛选PHYMS-1376及其对照CK-1376可育系花药各时期差异表达... 展开 SQ-1是我国自主研发的，具有自主知识产权的一类新型高效哒嗪类小麦化学杂交剂，对推动杂交小麦产业化应用起到了重要作用，然而其诱导小麦花粉败育机理仍不清楚。因此本研究拟利用RNA-seq技术筛选PHYMS-1376及其对照CK-1376可育系花药各时期差异表达基因，并对其进行通路分析，富集到了大量与JA和ABA信号传导通路相关基因，同时对花药内源JA和ABA含量进行检测，分析了内源激素与SQ-1诱导花粉败育之间的关系，同时对五个发育时期共有的差异基因之一，且参与植物抗逆胁迫、GA和ABA生物合成过程的RVE家族基因TraesCS1A02G107700.1进行了功能解析，以期所获结果可以丰富SQ-1诱导小麦生理型雄性不育花粉败育理论。主要结果如下： 1、对CK-1376和PHYMS-1376五个时期花药进行转录组测序，共获得36058个差异基因，其中上调基因18108个，下调基因17950个，97个差异基因在五个时期同时表达，通路分析发现：上述差异表达基因主要富集在植物激素信号传导，苯丙烷类生物合成，淀粉和蔗糖的代谢等途径，且植物激素信号传导途径在四分体时期富集到的差异基因比例最高，约占16%，说明植物激素信号传导通路异常可能与化学杀雄剂诱导小麦花粉败育密切相关。 2、对CK-1376和PHYMS-1376五个时期花药内源JA和ABA含量及其调控通路核心基因表达模式进行分析，结果发现：与CK-1376相比，PHYMS-1376花药内源JA含量四分体时期，单核晚期以及三核期显著降低，而单核早期，二核期显著升高（P＜0.05）；内源ABA含量在PHYMS-1376花药发育的四分体至三核期均高于CK-1376，其中单核早期、单核晚期、二核期和三核期ABA含量均呈显著增加（P＜0.05），且内源JA和ABA通路关键基因表达模式存在显著差异，其中TraesCS1D02G271000表达模式与ABA含量高度相关，表明PHYMS-1376花药发育过程中JA及ABA含量的异常变化可能与SQ-1诱导小麦花粉败育紧密相关。 3、利用PCR技术克隆获得了一个启动子区域内含有ABA和MeJA等多种激素反应元件的转录因子TaRVE6，该基因编码的蛋白质含有219个氨基酸，分子量约24.8KD，PI=7.16，且qRT-PCR分析发现TaRVE6表达量在PHYMS-1376五个时期花药中均显著高于对照CK-1376可育系（P＜0.05）。亚细胞定位结果显示TaRVE6蛋白主要在细胞核内；过表达TaRVE6可以促进拟南芥提前开花，莲座叶片增多，叶面积增大，荚果伸长，表明TaRVE6对植物的生长发育以及开花时间有一定影响，同时也与SQ-1诱导的小麦花粉败育过程密切相关，但过表达该基因本身不具有降低拟南芥育性的功能，推测该转录因子可能受其他蛋白因子互作影响，以至于伴随着小麦花粉败育过程。 4、利用酵母双杂交技术筛选获得了一个与ABA合成途径相关的TaRVE6互作蛋白TaMYB5-like。该蛋白质含272个氨基酸，分子量约29.3kD，PI=6.18，且具有SANT结构域，比较TaMYB5-like和TaRVE6表达模式发现，在单核晚期和二核期上述2个基因具有相同的表达模式，但在四分体时期、单核早期、三核期花药中表达模式不一致（P＜0.05），表明TaMYB5-like和TaRVE6之间的互作关系，可能受其他因子干扰，且协同影响小麦花药内源激素平衡，共同参与小麦化学杂交剂SQ-1诱导花粉败育过程。收起

