摘要: 粘细菌是一类革兰氏阴性细菌，其具有复杂的社会学群体行为，这其中包括社会性运动，发育行为和捕食行为。粘细菌能够合成大量具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤活性的生物活性天然产物。粘球菌DK1622具有18个PKS/NRPS基因簇，目前已经报道具有生物学功能... 展开 粘细菌是一类革兰氏阴性细菌，其具有复杂的社会学群体行为，这其中包括社会性运动，发育行为和捕食行为。粘细菌能够合成大量具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤活性的生物活性天然产物。粘球菌DK1622具有18个PKS/NRPS基因簇，目前已经报道具有生物学功能的代谢产物有五种：Myxovirescin(TA)，Myxalamid，DK xanthenes，Myxochelin和Myxochrmhide，其中Myxovirescin具有抗革兰氏阴性细菌活性，并且可以作为粘细菌捕食过程的“武器”，其失活将会导致细胞丧失捕食能力。粘细菌具有较大的基因组，这其中包括了大量的次级代谢产物合成相关基因和复杂的社会学行为中发挥功能的特异基因。另外，粘细菌基因组具有许多双拷贝甚至多拷贝基因，推测这些基因的多拷贝是由于为了更好的适应粘细菌复杂的生长周期和多重社会学行为，在长期进化过程中形成的。 GroEL蛋白是一类广泛存在于原核生物中的分子伴侣，由于其能够帮助蛋白折叠，蛋白转运以及抵抗外界高温低温等不利环境，因此groEL对生物的正常生存具有非常重要的作用。大部分已经测序的物种包含有单拷贝groEL基因，但是也有接近20％的已测序物种包含有双拷贝甚至多拷贝的groEL基因，并且这些多拷贝的基因具有明显不同的生理功能。例如，在Rhizobium leguminosarum基因组中包含有3个拷贝的groEL基因，其中groEL1基因对于细胞的正常生存起到至关重要的作用，而另外两个groEL的敲除对细胞正常生存没有影响。研究表明在大肠杆菌中，约有10％-15％的蛋白是依赖于GroEL进行折叠。GroEL分子在进化上高度保守，不同的种属之间的GroEL表现出了极大的序列相似性。DK1622含有双拷贝groEL，一个为典型的groES+groEL组织模式，我们称其为groEL1，另一个拷贝为失去groES的独立groEL，我们称其为groEL2。2001年，Anthony课题组发现在生长阶段热激反应过程中，双拷贝groEL基因均有较大幅度的上调表达，这表明这两个拷贝的基因在生长阶段均参与热激反应。另外John等人的研究结果还表明，groEL2在生长阶段的表达量显著高于发育阶段的，这暗示了其在生长过程中的重要作用。 通过分子生物学，蛋白组学以及生物信息学的分析，本论文对粘球菌DK1622双拷贝groEL的功能分工以及产生功能分工的机理进行了研究，并且阐明了双拷贝groEL基因的调控机制：首先，groEL2对粘细菌捕食行为有不可替代的作用，而groEL1则对捕食过程没有太大贡献，敲除掉groEL2的突变株YL0302对大肠杆菌菌斑的捕食能力明显减弱，捕食速度不及野生型DK1622和groEL1敲除突变株YL0301的一半。由于粘细菌能够产生多种抗生素类次级代谢产物，因此能够对大肠杆菌有杀伤作用。YL0302表现出较弱的杀伤大肠杆菌能力，YL0301与野生型菌株DK1622有相当强度的杀伤能力，推测YL0302有某一或者某几种次级代谢产物消失，从而影响了其杀伤性。提取产物的拮抗实验表明YL0302周围没有抑菌圈产生，YL0301和DK1622都有明显的抑菌圈产生。HPLC结果显示YL0302中消失的抗生素为myxovirescin，即TA，为了确证YL0302的捕食缺陷是由于TA的消失导致的，我们将TA抗生素加入YL0302突变株的重悬液中进行捕食能力分析，发现加入TA后的YL0302恢复了捕食能力，验证了我们的推测是正确的。 其次：通过免疫共沉淀实验，我们分别得到了GroEL1的底物蛋白和GroEL2的底物蛋白，在这些蛋白中，68个蛋白是GroEL1/2的共同底物，83个蛋白为GroEL1的特异性底物，46个蛋白为GroEL2的特异性底物。对这些底物的比较发现，双拷贝GroEL的底物有着各自的特点：GroEL1偏好分子量小的底物，一半以上的底物蛋白分子量小于40KD，GroEL2的底物分子量较GroEL1大，小于40KD的底物蛋白不到总底物的30%。另外我们发现，GroEL1和GroEL2的共同底物基本是粘细菌初级代谢的相关酶类，与细胞的正常生长密切相关，而GroEL1和GroEL2的特异性底物中，有数量较多的蛋白参与了粘球菌DK1622的复杂社会学行为，这一结果与第二章所讲述的GroEL在社会学行为中产生功能分工的结论相一致，并且从更深层的角度分析了双拷贝groEL产生功能分工的原因。 