中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 牛四文中国海洋大学 2015年博士导师: 邵宗泽；林文翰共742页

摘要 : 极端深海环境迫使生存于其中的真菌拥有独特的代谢调控途径，因而从中发现结构新颖和生物活性显著的次级代谢产物几率较高。新颖活性次级代谢产物为新型药物的研发提供重要参考价值。细菌耐药性发展迅速和病毒易突变对人类的生命健康造成巨大威胁，为... 展开极端深海环境迫使生存于其中的真菌拥有独特的代谢调控途径，因而从中发现结构新颖和生物活性显著的次级代谢产物几率较高。新颖活性次级代谢产物为新型药物的研发提供重要参考价值。细菌耐药性发展迅速和病毒易突变对人类的生命健康造成巨大威胁，为了寻找海洋来源的新型抗菌抗病毒活性先导化合物，本文选取两株深海真菌进行了次级代谢产物化学成分及生物活性的研究。研究内容分为:深海真菌的分离与活性筛选、代谢产物的分离及结构鉴定、部分化合物生源合成途径的推测、单体化合物抗菌抗病毒活性评价、抗流感病毒机制的研究。从采自深海的16个海泥样品中分离到103株真菌，排除重复得到43株。利用抗菌抗病毒活性筛选，结合1H NMR、HPLC和TLC化学筛选，从中选取Spiromastix sp.F19和Eutypella sp.F1两株真菌进行化学成分及生物活性的研究。从Spiromastix sp.F19发酵产物的乙酸乙酯部位分离到61个单体化合物（1-61），利用波谱学方法、化学衍生化及X-ray单晶衍射等方法鉴定了它们的结构，其中新化合物57个。化合物的结构类型分别为:羧酚酸环醚类化合物19个（1-19;均为新化合物）、苯并呋喃酮类化合物13个（20-32;全为新化合物）、多酚类化合物11个（35-45;均为新化合物）、愈创木烷类倍半萜4个(46-49;均为新化合物)、异香豆素类化合物2个（50，51;均为新化合物）、异苯并噻唑类化合物2个（52，53;均为新化合物）、长链聚酮类化合物6个（54-59;均为新化合物）、苯衍生物4个(33，34，60，61)。生物活性评价:1）羧酚酸环醚类化合物具有较强的抗革兰氏阳性菌活性，随后对其进行抗耐药菌活性评价，探讨其构效关系发现化合物14对MRSA、VRE耐药菌的抑制效果显著强于阳性药物左氧氟沙星。2）苯并呋喃酮类化合物抗流感病毒H1N1活性评价，探讨构效关系，发现7个化合物抗H1N1活性显著(6-40μM，阳性药物达菲IC50为10.0μM，其中化合物23 IC50为6μM);对其机制进一步研究发现23通过靶向HA蛋白和RNP，分别抑制了流感病毒吸附和复制转录过程（具有双重作用靶点），并且经多代传递，病毒未对23产生耐药性。3）多酚类化合物抗菌活性评价发现化合物35*-37*对7株指示菌（4株革兰氏阴性农业致病菌和3株革兰氏阳性菌）都有较强的抑制活性(0.25-4μg/mL)，其中35、37对所有指示菌的抑制效果(0.25-0.5μg/mL)显著强于阳性对照氯霉素(1-2μg/mL)。从另一株深海真菌Eutypella sp.F1发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离到93个单体化合物（62-154），其中新化合物67个（包括3个新骨架倍半萜）。它们的化学结构通过X-ray单晶衍射、波谱学、化学衍生化等方法鉴定。化合物结构包括:艾里莫芬烷倍半萜29个（62-90，其中新化合物27个）;桉叶烷倍半萜2个（91、92，2个已知化合物）;香柠檬烷倍半萜8个（93-100，均为新化合物）;新骨架倍半萜3个（101-103，均为新化合物）;末药烷倍半萜6个（104-109，均为新化合物）;含硫二酮哌嗪化合物38个（113-150，其中新化合物20个）;其他类型化合物7个（110-112，151-154）。对该菌乙酸乙酯粗提物和最初分离到的10个馏分进行抗HIV活性初筛，粗浸膏和馏分fr7在10μg/mL时对HIV的抑制率为分别为46.26％和99.61％，而Fr7中主要成分为含硫二酮哌嗪类化合物，据此推测含硫二酮哌嗪为抗HIV有效活性成分，目前单体化合物的活性评价正在进行中。本文从两株深海真菌中共分离到154个单体化合物，其中新结构化合物124个。首次对Spiromastix sp.进行化学成分的研究，填补了该属化学方面的空白;首次从Eutypella sp.属中分离到含硫二酮哌嗪类化合物;首次利用碱水解方法确定羧酚酸环醚类化合物的结构。通过抗耐菌活性评价发现1个抗菌先导化合物14，该化合物可能与左氧氟沙星抗菌机制不同，为治疗革兰氏阳性菌引起相关疾病提供候选化合物;除此之外还发现多酚类化合物35和37具有广谱强的抑菌活性，为广谱抗生素的研发提供先导化合物。通过抗流感病毒H1N1活性评价，发现1个先导化合物23抗病毒活性强于阳性药物达菲，并对该化合物的抗H1N1机制研究发现具有双重作用靶点，且不易产生耐药性，为抗流感病毒药物的研发提供重要先导化合物。含硫二酮哌嗪类化合物推测具有较强的抗HIV活性，有望为治疗HIV药物研发提供候选化合物;3个新骨架倍半萜丰富了倍半萜骨架类型。以上研究结果表明深海真菌具有产生结构新颖生物活性物质的潜力，为新型药物的研发提供海洋来源先导化合物。收起

