摘要: 钾是小麦生长发育必需的营养元素之一，提高钾肥的利用效率有利于小麦的高产、稳产。KUP/HAK/KT家族在植物中介导钾离子的跨膜吸收转运。本课题组前期从小麦钾高效利用品种豫农804中克隆得到了钾离子转运体基因TaHAK1b-2BL和TaHAK5-3DL；通过研究发现... 展开 钾是小麦生长发育必需的营养元素之一，提高钾肥的利用效率有利于小麦的高产、稳产。KUP/HAK/KT家族在植物中介导钾离子的跨膜吸收转运。本课题组前期从小麦钾高效利用品种豫农804中克隆得到了钾离子转运体基因TaHAK1b-2BL和TaHAK5-3DL；通过研究发现TaHAK1和TaHAK5基因均属于KUP/HAK/KT家族中的ClusterI，在钾吸收缺陷型酵母突变体中验证了这2个基因均具有转运钾离子的能力。本研究在拟南芥中进一步对TaHAK1和TaHAK5的功能进行了验证，通过GUS组织染色分析了TaHAK5在拟南芥幼苗中的表达部位；利用膜系统酵母双杂交和酵母单杂交试验，初步探索TaHAK5在植物体内的调控机制，为小麦钾离子吸收的调控分子机理研究奠定基础。主要研究结果如下： 1.TaHAK1和TaHAK5在拟南芥中的功能分析 采用浸花法将TaHAK1和TaHAK5转入拟南芥野生型WT与单突变体athak5、双突变体athak5/akt1中，结果表明在足量K+（1mM）的条件下，TaHAK1和TaHAK5转基因拟南芥株系的根长、丙二醛含量及脯氨酸积累量与对照株系无显著差异，而在K+浓度不足（0.01mM、0mM）的条件下，TaHAK1和TaHAK5转基因拟南芥株系的根长和脯氨酸积累量显著高于对照株系，丙二醛含量显著低于对照株系。说明TaHAK1和TaHAK5均具有在低钾环境中促进植物根系生长以及吸收转运K+的功能，并且降低了低钾胁迫后植株中丙二醛的含量，增加了脯氨酸的积累，增强了植株对低钾胁迫的耐受性。 2.TaHAK1和TaHAK5在酵母中的耐盐性分析 将TaHAK1和TaHAK5转入钾敏感型突变体酵母菌株CY162中，并分别在添加梯度浓度Na+的正常钾（10mMK+）和低钾（0.1mMK+）的AP-U培养基上进行培养。结果表明，当K+浓度充足（10mM）时，各转化酵母均生长良好，随着NaCl浓度升高至750mM，转空载体的酵母不生长，而转TaHAK5和TaHAK1的酵母可以生长；当K+浓度较低（0.1mM）时，转空载体的酵母不能生长，而转TaHAK5和TaHAK1的酵母正常生长，甚至在NaCl浓度为500mM的培养基上也能生长，且转TaHAK5的酵母比TaHAK1长势较好。以上结果说明TaHAK5是一种对Na+不敏感的高亲和力K+吸收蛋白。 3.TaHAK1和TaHAK5的互作蛋白筛选 将TaHAK1和TaHAK5分别转入NMY51酵母菌株，通过膜系统酵母双杂交技术筛选与其互作的蛋白。毒性及自激活活性检测表明诱饵载体TaHAK1-pBT3-N、TaHAK5-pBT3-N对此系统无毒性和自激活活性，可以进行筛库试验。通过文库筛选鉴定出21个可能与TaHAK1互作的蛋白和21个可能与TaHAK5互作的蛋白。这些基因的功能涉及植物抗病、信号转导、器官形态建成、抗逆等多个方面。通过酵母点对点试验和双荧光素酶互补试验验证出与TaHAK1互作的蛋白TaNHL、与TaHAK5互作的蛋白TaGRF1-D。 4.TaHAK1和TaHAK5启动子顺式作用元件及组织表达特性分析 利用在线网站PlantCARE分析TaHAK1和TaHAK5基因ATG前2000bp序列中包含的顺式作用元件。结果表明，这2个基因的启动子区有15个相同的顺式作用元件，这些元件与激素响应、光响应以及胁迫响应相关。TaHAK1启动子中有5个特异性基序，在TaHAK5基因启动子中则检测到11个特异性基序。 将TaHAK1和TaHAK5基因的启动子序列连接GUS载体，洋葱表皮细胞预试验结果发现，转化pTaHAK5-GUS的洋葱表皮细胞中观察到蓝色，而转化pTaHAK1-GUS的洋葱表皮细胞没有变蓝，说明在洋葱表皮细胞中，TaHAK5的启动子具有启动活性，TaHAK1的启动子活性较低。将pTaHAK5-GUS转化拟南芥，结果表明TaHAK5启动子驱动的GUS主要在拟南芥幼苗的气孔和胚轴中表达，而在根中不表达。 5.TaHAK5上游调控蛋白的筛选 将TaHAK5启动子片段转入Y1HGold酵母，通过酵母单杂交技术筛选上游调控转录因子。经过文库筛选得到2个转录因子：TaWRKY96和TaNAC71。酵母点对点验证试验表明含有猎物载体质粒和TaWRKY96-AD质粒的Y1H酵母能够在SD/-Leu+AbA500的抑制缺陷培养基上生长。双萤光素酶报告基因活性检测试验表明，TaWRKY96能够使TaHAK5启动子活性上调近3倍。说明TaWRKY96对TaHAK5存在调控作用。 收起