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1. 对虾感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化及差异酪氨酸磷酸化蛋白的鉴定

[学位论文] 翟富德中国海洋大学 2018年硕士导师: 唐小千共70页

摘要 : 当宿主细胞遭受病原侵染时,蛋白质磷酸化作为最主要的信号传递方式在调控宿主细胞进行防御应答中起着关键作用。为了研究蛋白酪氨酸磷酸化与白斑症病毒（WSSV）侵染的相互关系，本文利用流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附实验（ELISA）与细胞免疫荧光实... 展开当宿主细胞遭受病原侵染时,蛋白质磷酸化作为最主要的信号传递方式在调控宿主细胞进行防御应答中起着关键作用。为了研究蛋白酪氨酸磷酸化与白斑症病毒（WSSV）侵染的相互关系，本文利用流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附实验（ELISA）与细胞免疫荧光实验对WSSV感染后对虾血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化进行了分析，并通过双向电泳结合质谱技术对WSSV感染后对虾血细胞内差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白进行了分析与鉴定，本研究为进一步深入揭示病毒侵染细胞的分子策略以及细胞抗病毒免疫防御应答的分子调控机制提供了基础资料。具体研究内容和结果如下：（1）利用FCM、ELISA以及细胞免疫荧光对凡纳滨对虾（Penaeusvanmamei）感染WSSV后血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平进行检测。FCM结果显示，血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平随着WSSV的感染进程出现显著性波动，整体呈现出先上升后下降的趋势，并于感染后6h、24h分别达到第一、第二峰值。ELISA结果显示，血细胞内酪氨酸磷酸化蛋白浓度随着WSSV的感染进程出现显著性变化，并于感染后6h和24h分别到达第一、第二峰值，其变化趋势与FCM结果相符。细胞免疫荧光结果显示，健康、WSSV感染的血细胞均有阳性信号，细胞的荧光强度随着WSSV的感染进程出现显著性变化，且感染后6h和24h细胞荧光强度明显高于其他时间点，结果与FCM及ELISA实验结果相吻合。（2）利用双向电泳（2-DE）结合质谱分析技术对WSSV感染前后凡纳滨对虾血细胞内的差异酪氨酸磷酸化蛋白进行分析鉴定，并通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）对部分差异酪氨酸磷酸化蛋白的基因表达水平进行了检测。双向免疫印迹实验（2-DEwesterning-blotting）结果显示，在感染组与对照组中共发现了12个差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白点。通过质谱分析共成功鉴定出了8个差异酪氨酸磷酸化蛋白，其分别为：钠/钾转运ATP酶、泛素/核糖体L40融合蛋白、肌动蛋白-D、β-肌动蛋白、磷酸丙酮酸水合酶、ATP合成酶β亚基、受体激活蛋白激酶C1、蛋白二硫键异构酶。RT-PCR结果显示，ATP合成酶β亚基、受体激活蛋白激酶C1、钠/钾转运ATP酶、泛素/核糖体L40融合蛋白的基因表达量在WSSV感染后均出现显著性上调。（3）利用免疫磁珠成功将中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)血细胞分选为透明血细胞和颗粒血细胞，并通过FCM与瑞氏-姬姆萨染色对分选结果进行了验证。利用FCM、ELISA以及细胞免疫荧光实验对WSSV感染后中国对虾透明血细胞和颗粒血细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平进行了检测，并通过2-DEwestern-blotting对WSSV感染后颗粒血细胞中差异酪氨酸磷酸化蛋白进行分析。FCM结果显示，中国对虾感染WSSV后颗粒血细胞中蛋白酪氨酸磷酸化水平出现显著性波动并于感染后12h达到峰值，透明血细胞中蛋白酪氨酸磷酸化水平无明显变化且显著低于颗粒血细胞。ELISA与细胞免疫荧光实验结果与FCM结果基本相符。双向Western-blotting结果显示，在感染组和对照组颗粒血细胞中共发现了14个差异酪氨酸磷酸化蛋白点。收起