关键词 : 深海真菌次级代谢产物化学成分生物活性

2. 中国红菇属的分类研究

[学位论文] 李国杰中国科学院大学 2014年博士导师: 刘杏忠;文华安共626页

摘要 : 红菇属(Russula Pers.1796)是一类世界广布而种类众多的大型伞状真菌，是红菇科的模式属和最大的一个属，该属包括了许多重要的食用菌、药用菌和有其他经济价值的种类，是大型伞状担子菌中的重要类群之一。本属的绝大多数种可以与多种植物形成外生菌根... 展开红菇属(Russula Pers.1796)是一类世界广布而种类众多的大型伞状真菌，是红菇科的模式属和最大的一个属，该属包括了许多重要的食用菌、药用菌和有其他经济价值的种类，是大型伞状担子菌中的重要类群之一。本属的绝大多数种可以与多种植物形成外生菌根，在大型伞菌的系统学和菌根学的研究中占有重要的地位。作者在2006-2013年间赴云南、海南、北京、河北、浙江、安徽、吉林、贵州、西藏、内蒙古、青海和四川采集红菇属标本982份，采用现代伞菌分类观点对保存于中国科学院微生物研究所菌物标本馆(HMAS)、中国科学院昆明植物研究所隐花植物标本室(HKAS)、广东微生物所标本馆(HMIGD)、吉林农业大学菌物标本馆(HMJAU)和奥地利维也纳大学植物研究所标本室(WU)的标本共969份进行了宏观形态和显微观察研究，拍摄并绘制了可准确体现红菇属真菌各部分形态特征的照片和图片，其中标本子实体彩色照片1519张，子实层、菌盖表皮和菌柄表皮光学显微照片9495张，担孢子扫描电镜显微照片752张，绘制担子、侧生囊状体和菌盖表皮线条图316张。本研究以宏观形态和显微特征为依据，参考国际上红菇属分类的主流观点，系统全面研究了我国红菇属的种类及分布。首先对文献报道中的我国红菇属种名进行了整理，我国已报道了193个红菇属分类单元名称，通过标本观察和鉴定，结合目前国际分类现状，最终排除无效和不合格发表的分类单元名称4个，无标本的分类单元名称12个，因同物异名而不再使用的分类单元名称18个，另有13个分类单元由于未能借阅到标本，是否在我国存在还不能确定。确认我国分布的红菇属现有158个分类单元，其中包括152种，1亚种，5变种，发现新种7个:暗绿红菇Russula atroaeruginea、长白红菇R.changbaiensis、裘氏红菇R.chiui、吉林红菇R.jilinensis、四川红菇R.sichuanensis、邓氏红菇R.tengii和浙江红菇R.zhejiangensis，报道中国新记录种11个:冷杉红菇R.abietina、紫罗兰红菇R.amethystina、铜色红菇R.cuprea、非凡红菇R.insignis、全缘形红菇R.integriformis、落叶松红菇R.laricina、香红菇R.odorata、牧场红菇R.pascua、皮氏红菇R.peckii、外向红菇R.postiana和泥炭藓红菇R.sphagnophila。在红菇属属下单元分类中，以小菌褶的有无，菌盖表皮原菌丝的有无，菌肉味道辛辣与否，菌肉受伤后变色情况，孢子印颜色为各亚属分类的主要形态特征依据，将我国红菇属的158个分类单元归入9个亚属，29个组，并为属下单元提供了分亚属、分组和分种检索表。对每个分类单元进行了宏观形态和显微特征的详细描述，并提供了每个分类单元的子实体彩色照片、孢子扫描电镜照片以及担子、侧生囊状体和菌盖表皮的线条图。从分子系统学的角度并结合形态学特征对红菇属下部分亚属和组间亲缘关系进行了初步研究。以红菇属54个分类单元的123条rDNA的ITS1-5.8S-ITS2序列片段作为分子标记，采用最大简约法和贝叶斯法分析红菇属下各亚属和组间的亲缘关系。分子系统学分析的结果支持近腹菌状和腹菌状的地红菇属MacowanitesKalchbr.1882是红菇属的同物异名的观点，并且可以支持多个按照形态特征划分的属下各亚属和组，但不能支持所有分子系统树中的分枝，表明这些不能被分子支持的亚属或组均难以称为自然的分类系统。受到采样范围，可扩增和分析序列数量的限制，本研究的分子系统学部分仅涉及了我国众多的红菇属种类中十分有限的分类单元，在我国可以确定的158个分类单元中，仅有43个得到了分子系统学的支持，故在此基础上更加广泛和全面的采集我国红菇属标本，进行更加细致的形态观察，以及使用多基因序列分析，将为建立趋于自然的红菇属分类系统提供更加充足的科学依据。收起

关键词 : 担子菌红菇科分子系统学伞状真菌显微特征亲缘关系

3. 食药用菌抗代谢综合征候选药物发现及其调节菌群机制研究

[学位论文] 汪锴中国科学院大学 2019年博士导师: 刘宏伟共399页

摘要 : 代谢综合征是2型糖尿病和心脑血管病等慢性疾病的高危因素，严重危害生命健康，其预防与治疗刻不容缓。肠道菌群在代谢综合征的发生发展中发挥着关键作用。通过外源性干预调节肠道菌群来治疗或预防代谢性疾病具有重要的临床应用价值。食药用真菌是中国... 展开代谢综合征是2型糖尿病和心脑血管病等慢性疾病的高危因素，严重危害生命健康，其预防与治疗刻不容缓。肠道菌群在代谢综合征的发生发展中发挥着关键作用。通过外源性干预调节肠道菌群来治疗或预防代谢性疾病具有重要的临床应用价值。食药用真菌是中国传统中医药的重要组成部分，长期的实践表明其具有良好的药用价值，是药物先导化合物或候选化合物的重要来源。本论文研究工作由四部分内容组成:第一部分，对两株药用真菌的次级代谢产物进行了化学研究，从白肉灵芝（Ganoderma leucocontextum）的子实体提取物、猴头菌（Hericium erinaceus）大米培养物中分离鉴定了53个化合物，其中38个为新化合物;第二部分，对分离得到的单体化合物进行α-葡萄糖苷酶及HMG-CoA还原酶双靶点抗代谢综合征活性筛选，发现了体外活性强、安全性好的先导化合物GanomycinⅠ(30)，在KK-Ay及ob/ob两种代谢综合征小鼠模型上评价了化合物30的药效，发现化合物30对糖脂代谢紊乱的改善作用;第三部分，通过对先导化合物30的化学衍生化、体内外活性筛选、初步安全性评价，获得了安全低毒的活性化合物GMD，利用DIO小鼠、ob/ob小鼠和fa/fa大鼠三种代谢综合征动物模型评价了化合物GMD的药理作用;第四部分，对化合物GMD的作用机制进行了深入研究，根据药物动力学参数、伪无菌小鼠、菌群移植等实验证实了肠道菌群在GMD药效中发挥重要作用。进一步阐明了GMD调节肠道菌群的作用机制:(1)GMD通过富集丁酸产生菌，增加肠道丁酸水平，缓解肠道炎症、修复肠道屏障;同时激活肠道PPARγ通路，降低肠壁氧分压，抑制LPS产生菌繁殖，两方面共同改善动物模型的内毒素血症，缓解全身系统性炎症，发挥胰岛素增敏及改善糖脂代谢作用。(2)结合微生物培养发现GMD可以显著富集ob/ob小鼠肠道共生菌狄氏副拟杆菌丰度，利用DIO及ob/ob小鼠两种代谢综合征动物模型进一步证实狄氏副拟杆菌对糖脂代谢的改善作用，机制研究发现狄氏副拟杆菌可以通过对胆酸组成的调节及产生琥珀酸激活FXR及肠道糖异生信号通路，调节糖脂代谢紊乱，改善代谢综合征。(3)在fa/fa大鼠中，GMD富集丁酸产生菌的同时还可以显著增加Bacteroides xylanisolvens等叶酸产生菌丰度，进而激活肝脏叶酸相关代谢通路，缓解氧化应激压力，改善脂代谢紊乱。综上所述，本课题通过对两株食药用真菌的化学研究、活性筛选、结构修饰、药效评价及机制探索，发现了一个具有抗代谢综合征活性的药物候选分子GMD，同时验证了肠道菌群是其发挥药效的重要靶点，并从丁酸、胆酸、琥珀酸以及叶酸代谢角度解释了GMD的调节肠道作用机制，为GMD的深入研究提供了理论基础，为靶向肠道菌群的药物研发提供了新的思路。收起