关键词 : 小麦酵母双杂交转录组测序

4. 小麦钾离子转运蛋白TaHAK1和TaHAK5基因的功能验证及调控机制研究

[学位论文] 董月河南农业大学 2023年硕士导师: 程西永共58页

摘要 : 钾是小麦生长发育必需的营养元素之一，提高钾肥的利用效率有利于小麦的高产、稳产。KUP/HAK/KT家族在植物中介导钾离子的跨膜吸收转运。本课题组前期从小麦钾高效利用品种豫农804中克隆得到了钾离子转运体基因TaHAK1b-2BL和TaHAK5-3DL；通过研究发现... 展开钾是小麦生长发育必需的营养元素之一，提高钾肥的利用效率有利于小麦的高产、稳产。KUP/HAK/KT家族在植物中介导钾离子的跨膜吸收转运。本课题组前期从小麦钾高效利用品种豫农804中克隆得到了钾离子转运体基因TaHAK1b-2BL和TaHAK5-3DL；通过研究发现TaHAK1和TaHAK5基因均属于KUP/HAK/KT家族中的ClusterI，在钾吸收缺陷型酵母突变体中验证了这2个基因均具有转运钾离子的能力。本研究在拟南芥中进一步对TaHAK1和TaHAK5的功能进行了验证，通过GUS组织染色分析了TaHAK5在拟南芥幼苗中的表达部位；利用膜系统酵母双杂交和酵母单杂交试验，初步探索TaHAK5在植物体内的调控机制，为小麦钾离子吸收的调控分子机理研究奠定基础。主要研究结果如下： 1.TaHAK1和TaHAK5在拟南芥中的功能分析采用浸花法将TaHAK1和TaHAK5转入拟南芥野生型WT与单突变体athak5、双突变体athak5/akt1中，结果表明在足量K+（1mM）的条件下，TaHAK1和TaHAK5转基因拟南芥株系的根长、丙二醛含量及脯氨酸积累量与对照株系无显著差异，而在K+浓度不足（0.01mM、0mM）的条件下，TaHAK1和TaHAK5转基因拟南芥株系的根长和脯氨酸积累量显著高于对照株系，丙二醛含量显著低于对照株系。说明TaHAK1和TaHAK5均具有在低钾环境中促进植物根系生长以及吸收转运K+的功能，并且降低了低钾胁迫后植株中丙二醛的含量，增加了脯氨酸的积累，增强了植株对低钾胁迫的耐受性。 2.TaHAK1和TaHAK5在酵母中的耐盐性分析将TaHAK1和TaHAK5转入钾敏感型突变体酵母菌株CY162中，并分别在添加梯度浓度Na+的正常钾（10mMK+）和低钾（0.1mMK+）的AP-U培养基上进行培养。结果表明，当K+浓度充足（10mM）时，各转化酵母均生长良好，随着NaCl浓度升高至750mM，转空载体的酵母不生长，而转TaHAK5和TaHAK1的酵母可以生长；当K+浓度较低（0.1mM）时，转空载体的酵母不能生长，而转TaHAK5和TaHAK1的酵母正常生长，甚至在NaCl浓度为500mM的培养基上也能生长，且转TaHAK5的酵母比TaHAK1长势较好。以上结果说明TaHAK5是一种对Na+不敏感的高亲和力K+吸收蛋白。 3.TaHAK1和TaHAK5的互作蛋白筛选将TaHAK1和TaHAK5分别转入NMY51酵母菌株，通过膜系统酵母双杂交技术筛选与其互作的蛋白。毒性及自激活活性检测表明诱饵载体TaHAK1-pBT3-N、TaHAK5-pBT3-N对此系统无毒性和自激活活性，可以进行筛库试验。通过文库筛选鉴定出21个可能与TaHAK1互作的蛋白和21个可能与TaHAK5互作的蛋白。这些基因的功能涉及植物抗病、信号转导、器官形态建成、抗逆等多个方面。通过酵母点对点试验和双荧光素酶互补试验验证出与TaHAK1互作的蛋白TaNHL、与TaHAK5互作的蛋白TaGRF1-D。 4.TaHAK1和TaHAK5启动子顺式作用元件及组织表达特性分析利用在线网站PlantCARE分析TaHAK1和TaHAK5基因ATG前2000bp序列中包含的顺式作用元件。结果表明，这2个基因的启动子区有15个相同的顺式作用元件，这些元件与激素响应、光响应以及胁迫响应相关。TaHAK1启动子中有5个特异性基序，在TaHAK5基因启动子中则检测到11个特异性基序。将TaHAK1和TaHAK5基因的启动子序列连接GUS载体，洋葱表皮细胞预试验结果发现，转化pTaHAK5-GUS的洋葱表皮细胞中观察到蓝色，而转化pTaHAK1-GUS的洋葱表皮细胞没有变蓝，说明在洋葱表皮细胞中，TaHAK5的启动子具有启动活性，TaHAK1的启动子活性较低。将pTaHAK5-GUS转化拟南芥，结果表明TaHAK5启动子驱动的GUS主要在拟南芥幼苗的气孔和胚轴中表达，而在根中不表达。 5.TaHAK5上游调控蛋白的筛选将TaHAK5启动子片段转入Y1HGold酵母，通过酵母单杂交技术筛选上游调控转录因子。经过文库筛选得到2个转录因子：TaWRKY96和TaNAC71。酵母点对点验证试验表明含有猎物载体质粒和TaWRKY96-AD质粒的Y1H酵母能够在SD/-Leu+AbA500的抑制缺陷培养基上生长。双萤光素酶报告基因活性检测试验表明，TaWRKY96能够使TaHAK5启动子活性上调近3倍。说明TaWRKY96对TaHAK5存在调控作用。收起

