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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:本试验旨在筛选与布鲁氏菌分泌蛋白BspA互作的细胞靶蛋白,并研究BspA与宿主细胞靶蛋白互作过程中的生物学功能,揭示布鲁氏菌分泌蛋白BspA调控细菌胞内寄生的分子机制,为布鲁氏菌致病机制的研究奠定基础。 方法:(1)利用卡纳抗性替换的方... 展开 目的:本试验旨在筛选与布鲁氏菌分泌蛋白BspA互作的细胞靶蛋白,并研究BspA与宿主细胞靶蛋白互作过程中的生物学功能,揭示布鲁氏菌分泌蛋白BspA调控细菌胞内寄生的分子机制,为布鲁氏菌致病机制的研究奠定基础。 方法:(1)利用卡纳抗性替换的方法构建布鲁氏菌分泌蛋白BspA缺失株,并利用生物信息学软件对BspA进行生物信息学分析。通过TMHMMServerv.2.0在线软件对BspA蛋白质跨膜结构域进行预测分析,通过PredictingAntigenicPeptides在线分析软件对BspA蛋白质的抗原决定簇进行预测分析,通过GalaxyTBM和SWISS-MODEL分别对BspA蛋白的二级结构和三级结构进行分析,通过cNLSMapper和NetNES1.1Server分别对BspA蛋白的核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)进行预测分析。(2)利用分子克隆技术对牛种布鲁氏菌S2308株IV型分泌系统(T4SS)分泌蛋白BspA进行克隆、测序,将其连接到pGBKT7诱饵载体上,构建重组诱饵载体,并检测重组诱饵载体对Y2HGold的毒性和自激活性,再将含有重组诱饵质粒的酵母菌和含有AD文库质粒的酵母菌双杂交进行互作蛋白的筛选,再利用酵母共转的方法进一步来验证BspA与宿主靶蛋白是否互作。(3)建立布鲁氏菌野生型和BspA缺失株侵染RAW264.7细胞模型,利用siRNA干扰技术合成si-C1qbp并转入RAW264.7细胞,qRT-PCR检测si-C1qbp的干扰效率;布鲁氏菌S2308和ΔBspA感染RAW264.7细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后,qRT-PCR检测C1qbpmRNA表达水平;将si-C1qbp转入RAW264.7细胞,并分别用布鲁氏菌S2308和ΔBspA感染后,qRT-PCR检测p65、IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA相对表达量。 结果:(1)成功构建缺失株BspA,至少稳定遗传15代。通过生物信息学方法分析预测得到,BspA蛋白有跨膜结构域,抗原决定簇有5个,有核定位信号和核输出信号,蛋白质二级结构中有114个氨基酸构成BspA蛋白中的α螺旋;有20个氨基酸构成其延伸链;有6个氨基酸构成β转角;有50个氨基酸构成不规则卷曲。蛋白质三级结构中有大量的不规则卷曲、α螺旋和延伸链。(2)牛种布鲁氏菌S2308株BspA基因克隆正确,长度为576bp,与预期结果一致并且成功连接到pGBKT7载体上,构建的重组诱饵载体对酵母细胞无毒副作用,有自激活性,能够用于酵母双杂交实验。酵母双杂交结果筛选到4个阳性克隆,经测序四个基因分别为Cqbp补体成分1,q亚成分结合蛋白、氯化物细胞内通道蛋白1、DNA定向的RNA聚合酶I和III亚基RPAC2亚型2、铜/锌超氧化物歧化酶。并成功验证BspA与C1qbp互作。(3)C1qbpsiRNA-2干扰效果最为显著(plt;0.05);布鲁氏菌的感染均抑制了IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达,且显著抑制p65mRNA表达(Plt;0.05);与Brucella+si-NC组相比,Brucella+si-C1qbp组均抑制了IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达,且极显著抑制了p65mRNA表达(Plt;0.01),ΔBspA-NC组显著上调了p65、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平(Plt;0.05),极显著上调了IL-6mRNA表达水平(Plt;0.01);而与ΔBspA+si-NC组相比,ΔBspA+si-C1qbp组均消除了ΔBspA对p65、IL-1β、IL-6mRNA表达水平的上调效果,且对TNF-αmRNA的下调效果显著(Plt;0.05)。 结论:(1)成功构建流产布鲁氏菌分泌蛋白BspA缺失株,并且稳定遗传15代。(2)筛选到4种可能与BspA相互作用的候选蛋白:C1qbp、CLIC1、DNA定向的RNA聚合酶I和III亚基RPAC2亚型2、铜/锌超氧化物歧化酶。并成功验证BspA与C1qbp相互作用。(3)在布鲁氏菌胞内寄生期间,布鲁氏菌的BspA基因抑制RAW264.7细胞的C1qbp基因表达,而C1qbp基因能够促进促炎细胞因子表达;布鲁氏菌的BspA基因和RAW264.7细胞的C1qbp基因互作能够抑制NF-κB信号通路的活化,进而减缓炎症的发生。 收起
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