关键词 : 代谢综合征食药用菌肠道菌群实验药理

4. 亚隔孢壳科真菌的系统演化、分类及其多样性研究

[学位论文] 侯玲伟中国科学院大学 2021年博士导师: 蔡磊共353页

摘要 : 亚隔孢壳科真菌（Didymellaceae）隶属于真菌界子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales），其模式属为亚隔孢壳属（Didymella）。该科主要包括壳二孢属（Ascochyta）、亚隔孢壳属、附球孢属（Epicoccum）、茎... 展开亚隔孢壳科真菌（Didymellaceae）隶属于真菌界子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales），其模式属为亚隔孢壳属（Didymella）。该科主要包括壳二孢属（Ascochyta）、亚隔孢壳属、附球孢属（Epicoccum）、茎点霉属（Phoma）等28个属，是世界上物种数目最丰富、地理分布最广泛的真菌类群之一。该科大多数物种为动植物病原菌，其中一些物种被多个国家列入进境检疫名录。长期以来由于种属概念不清晰、寄主相关性的命名方法及其地理分布及宿主范围广泛等原因，造成科内物种数目庞大，目前已报道5400多个物种名称。虽然在前人的研究中，依据分子系统发育分析结合形态学观察，梳理了亚隔孢壳科内属及物种的关系，但是由于该类群真菌形态易受环境影响、大部分物种缺乏佐证鉴定的模式标本、菌株或有效可靠的分子数据等原因，一些属、种的界限及其分类地位仍不明确，使物种鉴定和分类工作十分困难，也给进境植物检疫性有害物种的检测鉴定和相关科研工作带来阻碍。此外该类群缺乏准确、快速和有效的物种鉴定DNA条形码和鉴定体系。为解决上述问题，本研究开展了亚隔孢壳科真菌的分类、系统演化及多样性研究。基于大量的资源调查，通过菌株分离并与国际同行合作，收集到来自世界74个国家，442种宿主植物及土壤、海洋、水、空气、珊瑚和人体等35种其他基质的亚隔孢壳科菌株1100株。通过ITS、LSU、rpb2和tub2单基因及联合多基因系统发育分析，结合形态特征、生理特性、地理分布和寄主范围等信息，采用多相分类学方法，补充和完善了亚隔孢壳科真菌的系统发育骨架树和多基因数据集，探讨了亚隔孢壳科内属和物种的概念并厘清其系统发育关系，澄清了小球壳孢属（Microsphaeropsis）在亚隔孢壳科中的分类地位，修订了Remotididymella、Nothophoma、Chaetasbolisia的属征。本研究获得的亚隔孢壳科菌株分属于36个属，301个物种。研究过程中，描述并建立新属8个（Dimorphoma、Ectodidymella、Longididymella、Macroascochyta、Paramicrosphaeropsis、Pseudope yronellaea、Sclerotiophoma、Vandijckomycella）、新组合21个(Ascochyta astragalina、A.koolunga等）、新名称2个（Heterophoma verbasci-densiflori和Nothophoma nullicana），描述新物种52个（Allophoma alba、Al.anatiae等），恢复4个重要物种名称的使用(Epicoccum mezzettii、E.oryzae、E.purpurascens和Toruloidea tobaica)。此外，为了稳定和规范物种名称在国际分类学、植物病理学等领域中的应用，本研究以相同寄主、相同采集地和相似的形态特征为标准，为12个重要物种指定注释模式和新模式。结合文献和数据库调研，本研究补充和完善了前人研究中缺失的物种信息、分子序列等，提供了一个包含335个物种1256个菌株的多基因数据集，为认识亚隔孢壳科的系统演化规律和开展后续研究奠定了重要基础。进一步的分析结果表明，rpb2基因在亚隔孢壳科内具有较高的种属分辨率，建议将其作为该类群的候选物种鉴定DNA条形码。此外，本研究通过改进PCR扩增体系及反应程序，显著提高了亚隔孢壳科真菌系统发育分析中关键基因rpb2的扩增成功率。基于广泛收集的菌株信息，本研究初步分析了亚隔孢壳科真菌的物种多样性及其与寄主/基质的相关性。结果表明，与豆科(Fabaceae)植物相关的亚隔孢壳科真菌物种多样性最高，其次为禾本科（Poaceae）、菊科(Asteraceae)和蔷薇科(Rosaceae)。在本研究中，亚隔孢壳属和附球孢属物种和菌株数目最多，并且两者的寄主/基质范围最广，表明其在植物和各种环境中具有极强的适应性。尽管大部分亚隔孢壳科真菌的寄主范围均较广泛，壳二孢属表现出对豆科植物一定程度的寄主偏好性。综上，本研究梳理了亚隔孢壳科的分类系统，进一步完善了其系统发育骨架树，澄清了科、属、种界限和系统演化关系，建立起更完整、稳定、可靠且趋于自然演化关系的分类系统，为后续的资源收集、应用研究和降低亚隔孢壳科真菌对我国植物、粮食、食品安全造成的威胁提供理论基础，具有重要实践意义。收起

关键词 : 亚隔孢壳科真菌系统发育分类学物种多样性

5. 灵芝科系统发育研究

[学位论文] 王新存中国科学院大学 2012年博士导师: 姚一建共304页

摘要 : 灵芝科(Ganodermataceae Donk)真菌是世界广布的一类多孔菌，具有重要的医药、生态和文化价值。虽然其形态学和分子系统学研究已广泛开展，但其系统发育关系一直没有得到澄清，分类系统也一直处于动荡之中。为了解决这些问题，本研究开展了如下工作。... 展开灵芝科(Ganodermataceae Donk)真菌是世界广布的一类多孔菌，具有重要的医药、生态和文化价值。虽然其形态学和分子系统学研究已广泛开展，但其系统发育关系一直没有得到澄清，分类系统也一直处于动荡之中。为了解决这些问题，本研究开展了如下工作。采用核基因组ITS、IGS、nrLSU、nrSSU、rpb2、tef1、β-tubulin、线粒体基因组mtSSU、mtLSU、atp6分子片段近1800条序列对灵芝科、属进行系统发育分析，结果表明灵芝科是一个单系类群，至少包括7个属:灵芝属、网孢芝属、木芝属、糙芝属、异芝属、假芝属和鸡冠孢芝属，并从其中前6个属中得到了分子证据;证明灵芝属是一个单系类群，其下可以划分为4个亚属:灵芝亚属、赤芝亚属、树舌亚属和紫芝亚属，其中赤芝亚属又可以分为赤芝组和厚垣孢组，紫芝亚属又可以分为紫芝组和假树舌组。本研究系统发育分析涉及灵芝科内的71个系统发育分类单元，显微形态观察涉及灵芝科内51个形态学种（或亚种），两者合计共涉及83个不同的分类单元。在这83个分类单元中，包括新种3个和新组合7个，同时有10个报道自中国的名称被首次处理为异名。医药和商业上广泛应用的3个种（“Ganoderma lucidum”、Gsinense和“Gtsugae”）的名称也得到了更正。多基因系统发育分析过程中，发现了灵芝属内存在的核基因组遗传信息与线粒体基因组冲突的现象，认为可能的原因是成种之前的不完全分型或成种之后的渐渗杂交。通过对用于系统发育分析的10个分子片段进行评价，推荐ITS和rpb2作为灵芝科DNA barcodes各选片段。对在中国大陆有分布的灵芝属19个种实现了ITS-RFLP分子鉴定。通过具有化石校正的分子钟分析，推定灵芝科起源时间为古新世中期、分化时间为始新世初期、灵芝属分化时间为渐新世初期。由于始新世和渐新世初期都是气候急剧变化的时期，认为灵芝科、属的分化与地质气候变迁具有直接关系。通过祖先状态重建分析，明确了灵芝科用于分类的12个特征的进化过程，确定了其在各进化节点上的祖先状态。灵芝科的祖先被确定为一年生，近有柄，具似漆样光泽，菌肉色淡，皮壳拟子实层型，骨架菌丝无色，担孢子大，近球形，小刺细微，不具厚垣孢子，喜热带高温气候，分布于亚洲常绿阔叶林内的物种。收起