关键词 : 小麦 TaHAK1基因 TaHAK5基因酵母双杂交酵母单杂交

5. 香蕉条斑病毒编码蛋白间的互作研究

[学位论文] 林湛松海南大学 2011年硕士导师: 刘志昕共70页

摘要 : 香蕉条斑病毒(Banana streak virus，BSV)是一种最近几十年才发现、鉴定的植物病毒，是香蕉条斑病的病原物，属花椰菜花叶病毒科，杆状DNA病毒属，目前，尚无有效的检测和防治方法。其基因组为双链环状DNA，大小7500bp左右，共有三个编码框，其中ORFⅠ... 展开香蕉条斑病毒(Banana streak virus，BSV)是一种最近几十年才发现、鉴定的植物病毒，是香蕉条斑病的病原物，属花椰菜花叶病毒科，杆状DNA病毒属，目前，尚无有效的检测和防治方法。其基因组为双链环状DNA，大小7500bp左右，共有三个编码框，其中ORFⅠ产物(PⅠ蛋白)和ORFⅡ产物(PⅡ蛋白)功能尚不明确。本实验同时使用细菌双杂交系统和酵母双杂交系统，研究了香蕉条斑病毒自身编码的PⅠ、PⅡ和外壳蛋白(CP)之间的相互作用： 1.细菌双杂交系统诱饵质粒和猎物质粒的构建、自激活作用检测及双杂交实验。构建BSV ORFⅠ，ORFⅡ和CP的诱饵及猎物质粒，最终通过双杂交试验来初步鉴定三种蛋白质组分的互作情况。本实验设计了三对含有内切酶位点接头的特异性引物，通过PCR的方法扩增得到三个目的基因序列，经过限制性内切酶切割以及T4 DNA连接酶连接后将其分别连至pBT和pTRG载体上，获得重组诱饵和猎物质粒。DNA测序结果表明，6个重组质粒中编码区的碱基序列和阅读框均正确。将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，为了测试以上质粒有无自激活现象，将转化子涂布于no3-AT平板及3-AT平板上37℃培养，观察菌落生长情况，期间以空pTRG及空pBT质粒共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’报告菌株作为阴性对照，观察菌落生长情况，结果显示，6个重组质粒均无自主活化现象，可用于下一步的文库筛选实验。将3种诱饵质粒和3种猎物质粒通过不同组合、配对共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，利用下游的链霉素抗性和HIS报告基因检测各种配对的互作情况。结果表明，PⅡ/CP，PⅡ/PⅡ，CP/CP三组配对均具有强烈的互作，而其他组合则仅有微弱互作甚至无互作。 2.酵母双杂交系统诱饵质粒和猎物质粒的构建、自激活作用检测及双杂交实验。由于细菌双杂的一些局限性，为了进一步确证实验结果，本实验同时采用酵母双杂系统检验上述3种蛋白的互作情况。设计特异引物，通过PCR扩增得到含有GatewayTM技术重组接头的3个目的片段，利用GatewayTM技术，通过BP和LR两步重组反应，将3个目的片段分别重组到pDESTTM32与pDESTTM22质粒上，构建了3个目的片段的诱饵质粒和猎物质粒。将重组质粒转化酵母MaV203感受态细胞，并设置不同对照，验证6种重组质粒的自激活现象。结果表明，6种重组质粒均具有微弱的自激活现象，但这种自激活可以被50mM浓度以下的3-AT所抑制，故可以用于下一步的双杂交试验。将3种诱饵质粒和3种猎物质粒按照不同组合、配对共转化酵母MaV203感受态细胞，通过下游的报告基因检测各种配对之间的互作现象。结果表明：PⅡ/CP，PⅡ/PⅡ，CP/CP三组配对均具有强烈的互作，而其他组合则仅有微弱互作甚至无互作，以上结果完全符合细菌双杂的结果。收起