关键词 : 对虾白斑症病毒蛋白酪氨酸磷酸化差异酪氨酸磷酸化蛋白免疫机制

2. 酪氨酸激酶CSK调控抗DNA病毒天然免疫信号转导

[学位论文] 高芃武汉大学 2020年博士导师: 舒红兵共98页

摘要 : 病毒双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)是一类经典的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，能够被细胞质中的环状鸟苷酸腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)识别。cGAS结合病毒dsDNA后发生寡聚化，并利用GTP和... 展开病毒双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)是一类经典的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，能够被细胞质中的环状鸟苷酸腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)识别。cGAS结合病毒dsDNA后发生寡聚化，并利用GTP和ATP合成第二信使环二单磷酸鸟苷-腺苷(cGAMP)。cGAMP与定位在内质网的接头蛋白MITA(又称为STING，MPYS，ERIS，TMEM173)结合，诱导MITA的激活。MITA激活后发生从内质网经过内质网-高尔基中间体向核周点状结构的转运。在迁移过程中，MITA招募蛋白激酶TBK1，促进TBK1发生自身磷酸化并对MITAS366位点进行磷酸化修饰。MITAS366位点的磷酸化对MITA招募转录因子IRF3至关重要。复合物MITA-TBK1-IRF3组装完成后，IRF3被TBK1磷酸化，形成二聚体并迁移入核，启动下游基因的转录。 DNA病毒诱导天然免疫应答信号转导过程的调控机制尚未得到充分阐释。为了进一步探明cGAS-MITA通路的调控机制，我们对蛋白激酶进行了表达克隆筛选，发现过量表达CSK促进cGAS-MITA诱导的IFN-β启动子激活。利用CRISPER/Cas9技术对细胞进行基因编辑，我们发现CSK蛋白缺失抑制HSV-1、dsDNA和cGAMP诱导的下游基因转录，以及HSV-1诱导的MITA、IRF3磷酸化。生化实验显示，内源性CSK与MITA发生组成性相互作用，并依赖蛋白激酶活性对MITA进行Y240、Y245位点的磷酸化修饰。Y240、Y245位点的磷酸化对于MITA的激活至关重要。最近的报道表明，MITA的酪氨酸磷酸化对增强其蛋白稳定性以及结合cGAMP发生活化具有重要意义。MITAY240位点的磷酸化修饰能提高其与cGAMP的结合能力。酪氨酸激酶SRC通过磷酸化MITAY245位点维持其稳定性。磷酸酶PTPN1/2能够去除MITAY245位点的磷酸化修饰，促进MITA通过不依赖于泛素的20S蛋白酶体途径降解，从而抑制抗DNA病毒天然免疫反应。由以上报道结合本研究结果表明，CSK通过靶向MITAY240、Y245位点的磷酸化修饰在抗DNA病毒天然免疫应答中发挥重要调控功能。我们的发现有助于了解cGAS-MITA介导抗DNA病毒天然免疫应答的精细调控机制。收起