关键词 : 灵芝科系统发育形态学分类体系遗传基因

6. 小麦农田微生物组与功能对施氮肥和浇水灌溉减少的响应研究

[学位论文] Busayo Joshua Babalola 中国科学院大学 2022年博士导师: 郭良栋共298页

摘要 : 植物微生物组是干旱农业生态系统中的重要组成部分，在促进植物吸收营养、提高免疫和生产力等方面发挥着重要的作用。传统、大规模的耕作方式（灌溉和施化肥）对农业生态系统中微生物的群落结构和功能产生严重的影响。然而，微生物组对农业耕作方式响... 展开植物微生物组是干旱农业生态系统中的重要组成部分，在促进植物吸收营养、提高免疫和生产力等方面发挥着重要的作用。传统、大规模的耕作方式（灌溉和施化肥）对农业生态系统中微生物的群落结构和功能产生严重的影响。然而，微生物组对农业耕作方式响应的时间动态变化规律的相关研究仍处于起步阶段。因此，本研究在山东省禹城综合实验站的不同施肥(0，70，140，210，280 kg N ha-1 yr-1)和灌溉（保持土壤水势60％和80％）处理的麦田，利用形态学、生物化学和PCR扩增子高通量测序技术，开展不同小麦生长时期的根系和土壤丛枝菌根(AM)真菌、总真菌和细菌群落以及土壤微生物酶活性研究。取得如下创新性结果: 三因素方差分析(three-way ANOVA)结果表明，施氮肥、浇水减少、生长阶段及其交互作用显著影响AM真菌的孢子密度、根外菌丝密度、根内侵染率和根外菌丝密度与根内侵染率的比例。在两种浇水条件下，氮肥都降低了AM真菌的孢子密度、根外菌丝密度、根内侵染率和根外菌丝密度与根内侵染率的比例。从根系和土壤样品中共获得132个AM真菌操作分类单位(operational taxonomic units，OTUs)，以球囊霉科(Glomeraceae)为优势类群。三因素方差分析结果表明，施肥、生长阶段以及生长阶段与施肥和浇水减少的交互作用显著影响土壤和根系中AM真菌的丰度。AM真菌群落组成受到分隔、生长阶段、施肥、浇水减少以及施肥和浇水减少的交互作用的显著影响;在2种浇水条件下，施肥显著影响土壤AM真菌群落组成，但是对根系的无显著影响。动态分析结果表明，在所有的施肥处理中6月份的AM真菌孢子密度低于其他月份，但是只有在低施肥水平处理中(≤70 kg N ha-1 yr-1)3月份的AM真菌的根外菌丝密度和根系侵染率高于其他月份;在所有的施肥和浇水水平下，AM真菌群落组成随着植物的生长而变化。研究结果表明高施肥水平而非浇水减少打断AM真菌菌丝生长的时间动态变化，但是没有显著干扰AM真菌的产孢和组成的时间动态变化。从土壤和根系样品中共获得3517个真菌OTUs (ITS2)和5876个细菌OTUs (V4区)。其中，真菌群落以子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为优势类群，细菌群落则以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势类群。真菌和细菌的群落组成受到分隔、生长阶段、施肥或浇水减少的显著影响。除根系细菌外，在2种灌溉条件下氮肥显著影响了根系和土壤中真菌和细菌的群落组成。时间动态变化分析表明，根系真菌群落组成的相异性在2种灌溉条件的对照处理中3月份的高于5月份;在浇水减少条件下的中低氮（70和140 kg N ha-1 yr-1）处理中4月份低于6月份，而在高氮(≥210 kg N ha-1 yr-1)处理中6月份低于3月份;在常规浇水条件下，所有施肥（≥70 kg N ha-1 yr-1）处理中3月份高于其他月份。在减少浇水条件下，土壤真菌群落的相异性在对照处理中3月份高于6月份，在低施肥（70 kg N ha-1 yr-1）处理中5月份高于其他月份，在高施肥(≥140 kg N ha-1 yr-1)处理中6月份高于4月份;常规灌溉条件下，土壤真菌群落的相异性在低中施氮(70和140 kg N ha-1 yr-1)处理中6月份高于其他月份，而在高施肥(≥140 kg N ha-1 yr-1)处理中3月份高于其他月份。在所有施氮和灌溉水平处理中，根系细菌群落组成的相异性在6月份高于5月份;在减少浇水条件下，土壤细菌群落组成的相异性在对照处理中5月份高于3月份，而在其他施肥处理中3月份高于5月份;在常规浇水处理中，土壤细菌群落组成的相异性在对照处理中5月份低于其他月份，但是在所有施氮处理中5月份高于其他月份。三因素方差分析表明，土壤β-1，4-葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、转化酶、尿亮氨酸氨基肽酶、脲酶、β-1，4-N-乙酰葡，糖胺糖苷酶、碱性磷酸酶活性受到施肥或生长阶段的显著影响，但是不受浇水减少的影响。在2种灌溉条件下，施肥显著增加β-1，4-葡萄糖苷酶、尿亮氨酸氨基肽酶、脲酶、碱性磷酸酶活性。三因素方差分析表明，土壤多功能性指数受到施肥、生长阶段、浇水减少以及施肥和浇水减少交互作用的显著影响。在减少浇水条件下，不同生长阶段的土壤多功能性指数在最高施肥(280 kg N ha-1 yr-1)处理中高于其他施肥处理。总之，本研究揭示了小麦田微生物组和功能响应施肥和浇水减少的时间动态变化规律。研究结果对我们深入理解微生物组在半干旱农业系统的常规农业实践过程中的功能具有重要的科学意义。收起