关键词 : 香蕉条斑病毒自身编码外壳蛋白细菌双杂交酵母双杂交

6. 布鲁氏菌分泌蛋白BspA调控宿主细胞关键分子的筛选及功能分析

[学位论文] 陶婷婷石河子大学 2021年硕士导师: 张辉共79页

摘要 : 目的：本试验旨在筛选与布鲁氏菌分泌蛋白BspA互作的细胞靶蛋白，并研究BspA与宿主细胞靶蛋白互作过程中的生物学功能，揭示布鲁氏菌分泌蛋白BspA调控细菌胞内寄生的分子机制，为布鲁氏菌致病机制的研究奠定基础。方法：（1）利用卡纳抗性替换的... 展开目的：本试验旨在筛选与布鲁氏菌分泌蛋白BspA互作的细胞靶蛋白，并研究BspA与宿主细胞靶蛋白互作过程中的生物学功能，揭示布鲁氏菌分泌蛋白BspA调控细菌胞内寄生的分子机制，为布鲁氏菌致病机制的研究奠定基础。方法：（1）利用卡纳抗性替换的方法构建布鲁氏菌分泌蛋白BspA缺失株，并利用生物信息学软件对BspA进行生物信息学分析。通过TMHMMServerv.2.0在线软件对BspA蛋白质跨膜结构域进行预测分析，通过PredictingAntigenicPeptides在线分析软件对BspA蛋白质的抗原决定簇进行预测分析，通过GalaxyTBM和SWISS-MODEL分别对BspA蛋白的二级结构和三级结构进行分析，通过cNLSMapper和NetNES1.1Server分别对BspA蛋白的核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）进行预测分析。（2）利用分子克隆技术对牛种布鲁氏菌S2308株IV型分泌系统（T4SS）分泌蛋白BspA进行克隆、测序，将其连接到pGBKT7诱饵载体上，构建重组诱饵载体，并检测重组诱饵载体对Y2HGold的毒性和自激活性，再将含有重组诱饵质粒的酵母菌和含有AD文库质粒的酵母菌双杂交进行互作蛋白的筛选，再利用酵母共转的方法进一步来验证BspA与宿主靶蛋白是否互作。（3）建立布鲁氏菌野生型和BspA缺失株侵染RAW264.7细胞模型，利用siRNA干扰技术合成si-C1qbp并转入RAW264.7细胞，qRT-PCR检测si-C1qbp的干扰效率；布鲁氏菌S2308和ΔBspA感染RAW264.7细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后，qRT-PCR检测C1qbpmRNA表达水平；将si-C1qbp转入RAW264.7细胞，并分别用布鲁氏菌S2308和ΔBspA感染后，qRT-PCR检测p65、IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA相对表达量。结果：（1）成功构建缺失株BspA，至少稳定遗传15代。通过生物信息学方法分析预测得到，BspA蛋白有跨膜结构域，抗原决定簇有5个，有核定位信号和核输出信号，蛋白质二级结构中有114个氨基酸构成BspA蛋白中的α螺旋；有20个氨基酸构成其延伸链；有6个氨基酸构成β转角；有50个氨基酸构成不规则卷曲。蛋白质三级结构中有大量的不规则卷曲、α螺旋和延伸链。（2）牛种布鲁氏菌S2308株BspA基因克隆正确，长度为576bp，与预期结果一致并且成功连接到pGBKT7载体上，构建的重组诱饵载体对酵母细胞无毒副作用，有自激活性，能够用于酵母双杂交实验。酵母双杂交结果筛选到4个阳性克隆，经测序四个基因分别为Cqbp补体成分1，q亚成分结合蛋白、氯化物细胞内通道蛋白1、DNA定向的RNA聚合酶I和III亚基RPAC2亚型2、铜/锌超氧化物歧化酶。并成功验证BspA与C1qbp互作。（3）C1qbpsiRNA-2干扰效果最为显著（plt;0.05）；布鲁氏菌的感染均抑制了IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达，且显著抑制p65mRNA表达（Plt;0.05）；与Brucella+si-NC组相比，Brucella+si-C1qbp组均抑制了IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达，且极显著抑制了p65mRNA表达（Plt;0.01），ΔBspA-NC组显著上调了p65、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平（Plt;0.05），极显著上调了IL-6mRNA表达水平（Plt;0.01）；而与ΔBspA+si-NC组相比，ΔBspA+si-C1qbp组均消除了ΔBspA对p65、IL-1β、IL-6mRNA表达水平的上调效果，且对TNF-αmRNA的下调效果显著（Plt;0.05）。结论：（1）成功构建流产布鲁氏菌分泌蛋白BspA缺失株，并且稳定遗传15代。（2）筛选到4种可能与BspA相互作用的候选蛋白：C1qbp、CLIC1、DNA定向的RNA聚合酶I和III亚基RPAC2亚型2、铜/锌超氧化物歧化酶。并成功验证BspA与C1qbp相互作用。（3）在布鲁氏菌胞内寄生期间，布鲁氏菌的BspA基因抑制RAW264.7细胞的C1qbp基因表达，而C1qbp基因能够促进促炎细胞因子表达；布鲁氏菌的BspA基因和RAW264.7细胞的C1qbp基因互作能够抑制NF-κB信号通路的活化，进而减缓炎症的发生。收起