关键词 : 天然免疫 DNA病毒 MITA CSK 酪氨酸磷酸化酪氨酸激酶

3. Dok6通过PTB结构域以依赖酪氨酸磷酸化方式与TrkC的NPQY模体结合

[学位论文] 阴彬北京协和医学院(中国医学科学院) 2007年硕士导师: 袁建刚;强伯勤共59页

摘要 : Dok6是p62Dok家族的新成员。p62DOK(downstream of tyrosine kinase/docking protein)蛋白家族是胞内接头蛋白家族，Dok6属于该家族的Dok4/5亚家族。人DOK6 eDNA开放阅读框长993bp，编码331个氨基酸。DOK6蛋白分子量约38.3kDa。Dok6蛋白具有信号蛋白典... 展开 Dok6是p62Dok家族的新成员。p62DOK(downstream of tyrosine kinase/docking protein)蛋白家族是胞内接头蛋白家族，Dok6属于该家族的Dok4/5亚家族。人DOK6 eDNA开放阅读框长993bp，编码331个氨基酸。DOK6蛋白分子量约38.3kDa。Dok6蛋白具有信号蛋白典型的结构特征：N端的PH结构域(8-114氨基酸)，中央的PTB结构域(130—232氨基酸)，以及C端区域(232-330氨基酸)。定量RT-PCR分析显示Dok6主要在脑组织中高表达，尤其是在胎脑表达量最高。 Trk受体家族是对neurotrophin因子具有高亲和力的受体，是细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，该家族包括3个成员：TrkA、TrkB和TrkC。在neurotrophins刺激下，Trk受体通过二聚体化激活自身的酪氨酸激酶活性，活化的受体能够募集多种信号蛋白并将它们磷酸化，从而把信号由胞外转导到胞内。本实验室发现Dok4/5亚家族的Dok5蛋白与TrkB、TrkC受体相互作用，增强TrkB、TrkC受体介导的：MAPK通路的活化水平并延长其活化时间。由于Dok6与Dok5具有较高的同源性，又都在神经系统高表达，Dok6也存在与Trk受体相互作用的可能。为了证明这个推断，我们利用酵母双杂交系统、pulldown assay和Co-IP首先验证Dok6与。Trk受体的相互作用，实验结果显示Dok6选择性的与Trk受体家族的TrkC受体相互作用，而不与TrkA、B相互作用。为了进一步确证Dok6与TrkC受体的结合位点及方式，本实验将．Dok6 cDNA分段克隆，在酵母双杂交系统中验证了Dok6只有通过其PTB结构域才能与TrkC受体相互作用，PH结构域与C端都不能与TrkC受体结合。TrkC受体的胞内区五个酪氨酸残基及与酪氨酸激酶活性重要相关的赖氨酸残基的突变体，分别与Dok6 PTB结构域进行了酵母双杂交、pulldown assay验证实验。结果显示，与TrkC受体激酶活性相关的赖氨酸Lys的突变同样也破坏了Dok6与TrkC受体的相互作用，说明Dok6识别结合于Trk受体的NPQY模体。通过分段实验及突变分析，我们确定了Dok6的PTB结构域通过依赖酪氨酸磷酸化方式与TrkC的NPQY模体结合。收起

关键词 : 酪氨酸激酶神经系统突变体酪氨酸磷酸化

4. 蛋白酪氨酸磷酸化调控玉米果穗不同部位种子活力差异的初步研究

[学位论文] 王颜颜山东农业大学 2017年硕士导师: 李岩共54页

摘要 : 种子是农业生产中最基本、最重要的生产资料。种子质量的优劣直接影响农业生产，而种子活力是衡量种子播种质量的指标。高活力种子出苗快速整齐，抗逆性强，具有明显的生长优势和生产潜力。因此，揭示种子活力差异的机制对于高活力种子生产、加工具有... 展开种子是农业生产中最基本、最重要的生产资料。种子质量的优劣直接影响农业生产，而种子活力是衡量种子播种质量的指标。高活力种子出苗快速整齐，抗逆性强，具有明显的生长优势和生产潜力。因此，揭示种子活力差异的机制对于高活力种子生产、加工具有重要的理论指导意义和潜在的应用价值，对于提高我国种业竞争力具有重要的现实意义。本实验室前期研究已经发现玉米果穗不同部位种子活力为中部＞基部＞顶部。本研究从蛋白磷酸激酶基因和磷酸化蛋白两方面入手，对酪氨酸磷酸化调控玉米果穗不同部位种子活力差异进行初步研究。主要研究结果如下： 1．通过对吸胀24h的郑单958上部和中部种子SDS-PAGE单向电泳结合酪氨磷酸化抗体的Western blot实验，发现吸胀24h种子蛋白分子量55-72KD范围内中部酪氨酸磷酸化蛋白表达量高于上部。 2.通过Western blot结合质谱技术发现了上部没有磷酸化而中部磷酸化了的蛋白P93805，对其进行KEGG通路分析发现P93805是糖酵解过程中的关键酶葡萄糖磷酸变位酶，其磷酸化差异水平可能导致果穗上部和中部能量代谢差异，进而影响种子活力。 3.利用生物信息学软件分析酪氨酸蛋白激酶基因GRMZM2G076423启动子区顺式作用元件，结果发现，该启动子区具有光应答、低温应答、胁迫应答、与发育及激素相关的调控结构域。预测该基因编码377个氨基酸，蛋白质分子量为42.28 KD，理论等电点为7.12。进化分析结果表明：GRMZM2G076423编码的蛋白与水稻中编码酪氨酸蛋白激酶的 LOC_Os03g06330.1蛋白处于一个分支，说明他们之间的亲缘关系最近同属于酪氨酸蛋白激酶亚家族成员。 4.采用 RT-PCR方法分析了基因 GRMZM2G076423的表达模式，结果表明该基因存在组织差异性表达；吸胀24h时表达量最高；经盐胁迫和干旱胁迫后呈下调表达。 5．通过野生型和GRMZM2G076423基因5，端的Mu转座子插入突变体的研究发现：该基因的下调表达降低种子活力。收起