关键词 : 小麦土壤微生物组氮肥施用浇水量

7. 灰肉红菇多组学共生特性研究

[学位论文] 刘远超华南理工大学 2022年博士导师: 吴清平共292页

摘要 : 灰肉红菇（Russula griseocarnosa）是产自广东、福建和云南等地的名贵外生菌根食药用菌，营养丰富、保健功效显著，深受市场欢迎，但由于其菌丝体和子实体严格依赖宿主植物才能生长，目前尚未实现人工驯化栽培，且由于研究所需菌丝材料的获得极为困难... 展开灰肉红菇（Russula griseocarnosa）是产自广东、福建和云南等地的名贵外生菌根食药用菌，营养丰富、保健功效显著，深受市场欢迎，但由于其菌丝体和子实体严格依赖宿主植物才能生长，目前尚未实现人工驯化栽培，且由于研究所需菌丝材料的获得极为困难，相关生物学基础研究停滞不前，严重制约了灰肉红菇的科学研究和产业化应用。本研究以灰肉红菇子实体、菌根及其生境土壤微生物为对象，采用现代分子生物学和高通量组学测序的手段，围绕灰肉红菇的共生特性开展了以下研究： 1.采用Illumina和PacBio平台测序技术得到了更为精细的灰肉红菇基因组，该基因组50.67Mbp，包含230个scaffolds，14229个编码基因；基于内转录间隔区（ITS）序列比较分析发现灰肉红菇产地存在着大量与灰肉红菇ITS序列不一致的样品，表明灰肉红菇的相近物种较多且肉眼难以区分。遗传多样性的研究表明：来自广东和福建的灰肉红菇存在着明显的遗传分化，群体单倍型网络分析显示广东、福建和云南三地的灰肉红菇明显分为2个聚类群，揭示了各地理群之间存在着基因交流；变异显著性分析显示各地理群体的灰肉红菇遗传变异主要来自种群内部。 2.针对新鲜灰肉红菇子实体开展ITS扩增子测序研究，共鉴定得到18个属的真菌，除红菇属外，相对丰度较高的真菌有菌寄生菌属（Hypomyces）、曲霉菌属（Aspergillus）、枝孢菌属（Cladosporium）等。连续四年的分离鉴定发现，同时存在于子实体和菌根组织中的淡紫拟青霉属（Purpureocillium）、拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）、青霉属（Penicillium）及伞状霉属（Umbelopsis）真菌可能为灰肉红菇的生长和代谢起到促进作用。 3.基于比较基因组学研究，挖掘灰肉红菇的共生基因和碳水化合物酶特性，但未见具有共生效应的小型分泌蛋白以及具有共生调节和转运功能的小 RNA，推测灰肉红菇可能具有更为特殊的共生调节机制。相比于腐生真菌而言，灰肉红菇涉及到糖基键等水解酶活性、催化活性、丝氨酸类肽酶活性、跨膜转运蛋白活性，跨膜运输以及胞外组分等功能显著下调，同时灰肉红菇丢失了包括葡萄糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、半乳糖醛酸还原酶、半乳糖激酶、α-半乳糖苷酶等在内的关键糖代谢酶，揭示其难以在人工培养基上生长的原因。系统发育树揭示了各真菌的营养生态型与其亲缘及进化之间并未有明确的相关性。 4.土壤微生物群落分析表明灰肉红菇与非灰肉红菇生境微生物存在显著的结构差异，大豆慢生根瘤菌类（Bradyrhizobium japonicum、B. elkanii）、Chthoniobacter flavus、绿弯菌（Ktedonobacter racemifer）以及纤线杆菌（Ktedonobacter sp.）在灰肉红菇生境土壤中的相对丰度显著高于其他红菇以及对照土壤；土壤微生物功能分析表明灰肉红菇生境中具有几丁质结合功能的Carbohydrate-Binding Module 19显著升高，并且糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物脂酶、谷氨酰胺合成酶、NitT/TauT家族转运系统底物结合蛋白、DNA 导向的 RNA 聚合酶、麦芽糖α-D-葡萄糖基转移酶/α-淀粉酶显著增加，代谢通路分析显示涉及到能量代谢的丙酸代谢、细胞周期以及RNA聚合酶相关通路显著增加，或许为灰肉红菇的快速生长提供了能量支撑。 5.子实体的营养及微量元素检测结果表明，灰肉红菇富含蛋白质、脂肪、人体必需氨基酸及微量元素，其中砷元素含量高于常见的食用菌，需要进一步明确其砷元素存在的化合物形式以及其对灰肉红菇的生长和共生关系的建立所可能起到的作用。灰肉红菇菌根代谢组学的研究累计检测和注释到1422个代谢物，功能分析揭示这些代谢物主要富集到涉及能量、激素信号传导及免疫防御的代谢通路，为揭示共生机制指明了方向。本研究获得了较为精细的灰肉红菇的全基因组序列，为后续灰肉红菇的共生基因挖掘以及驯化研究奠定数据基础。明确了灰肉红菇的内生真菌种类，为灰肉红菇的分离和鉴定提供依据。大规模的比较基因组学研究揭示了灰肉红菇缺乏糖代谢相关的关键基因，为菌丝体的分离提供了参考。灰肉红菇菌根及生境微生物的研究揭示了宿主植物和潜在的促生菌可能为灰肉红菇的生长提供糖代谢相关酶，从而起到共生和促生的作用，为下一步灰肉红菇的人工扩繁和仿野生栽培提供理论基础。收起

关键词 : 灰肉红菇外生菌根真菌微生物群落共生特性

8. 中国主要林区蘑菇属系统学研究

[学位论文] 刘安琪中国科学院大学 2020年硕士导师: 赵瑞琳共289页

摘要 : 蘑菇属（Agaricus L.）隶属于蘑菇目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)，是具有重要食药用的大型真菌类群，目前世界已经报道该属物种数量超过500种，该属最新分类系统为6个亚属，24个组。本研究采用该分类体系，对采自全国11个省份的1003份蘑菇属标本... 展开蘑菇属（Agaricus L.）隶属于蘑菇目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)，是具有重要食药用的大型真菌类群，目前世界已经报道该属物种数量超过500种，该属最新分类系统为6个亚属，24个组。本研究采用该分类体系，对采自全国11个省份的1003份蘑菇属标本，进行DNA提取及ITS为主、部分LSU、tef1-α片段的扩增，共得到647条ITS，27条LSU，22条tef1-α序列，使用ITS序列或多基因序列用最大似然法(ML)及贝叶斯法(Bayes)构建系统发育树。结合形态学研究结果共鉴定为66种，其中已知种40个，新种2个，拟定新种4个，待定种12种，新记录种8个，分别属于蘑菇属的5个亚属和13个组。此外对国内已报道该属物种进行归纳及简要讨论。具体结果如下: 本研究中Agaricus亚属有28份标本，全部属于sect.Agaricus，共有5个物种，包括2个新种，3个新记录种，并讨论了9个国内已知种;Minores亚属共研究104份国内标本，分别属于sect.Pantropicales和sect.Minores，鉴定为16个已知种，2个新记录种，4个待定种，讨论了16个国内已知种;Flavoagaricus亚属共有117份标本，全部属于sect.Arvenses，鉴定为6个已知种，4个拟定新种，1个新记录种，3个待定种，讨论了12个国内已知种;Spissicaules亚属中共有75份标本，分别属于sect.Amoeni sect.Spissicaules和sect.Subrutilescentes，共有5个已知种，3个待定种，讨论了7个国内已知种;Pseudochitonia亚属共有323份标本，涵盖6个组，包括14个已知种，2个新记录种，3个待定种，讨论了20个国内已知种。据此，通过本研究，查清目前我国共有蘑菇属物种为130个，其中被形态学和分子系统发育支持的物种有116个。对受分子系统发育和形态学研究支持的116个中国蘑菇属物种均给出形态学描述，并根据每个物种的地理来源、林分构成等信息，开展物种的地理成分分析，结果表明中国特有成分共有67种，北温带成分有16种，温带-亚热及热带成分有13种，潜在特有成分有12种，欧亚分布种有5种，世界广布成分有3种。结合标本的主要三个来源地:大小兴安岭地区、祁连山地区及横断山地区，发现横断山地区的蘑菇属物种多样性最为丰富，除了特有种外，其它各种地理成分物种均有发现;祁连山地区及大小兴安岭地区物种数明显少于横断山地区，但除了特有种外，温带及亚欧成分的物种明显占据优势地位。本研究提供了较为全面和准确的蘑菇属物种在中国的分布信息，为相关资源的保护和利用奠定了基础。收起