关键词 : 布鲁氏菌 BspA 酵母双杂交 siRNA

7. 酵母双杂交系统筛选DND1相互作用蛋白

[学位论文] 张菁湖南师范大学 2008年硕士导师: 彭小宁共77页

摘要 : 目的：应用酵母双杂交系统筛选小鼠胚胎cDNA文库中与DND1相互作用的蛋白，进一步明确Dnd1的生物学功能，为探明Dnd1的信号传导通路及阐明Dnd1基因在TGCT发生中的分子机制奠定基础。方法：①PCR法从胚胎cDNA文库扩增小鼠Dndl基因编码区序列，构建... 展开目的：应用酵母双杂交系统筛选小鼠胚胎cDNA文库中与DND1相互作用的蛋白，进一步明确Dnd1的生物学功能，为探明Dnd1的信号传导通路及阐明Dnd1基因在TGCT发生中的分子机制奠定基础。方法：①PCR法从胚胎cDNA文库扩增小鼠Dndl基因编码区序列，构建重组质粒pMD18-T-Dnd1，再将Dnd1基因片段亚克隆至诱饵载体pDBLeu并对重组诱饵质粒pDBLeu-Dndl进行酶切及测序鉴定。②将诱饵质粒转化酵母宿主菌，β-半乳糖苷酶滤纸法检测其对报告基因LacZ的激活作用；观察转化后酵母菌的生长状态及增殖速度，分析其对宿主菌的毒性作用。③确定合适的3AT浓度，而后将文库质粒pPC86-Library转化含诱饵质粒的酵母菌并涂布于营养缺陷培养基进行三轮筛选并用β-半乳糖苷酶滤纸法分析其LacZ表型。④提取阳性克隆酵母质粒，电转化E.coli DH10B，利用Amp1LB平板筛选文库质粒转化子，提取质粒，PCR确定文库质粒片段大小，并检测文库质粒AD-Library自身激活作用，最后文库质粒转化含诱饵质粒的酵母菌验证蛋白相互作用。对最终确定的阳性克隆文库质粒测序并对测序结果进行初步分析。结果：①酶切和测序分析表明Dnd1基因序列及读码框均正确。②诱饵质粒pDBLeu-Dnd1成功转化酵母菌MaV203，经检测其无自身激活作用且对酵母菌无毒性。③确定了最适3AT浓度为30mM，转化文库后经三轮筛选，分别得到172，10和8个阳性克隆。④生物信息学分析显示，8个阳性克隆文库质粒分别编码4种蛋白，分别为Jun蛋白、辅肌动蛋白α1、核受体结合蛋白1和氯离子通道2，并且均有重要的生物学功能。结论：①成功构建诱饵质粒pDBLeu-Dnd1。②诱饵质粒pDBLeu-Dnd1没有自身激活作用和毒性作用，可用于该酵母双杂交系统进行文库筛选。③筛选小鼠胚胎cDNA文库得到4个与DND1相互作用的蛋白，分别为Jun蛋白、辅肌动蛋白α1、核受体结合蛋白1和氯离子通道2。收起

