摘要: 香蕉条斑病毒(Banana streak virus，BSV)是一种最近几十年才发现、鉴定的植物病毒，是香蕉条斑病的病原物，属花椰菜花叶病毒科，杆状DNA病毒属，目前，尚无有效的检测和防治方法。其基因组为双链环状DNA，大小7500bp左右，共有三个编码框，其中ORFⅠ... 展开 香蕉条斑病毒(Banana streak virus，BSV)是一种最近几十年才发现、鉴定的植物病毒，是香蕉条斑病的病原物，属花椰菜花叶病毒科，杆状DNA病毒属，目前，尚无有效的检测和防治方法。其基因组为双链环状DNA，大小7500bp左右，共有三个编码框，其中ORFⅠ产物(PⅠ蛋白)和ORFⅡ产物(PⅡ蛋白)功能尚不明确。 本实验同时使用细菌双杂交系统和酵母双杂交系统，研究了香蕉条斑病毒自身编码的PⅠ、PⅡ和外壳蛋白(CP)之间的相互作用： 1.细菌双杂交系统诱饵质粒和猎物质粒的构建、自激活作用检测及双杂交实验。 构建BSV ORFⅠ，ORFⅡ和CP的诱饵及猎物质粒，最终通过双杂交试验来初步鉴定三种蛋白质组分的互作情况。本实验设计了三对含有内切酶位点接头的特异性引物，通过PCR的方法扩增得到三个目的基因序列，经过限制性内切酶切割以及T4 DNA连接酶连接后将其分别连至pBT和pTRG载体上，获得重组诱饵和猎物质粒。DNA测序结果表明，6个重组质粒中编码区的碱基序列和阅读框均正确。将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，为了测试以上质粒有无自激活现象，将转化子涂布于no3-AT平板及3-AT平板上37℃培养，观察菌落生长情况，期间以空pTRG及空pBT质粒共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’报告菌株作为阴性对照，观察菌落生长情况，结果显示，6个重组质粒均无自主活化现象，可用于下一步的文库筛选实验。将3种诱饵质粒和3种猎物质粒通过不同组合、配对共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，利用下游的链霉素抗性和HIS报告基因检测各种配对的互作情况。结果表明，PⅡ/CP，PⅡ/PⅡ，CP/CP三组配对均具有强烈的互作，而其他组合则仅有微弱互作甚至无互作。 2.酵母双杂交系统诱饵质粒和猎物质粒的构建、自激活作用检测及双杂交实验。 由于细菌双杂的一些局限性，为了进一步确证实验结果，本实验同时采用酵母双杂系统检验上述3种蛋白的互作情况。设计特异引物，通过PCR扩增得到含有GatewayTM技术重组接头的3个目的片段，利用GatewayTM技术，通过BP和LR两步重组反应，将3个目的片段分别重组到pDESTTM32与pDESTTM22质粒上，构建了3个目的片段的诱饵质粒和猎物质粒。将重组质粒转化酵母MaV203感受态细胞，并设置不同对照，验证6种重组质粒的自激活现象。结果表明，6种重组质粒均具有微弱的自激活现象，但这种自激活可以被50mM浓度以下的3-AT所抑制，故可以用于下一步的双杂交试验。将3种诱饵质粒和3种猎物质粒按照不同组合、配对共转化酵母MaV203感受态细胞，通过下游的报告基因检测各种配对之间的互作现象。结果表明：PⅡ/CP，PⅡ/PⅡ，CP/CP三组配对均具有强烈的互作，而其他组合则仅有微弱互作甚至无互作，以上结果完全符合细菌双杂的结果。 收起