关键词 : 蘑菇属植物分类学系统发育地理成分

9. 粘细菌进化与环境适应策略的组学分析

[学位论文] 韩魁山东大学 2014年博士导师: 李越中共284页

摘要 : 粘细菌是一类具有社会性行为的细菌类群，拥有庞大的基因组，大小从5Mbp到14.78Mbp不等。大基因组赋予粘细菌广泛的环境适应性。粘细菌是继放线菌，蓝细菌和丝状真菌后的又一大天然活性产物产生类群，天然活性产物合成基因（簇）占粘细菌基因组百分之... 展开粘细菌是一类具有社会性行为的细菌类群，拥有庞大的基因组，大小从5Mbp到14.78Mbp不等。大基因组赋予粘细菌广泛的环境适应性。粘细菌是继放线菌，蓝细菌和丝状真菌后的又一大天然活性产物产生类群，天然活性产物合成基因（簇）占粘细菌基因组百分之五以上。目前在粘细菌中发现的拥有新型结构的天然活性产物已有500余种，相关衍生物的种类已经超过1500种。尽管如此，仍有大量化合物有待发掘。粘细菌天然活性产物在本源菌中产量都很低，早期通过发酵提高产量，随着合成生物学的发展，异源表达，组合生物学等策略都用于天然产物发掘和产量提高。粘细菌中遗传操作手段相对较少，目前在模式菌株黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）DK1622中可以通过基于卡那霉素和galK二次筛选的策略进行基因敲除，而在纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）中只能通过自杀质粒实现基因的插入失活，这些方法的周期都较长。目前对于粘细菌基因组的研究相对较少，自1999年孟山都公司开启粘细菌模式菌株黄色粘球菌DK1622的全基因组测序工程以来，已有17个粘细菌测序项目在NCBI数据库中注册，其中已经公开报道的基因组有15个。在本论文中，我们综合使用基于第二代测序技术的基因组测序，转录组测序及PCR产物测序方法，探究了粘细菌基因组的结构和组成特点，并通过基因组序列分析阐述了纤维堆囊菌的生物地理分布特征，同时对粘细菌的转录特征进行分析。在组学分析的基础上，通过构建随机突变文库和高通量测序方法，确定了在营养条件下黄色粘球菌DK1622菌株的核心基因集的组成。根据基因组和转录组分析结果，对纤维堆囊菌So017-2菌株遗传操作体系进行了改进;并在黄色粘球菌DK1622菌株中建立了基于CRISPR/Cas9系统的基因一步敲除和调控方法，为构建黄色粘球菌DK1622底盘生物提供了技术基础。在复杂环境条件下生活的细菌，会通过复杂而未知的机制来改变自身基因组的大小。纤维堆囊菌So057-2是一株能够生活在宽pH条件下的埃博霉素(epothilones)产生菌，通过第二代高通量测序技术和第一代测序技术相结合的方法，确定So0157-2菌株的基因组大小达到14，782，125碱基，比之前报道的同样来自与纤维堆囊菌的Soce56菌株的基因组大了1.75Mbp，是目前原核生物中已知的最大基因组。纤维堆囊菌So0157-2基因组包括11599个开放读码框(openreading frames，ORFs)，其中包括大量ORFs来源于基因重复和水平基因转移;基因组中存在丰富的蛋白激酶基因，sigma因子及其相关调控因子编码基因，这些基因为So0157-2菌株适应环境提供了丰富的资源。转录组分析发现So0157-2菌株中90.7％的基因都是表达的，通过比较不同pH条件下的表达谱的差异，证明So0157-2在不同环境中的存在不同的复杂表达模式，同时暗示碱性条件可能更有利于细胞获取外来遗传物质。这些结果为了解环境条件如何影响基因组扩张提供了一个范例。在对So0157-2菌株的转录组分析中发现在碱性条件下，菌株的限制性修饰系统和CRISPR/Cas系统的表达量显著降低。据此我们对比了pH7.0和pH9.0条件下So0157-2遗传操作的效率。结果显示在pH9.0条件下，So0157-2菌株接合转移的效率相比pH7.0条件提高了10倍以上，这一结果证实在碱性条件下，So0157-2菌株更易于获取外来遗传物质，碱性条件是So0157-2基因组扩张的一个促进因素。同时，我们通过SEFA PCR的方法对菌株的插入位点进行了验证，获得了一系列埃博霉素修饰基因的插入失活突变株，为后续埃博霉素相关化合物的研究提供了菌株资源。在完成纤维堆囊菌So0157-2菌株测序后，为了验证纤维堆囊菌中基因组扩张与环境与地理分布距离之间的关系，挑取粘细菌资源菌库中8株不同分离生境，不同分离距离的纤维堆囊菌菌株通过第二代测序技术进行了全基因组测序。我们发现测序的8个菌株的基因组差异很大，So0007-03菌株的基因组大小达到了14.28Mbp，而最小的So0157-25菌株的基因组则只有9.80Mbp，相差接近三分之一。通过比较基因组分析新测序的八个基因组与之前完成测序的So0157-2菌株和So ce56菌株的基因组发现纤维堆囊菌的核心基因组大小仅为3.37Mbp，仅占So0157-2基因组的22.8％，So0157-25菌株基因组的34.4％。