关键词 : 酵母双杂交系统筛选

8. 拟南芥种子储藏蛋白AtSSA3的功能初探

[学位论文] 常乐东北林业大学 2021年硕士导师: 卜媛媛共63页

摘要 : 种子储藏蛋白(SeedStorageProtein，SSP)是成熟种子中含量最为丰富的蛋白质，不仅影响种子的品质，而且还是种子萌发和幼苗生长的能量来源。本课题组前期研究发现氮素代谢途径相关缺失突变体可显著提高植物对盐胁迫的耐受性，转录组测序技术进一步对盐... 展开种子储藏蛋白(SeedStorageProtein，SSP)是成熟种子中含量最为丰富的蛋白质，不仅影响种子的品质，而且还是种子萌发和幼苗生长的能量来源。本课题组前期研究发现氮素代谢途径相关缺失突变体可显著提高植物对盐胁迫的耐受性，转录组测序技术进一步对盐处理下氮素代谢途径缺失突变体的分析表明，种子储藏蛋白基因AtSSA3能够响应盐胁迫且盐处理下显著下调表达。因此，进一步探究AtSSA3基因在植物响应盐胁迫过程中所发挥的功能，为更好的深入研究氮素代谢与植物耐盐性之间的关系提供理论依据。 1.通过实时定量PCR分析种子储藏蛋白基因AtSSA3的表达特性，结果显示该基因在植物整个生长发育周期均有不同程度的表达，在干种子中表达量最大。与NaCl，NH4Cl，Urea，ABA及GA3存在明显应答关系，受NaCl，NH4Cl及ABA的诱导AtSSA3基因显著下调表达；Urea处理下AtSSA3基因显著上调表达；GA3处理下，AtSSA3基因表达量随处理时间的增加先升高后降低。 2.在盐处理下解析AtSSA3基因缺失突变体(atssa3)材料，结果显示：盐处理下atssa3的种子萌发率要明显高于野生型(WT)，atssa3的长势和根长也优于WT，且atssa3的NH4+含量低于WT，即AtSSA3基因的缺失可以减少盐胁迫下植物体内的NH4+含量，从而明显提高植物对盐胁迫的耐受性。 3.通过酵母双杂交技术进一步筛选与种子储藏蛋白AtSSA3相互作用的蛋白，结果共获得12个阳性菌株，酵母共转化验证后确定AtARA4与AtSSA3之间存在相互作用。通过蛋白诱导分别获得AtARA4与AtSSA3表达的最佳条件，体外Pull-down实验进一步验证AtARA4与AtSSA3之间存在相互作用。综上，本研究对种子储藏蛋白AtSSA3的功能进行了初步探究，为深入探究该基因在植物响应盐胁迫过程中发挥的功能奠定了基础。收起