第三，通过生物信息学和分子建模发现，GroEL1的顶端结构域的230位赖氨酸和GroEL2顶端结构域231位谷氨酰胺的差异是导致双拷贝GroEL对底物分子量偏好差异的潜在因素之一。GroEL1的230位氨基端赖氨酸，赖氨酸的长侧链伸向空腔中央，增加了空间位阻，而GroEL2的相应位点为231为氨基酸谷氨酰胺，只有较短侧链伸向空腔中央，因此不存在空间位阻。另外，双拷贝GroEL的C末端严重分化，GroEL1的C末端以6个GGM重复序列结尾，而GroEL2末端则不含规则的GGM序列，而是没有规律的随即氨基酸。生物信息学显示C末端的这一特点是双拷贝/多拷贝GroEL的共性，这为我们继续研究基因进化和功能分工之间的关系提供了机会。分子生物学结果显示GroEL1蛋白的C末端GGM重复序列对于GroEL1行使正常功能有不可替代的作用。将6个重复的GGM序列完全敲除或者将其截短都使GroEL1蛋白失去正常的功能。说明GGM是粘球菌DK1622双拷贝GroEL蛋白产生功能分化的推动力(之一)。然而定点突变结果显示GroEL1的顶端结构域氨基酸K231的缺失并不影响GroEL1正常发挥作用。 第四，生物信息学分析发现两个拷贝的groEL基因前端都含有被称为CIRCE元件的反向重复序列，因此推测双拷贝groEL基因具有hrcA-CIRCE负调控机制。hrcA敲除突变株具有与野生型DK1622相似的生长运动能力和生孢能力，表明hrcA不参与粘细菌特有的社会学运动。但是hrcA的敲除使groEL基因的转录能力发生变化。当敲除掉hrcA基因后，groEL1在30摄氏度的表达量明显降低，仅为野生型菌株DK1622的0.07倍；进行热激处理后，hrcA敲除突变株的groEL1的表达量是DK1622热激之后groEL1的表达量的1.36倍。hrcA的敲除使groEL2基因在30度和42度条件下都有增量表达。以上实验结果表明无论groEL1和groEL2基因，都存在着hrcA-CIRCE负调控机制。另外，groEL作为热激蛋白，其在热激条件下表现出了激增的表达量：经过1小时42度热刺激后，DK1622 groEL1基因的表达量明显上升，为30度条件下groEL1表达量的13.27倍。相同地，groEL2在热激之后的表达量也具有明显的升高，其表达量为30度条件下groEL2表达量的9.65倍。 与粘细菌类似，产酶溶杆菌能够产生丰富的次级代谢产物，这种能够滑行运动的细菌能够对多种真菌和细菌类植物致病菌产生拮抗作用，因此是一种新型的很有前景的生物防治菌。产酶溶杆菌的一大形态特点就是其菌落形态呈现黄色，其产生黄色形态原因，色素来源及色素功能尚不清楚。通过对其生物合成机制方面的研究，得出以下结果： 首先，其黄色表型合成基因簇为由20个基因组成的二型PKS合成系统。为了确证这一PKS基因簇与黄色素的相关性，酰基载体蛋白ORF6，脂肪酰辅酶A合成酶ORF10，酮基还原酶ORF13，酰基合成酶ORF17被分别敲除。在这些敲除突变株中，ORF6，ORF13，ORF17三株突变株显示白色，ORF10显示黄色，这边明此PKS基因簇为色素的合成基因簇，并且ORF6/13/17为色素合成的必须基因，ORF10为色素合成的非必须基因。通过对色素的提取以及HPLC分析，发现产酶溶杆菌OH11的色素并非单一组分，而是由至少三个色素同系物组成的混合成分。HPLC分析显示野生型菌株OH11能够产生至少3个结构类似的色素类化合物，而白色突变株中则缺失了这些峰。 其次，进一步的生物信息学分析显示，这一类型的基因簇广泛存在于各种细菌的基因组中，但是没有一个基因簇被深入研究，尤其是在合成生物学角度，没有课题组对其生物合成途径进行阐明。在这个基因簇以及同源基因簇内，ORF16-ORF17这对基因非常保守并且总是成对出现。ORF17为酮基合成酶，负责催化碳链的延伸，而ORF16则为未知蛋白。将ORF16插入失活之后，突变株显示白色表型。HHPRED软件分析暗示ORF16为新型的链长决定因子(CLF)，模拟结构为传统CLF的N末端，能够起始聚酮链的起始并且能够控制链的长度。为了确证ORF16是否为新型CLF，我们将假定的活性位点166位谷氨酰胺进行了定点突变，突变株显示白色表型。 另外，生物学实验表明，色素成分为产酶溶杆菌的天然“防晒霜”，能够帮助细胞抵抗紫外线和高强度可见光的危害，这一功能能够使产酶溶杆菌细胞更好的适应光逆境条件。除了光保护作用，黄色素还具有抗氧化活性，其能够增加细胞在双氧水环境下的生存率，以能够较好的适应自然环境下的氧化逆境环境。 收起