比较主要细菌和古菌类群在属层面和种层面的核心基因组占总基因组大小的比例，纤维堆囊菌核心基因组的比例更接近于大多数细菌和古菌类群在属层面上的核心基因组比例。相比于较小的核心基因组，纤维堆囊菌拥有庞大的附属基因组，绝大多数多糖降解酶相关基因与次级代谢基因位于附属基因组中。通过基因累积曲线分析，十个纤维堆囊菌基因组中非冗余的基因数目达到23266个，每增加一个基因组会增加2156个基因，根据数据模拟分析这一增长趋势到25个基因组时趋于平缓。通过对纤维堆囊菌核心基因组和小核糖体RNA（16S rRNA）进行基于序列比对的系统发育，并与对全基因组序列基于不依赖于比对构建的系统发育树进行比较，发现十株纤维堆囊菌可以分为三个亚群，但这些亚群的分布特征既不符合基于环境的分离特征也不符合基于地理分布距离的分离特征，而是体现出一种混合分布特点。通过ClonalFrame软件对十株纤维堆囊菌的系谱分类进行分析，证实了系统发育分析的结果，同时也发现在这些纤维堆囊菌基因组中突变的作用要明显强于同源重组的作用，也正是这些突变塑造了这些菌株的分类和系谱特征。而通过GenoPlast软件对附属基因组的分析则表明在这些菌株的进化历史中存在大量的基因组变迁(genomic flux)。在同一地区分离到的菌株基因组的巨大差异及不同地域分离菌株在系谱分类上的近缘性暗示除了环境和地理分布距离因素外，还有其它因素驱动纤维堆囊菌基因组的进化和种内种群分化的产生。除纤维堆囊菌外，粘细菌的另一重要类群是粘球菌。本实验室之前分离到的一株海洋粘细菌橙色粘球菌HW-1具有很好的海洋适应性。在之前的研究中，HW-1的全基因组序列解析完成。系统发育分析显示HW-1菌株与已完成测序的模式菌株黄色粘球菌DK1622具有最近的亲缘关系，其分歧年限距今六百万年左右。比较基因组分析显示HW-1与DK1622的直系同源基因经历了强烈的净化选择，虽然HW-1已经完全适应海洋环境，仍显示出与陆生粘细菌极近的亲缘关系。对0％，20％和50％海水条件下培养的HW-1菌株的转录组数据进行分析，显示在不同海水浓度条件下，HW-1菌株的表达模式差异很大。之前的表型实验表明20％海水条件是HW-1菌株的最适生长条件，在转录组数据中，这一条件下沉默的基因最多，同时能量代谢与蛋白合成相关基因的表达量最低，这一现象证实了之前表型实验的结果。在0％和50％海水条件下，则有更多与渗透压适应相关的基因表达，表明这两个条件对于HW-1菌株是胁迫条件。通过对转录组数据的拼接，系统阐述了HW-1菌株中操纵子的结构，并证明细胞运动与防御系统相关的基因更倾向于形成操纵子结构。通过链特异性转录组测序，表明橙色粘球菌转录本中超过40％为非编码RNA，在此之前，粘细菌中只在黄色粘球菌中发现了一个非编码RNA。非编码RNA中的小RNA(small RNA，sRNA)和反义RNA（antisensc RNA，asRNA）调控通道蛋白，核糖体蛋白及细胞发育相关基因的表达。通过这些数据，推测橙色粘球菌HW-1对海洋环境的适应与通道蛋白，能量代谢的表达状况，以及sigma因子，非编码RNA等的调控密切相关。一系列组学数据分析显示粘细菌庞大基因组中核心基因组的数目较小且很多非核心基因的表达量很低，这暗示在营养条件下，很多基因是非必需和可移除的。而对于粘细菌次级代谢产物的研究需要一个合适的基因组精简的表达宿主，需要证实基因组中哪些基因是非必需的。我们首先在pminiHimar-lacZ质粒的反向重复序列中引入了MmeⅠ限制性修饰酶位点，通过质粒构建了黄色粘球菌DK1622的随机突变文库，将基因组酶切后构建了450bp的测序文库，通过测序发现DK1622菌株在营养条件下必须的基因数目为345个。在黄色粘球菌DK1622中，进行敲除使用的是二次同源重组的方法，我们证实通过这种方法可以敲除掉100kbp左右的片段，但由于纯化时间过长，不适用于进行大范围多目标的基因组精简。最近发展的CRISPR/Cas9技术在这方面具有优势，但这一技术体系还没有在粘细菌中建立起来。我们通过将卡那霉素启动子控制下的氯霉素基因，groEL启动子控制下的(d)cas9基因，pMF1复制起始区及p15A复制起始区整合，成功构建能够在DK1622菌株中正常转录（d)cas9基因的质粒。在带有靶向位点为pilA基因的pdCas9质粒菌株中，pilA基因的表达被抑制，菌株的S运动也受到限制，说明CRISPR/(d)Cas9系统能够在DK1622中正常行使功能。将两段靶向序列整合入pCas9质粒转入DK1622菌株后，在只通过一轮抗生素筛选的条件下就获得了目标敲除突变株。我们成功在DK1622菌株中构建了基于CRISPR/Cas9系统的基因一步敲除和沉默体系。综上，本文通过组学技术阐述了不同粘细菌复杂的基因组结构和多样的转录模式，通过比较基因组阐明了纤维堆囊菌的种群结构，通过转录组分析解析了橙色粘球菌DK1622适应海洋环境的因素，通过Tn-seq解析了黄色粘球菌的必需基因。同时在组学分析的基础上，改进了纤维堆囊菌中的遗传操作体系并在黄色粘球菌中建立了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑及调控研究方法。收起