关键词 : 种子储藏蛋白 AtSSA3 酵母双杂交

9. GbTLP1在棉花纤维发育中的功能解析

[学位论文] 朱思涛华中农业大学 2016年硕士导师: 涂礼莉共55页

摘要 : 棉花是世界上重要的经济作物之一。棉花纤维起始于胚珠表皮细胞，经过快速伸长而形成单细胞种子表皮毛。棉纤维发育包括纤维细胞的起始、初生壁伸长、次生壁加厚和成熟四个互相重叠的阶段。棉纤维细胞在-3～3 DPA（days post anthesis，开花后天数）起... 展开棉花是世界上重要的经济作物之一。棉花纤维起始于胚珠表皮细胞，经过快速伸长而形成单细胞种子表皮毛。棉纤维发育包括纤维细胞的起始、初生壁伸长、次生壁加厚和成熟四个互相重叠的阶段。棉纤维细胞在-3～3 DPA（days post anthesis，开花后天数）起始，这个阶段主要决定棉花纤维的衣分;初生壁伸长阶段(5～20 DPA)主要决定纤维长度;次生壁加厚阶段(20～40 DPA)主要决定纤维细度、马克隆值和强度。本实验室早期创建了海岛棉纤维发育相关基因的cDNA文库，克隆了一个在纤维次生壁优势表达的类甜蛋白基因，命名为GbTLP1(TLP，Thaumatin-like protein)。Gb TLP1在棉花次生壁加厚时期优势表达，通过农杆菌转化法获得了表达量上调和下调的转基因棉花株系。在本研究中，考察超表达系OE15、OE38、OE48和干涉系I53、I84、I88的纤维性状，考种数据表明，超表达和干涉GbTLP1都导致纤维长度变短;超表达Gb TLP1马克隆值下降，干涉GbTLP1马克隆值增加。成熟纤维横切面扫描电镜的结果表明，超表达GbTLP1导致细胞壁变薄，而干涉Gb TLP1细胞壁变厚。次生壁纤维素合酶基因GhCESA7在超表达系中表达量下调。酵母双杂交结果表明GbTLP1能和GhRDL1、GhOsmotin互作。已有文献报道在棉花中超表达脱水响应蛋白GhRDL1促进纤维的伸长;渗透蛋白GhOsmotin能提高植株的抗性。本研究发现GhOsmotin在纤维次生壁时期优势表达，与GbTLP1属于同一病程相关蛋白PR5。GhRDL1在超表达株系中上调，而GhOsmotin超表达株系中下调，因此可推测GbTLP1与GhOsmotin和GhRDL1相互作用共同影响纤维次生壁发育。收起

关键词 : 次生壁类甜蛋白棉花纤维酵母双杂交

10. 水稻OsRacD互作蛋白编码基因的分离及功能鉴定

[学位论文] 梁卫红中国科学院遗传与发育生物学研究所 2004年博士导师: 吴乃虎共163页

摘要 : 光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的分子机理相当复杂,它涉及到光敏核不育基因与环境因子(光周期信号和温度)之间的相互作用,以及由此引起的信号转导通路的变化,最终导致幼穗发育模式的变化.基于以上观点,为深入研究农垦58S光周期育性转换的分子机... 展开光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的分子机理相当复杂,它涉及到光敏核不育基因与环境因子(光周期信号和温度)之间的相互作用,以及由此引起的信号转导通路的变化,最终导致幼穗发育模式的变化.基于以上观点,为深入研究农垦58S光周期育性转换的分子机理,该研究从该实验室分离的育性相关基因OsRacD出发,采用文库筛选的策略分离和分析该基因的启动子;同时以OsRacD为诱饵,采用酵母双杂交筛选OsRacD的互作蛋白以及在信号通路中的效应物分子.该研究的主要结果概括如下:1.农垦58S水稻基因组文库的构建以及OsRacD基因启动子的分离以农垦58S水稻黄化苗为材料,构建了基因组文库,经检测滴度达到10收起

关键词 : 水稻 OsRacD基因酵母双杂交互作蛋白

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