关键词 : 粘细菌高通量测序环境适应 CRISPR/Cas9系统遗传操作

10. 粘球菌DK1622双拷贝GroEL功能分化及调控机制暨产酶溶杆菌OH11多烯类黄色素的生物合成机制

[学位论文] 王岩山东大学 2012年博士导师: 李越中;杜良成共284页

摘要 : 粘细菌是一类革兰氏阴性细菌，其具有复杂的社会学群体行为，这其中包括社会性运动，发育行为和捕食行为。粘细菌能够合成大量具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤活性的生物活性天然产物。粘球菌DK1622具有18个PKS/NRPS基因簇，目前已经报道具有生物学功能... 展开粘细菌是一类革兰氏阴性细菌，其具有复杂的社会学群体行为，这其中包括社会性运动，发育行为和捕食行为。粘细菌能够合成大量具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤活性的生物活性天然产物。粘球菌DK1622具有18个PKS/NRPS基因簇，目前已经报道具有生物学功能的代谢产物有五种：Myxovirescin(TA)，Myxalamid，DK xanthenes，Myxochelin和Myxochrmhide，其中Myxovirescin具有抗革兰氏阴性细菌活性，并且可以作为粘细菌捕食过程的“武器”，其失活将会导致细胞丧失捕食能力。粘细菌具有较大的基因组，这其中包括了大量的次级代谢产物合成相关基因和复杂的社会学行为中发挥功能的特异基因。另外，粘细菌基因组具有许多双拷贝甚至多拷贝基因，推测这些基因的多拷贝是由于为了更好的适应粘细菌复杂的生长周期和多重社会学行为，在长期进化过程中形成的。 GroEL蛋白是一类广泛存在于原核生物中的分子伴侣，由于其能够帮助蛋白折叠，蛋白转运以及抵抗外界高温低温等不利环境，因此groEL对生物的正常生存具有非常重要的作用。大部分已经测序的物种包含有单拷贝groEL基因，但是也有接近20％的已测序物种包含有双拷贝甚至多拷贝的groEL基因，并且这些多拷贝的基因具有明显不同的生理功能。例如，在Rhizobium leguminosarum基因组中包含有3个拷贝的groEL基因，其中groEL1基因对于细胞的正常生存起到至关重要的作用，而另外两个groEL的敲除对细胞正常生存没有影响。研究表明在大肠杆菌中，约有10％-15％的蛋白是依赖于GroEL进行折叠。GroEL分子在进化上高度保守，不同的种属之间的GroEL表现出了极大的序列相似性。DK1622含有双拷贝groEL，一个为典型的groES+groEL组织模式，我们称其为groEL1，另一个拷贝为失去groES的独立groEL，我们称其为groEL2。2001年，Anthony课题组发现在生长阶段热激反应过程中，双拷贝groEL基因均有较大幅度的上调表达，这表明这两个拷贝的基因在生长阶段均参与热激反应。另外John等人的研究结果还表明，groEL2在生长阶段的表达量显著高于发育阶段的，这暗示了其在生长过程中的重要作用。通过分子生物学，蛋白组学以及生物信息学的分析，本论文对粘球菌DK1622双拷贝groEL的功能分工以及产生功能分工的机理进行了研究，并且阐明了双拷贝groEL基因的调控机制：首先，groEL2对粘细菌捕食行为有不可替代的作用，而groEL1则对捕食过程没有太大贡献，敲除掉groEL2的突变株YL0302对大肠杆菌菌斑的捕食能力明显减弱，捕食速度不及野生型DK1622和groEL1敲除突变株YL0301的一半。由于粘细菌能够产生多种抗生素类次级代谢产物，因此能够对大肠杆菌有杀伤作用。YL0302表现出较弱的杀伤大肠杆菌能力，YL0301与野生型菌株DK1622有相当强度的杀伤能力，推测YL0302有某一或者某几种次级代谢产物消失，从而影响了其杀伤性。提取产物的拮抗实验表明YL0302周围没有抑菌圈产生，YL0301和DK1622都有明显的抑菌圈产生。HPLC结果显示YL0302中消失的抗生素为myxovirescin，即TA，为了确证YL0302的捕食缺陷是由于TA的消失导致的，我们将TA抗生素加入YL0302突变株的重悬液中进行捕食能力分析，发现加入TA后的YL0302恢复了捕食能力，验证了我们的推测是正确的。其次：通过免疫共沉淀实验，我们分别得到了GroEL1的底物蛋白和GroEL2的底物蛋白，在这些蛋白中，68个蛋白是GroEL1/2的共同底物，83个蛋白为GroEL1的特异性底物，46个蛋白为GroEL2的特异性底物。对这些底物的比较发现，双拷贝GroEL的底物有着各自的特点：GroEL1偏好分子量小的底物，一半以上的底物蛋白分子量小于40KD，GroEL2的底物分子量较GroEL1大，小于40KD的底物蛋白不到总底物的30%。另外我们发现，GroEL1和GroEL2的共同底物基本是粘细菌初级代谢的相关酶类，与细胞的正常生长密切相关，而GroEL1和GroEL2的特异性底物中，有数量较多的蛋白参与了粘球菌DK1622的复杂社会学行为，这一结果与第二章所讲述的GroEL在社会学行为中产生功能分工的结论相一致，并且从更深层的角度分析了双拷贝groEL产生功能分工的原因。第三，通过生物信息学和分子建模发现，GroEL1的顶端结构域的230位赖氨酸和GroEL2顶端结构域231位谷氨酰胺的差异是导致双拷贝GroEL对底物分子量偏好差异的潜在因素之一。GroEL1的230位氨基端赖氨酸，赖氨酸的长侧链伸向空腔中央，增加了空间位阻，而GroEL2的相应位点为231为氨基酸谷氨酰胺，只有较短侧链伸向空腔中央，因此不存在空间位阻。另外，双拷贝GroEL的C末端严重分化，GroEL1的C末端以6个GGM重复序列结尾，而GroEL2末端则不含规则的GGM序列，而是没有规律的随即氨基酸。生物信息学显示C末端的这一特点是双拷贝/多拷贝GroEL的共性，这为我们继续研究基因进化和功能分工之间的关系提供了机会。分子生物学结果显示GroEL1蛋白的C末端GGM重复序列对于GroEL1行使正常功能有不可替代的作用。将6个重复的GGM序列完全敲除或者将其截短都使GroEL1蛋白失去正常的功能。说明GGM是粘球菌DK1622双拷贝GroEL蛋白产生功能分化的推动力(之一)。然而定点突变结果显示GroEL1的顶端结构域氨基酸K231的缺失并不影响GroEL1正常发挥作用。第四，生物信息学分析发现两个拷贝的groEL基因前端都含有被称为CIRCE元件的反向重复序列，因此推测双拷贝groEL基因具有hrcA-CIRCE负调控机制。hrcA敲除突变株具有与野生型DK1622相似的生长运动能力和生孢能力，表明hrcA不参与粘细菌特有的社会学运动。但是hrcA的敲除使groEL基因的转录能力发生变化。当敲除掉hrcA基因后，groEL1在30摄氏度的表达量明显降低，仅为野生型菌株DK1622的0.07倍；进行热激处理后，hrcA敲除突变株的groEL1的表达量是DK1622热激之后groEL1的表达量的1.36倍。hrcA的敲除使groEL2基因在30度和42度条件下都有增量表达。以上实验结果表明无论groEL1和groEL2基因，都存在着hrcA-CIRCE负调控机制。另外，groEL作为热激蛋白，其在热激条件下表现出了激增的表达量：经过1小时42度热刺激后，DK1622 groEL1基因的表达量明显上升，为30度条件下groEL1表达量的13.27倍。相同地，groEL2在热激之后的表达量也具有明显的升高，其表达量为30度条件下groEL2表达量的9.65倍。与粘细菌类似，产酶溶杆菌能够产生丰富的次级代谢产物，这种能够滑行运动的细菌能够对多种真菌和细菌类植物致病菌产生拮抗作用，因此是一种新型的很有前景的生物防治菌。产酶溶杆菌的一大形态特点就是其菌落形态呈现黄色，其产生黄色形态原因，色素来源及色素功能尚不清楚。通过对其生物合成机制方面的研究，得出以下结果：首先，其黄色表型合成基因簇为由20个基因组成的二型PKS合成系统。为了确证这一PKS基因簇与黄色素的相关性，酰基载体蛋白ORF6，脂肪酰辅酶A合成酶ORF10，酮基还原酶ORF13，酰基合成酶ORF17被分别敲除。在这些敲除突变株中，ORF6，ORF13，ORF17三株突变株显示白色，ORF10显示黄色，这边明此PKS基因簇为色素的合成基因簇，并且ORF6/13/17为色素合成的必须基因，ORF10为色素合成的非必须基因。通过对色素的提取以及HPLC分析，发现产酶溶杆菌OH11的色素并非单一组分，而是由至少三个色素同系物组成的混合成分。HPLC分析显示野生型菌株OH11能够产生至少3个结构类似的色素类化合物，而白色突变株中则缺失了这些峰。其次，进一步的生物信息学分析显示，这一类型的基因簇广泛存在于各种细菌的基因组中，但是没有一个基因簇被深入研究，尤其是在合成生物学角度，没有课题组对其生物合成途径进行阐明。在这个基因簇以及同源基因簇内，ORF16-ORF17这对基因非常保守并且总是成对出现。ORF17为酮基合成酶，负责催化碳链的延伸，而ORF16则为未知蛋白。将ORF16插入失活之后，突变株显示白色表型。HHPRED软件分析暗示ORF16为新型的链长决定因子(CLF)，模拟结构为传统CLF的N末端，能够起始聚酮链的起始并且能够控制链的长度。为了确证ORF16是否为新型CLF，我们将假定的活性位点166位谷氨酰胺进行了定点突变，突变株显示白色表型。另外，生物学实验表明，色素成分为产酶溶杆菌的天然“防晒霜”，能够帮助细胞抵抗紫外线和高强度可见光的危害，这一功能能够使产酶溶杆菌细胞更好的适应光逆境条件。除了光保护作用，黄色素还具有抗氧化活性，其能够增加细胞在双氧水环境下的生存率，以能够较好的适应自然环境下的氧化逆境环境。收起

关键词 : 粘球菌产酶溶杆菌次级代谢产物色素功能分工社会学行为