关键词 : 种子活力蛋白酪氨酸磷酸化玉米

5. 敲除抑癌基因PTPRO对小鼠乳腺发育的影响

[学位论文] 殷秀凯汕头大学 2012年硕士导师: 张灏共74页

摘要 : 酪氨酸磷酸化/去磷酸化作用是调节诸多细胞行为和生命活动的基础调控机制，由蛋白酪氨酸激酶（PTKs）家族与磷酸酶（PTPs）家族共同介导。酪氨酸磷酸化/去磷酸化过程不仅涉及细胞生长、增殖、分化、细胞粘附和迁移、细胞间相互作用和器官发育等诸多方... 展开酪氨酸磷酸化/去磷酸化作用是调节诸多细胞行为和生命活动的基础调控机制，由蛋白酪氨酸激酶（PTKs）家族与磷酸酶（PTPs）家族共同介导。酪氨酸磷酸化/去磷酸化过程不仅涉及细胞生长、增殖、分化、细胞粘附和迁移、细胞间相互作用和器官发育等诸多方面，而且在肿瘤形成过程中，同样发挥着至关重要的作用。近年来，由于受体型酪氨酸磷酸酶PTPRO(Protein Tyrosine Phosphatase Receptor-type O, PTPRO)在发育中的重要功能及潜在的抑癌作用而被广泛关注。在发育方面，PTPRO主要表达于肾脏及脑组织中，调节肾小球足细胞及中间神经元的发育、成熟及分化等功能；在肿瘤细胞中，PTPRO启动子区往往处于甲基化状态而表达失活，而PTPRO重新表达展示出潜在的抑癌作用，抑制细胞的增殖和转移。尽管如此，PTPRO调控器官发育、抑制肿瘤生长及转移的分子机制尚不明确。我们以PTPRO基因敲除（PTPRO-/-）小鼠为研究模型，首次在体内初步研究了PTPRO基因缺失对小鼠乳腺发育的影响。我们首先采用原位杂交（In Situ Hybrization）与RT-PCR方法共同检测了PTPRO在乳腺组织中的表达情况，PTPRO主要表达于乳腺的导管上皮细胞，在青春期（Virgin）及退化期（Involutuion）表达较高，在怀孕期（Pregnancy）及哺乳期（Lactation）表达较低；通过Whole Mount及HE染色进一步分析PTPRO的缺失对小鼠乳腺发育的影响，结果显示了PTPRO-/-小鼠乳腺诸多方面的异常发育，具体表现为virgin期TEB(Terminal End Bud, TEB)数目的减少以及导管延伸的增加；Pregnancy期腺泡形成受到抑制；Involution期乳腺退化与导管重塑过程受到抑制等。深入研究发现，PTPRO的缺失导致了小鼠乳腺发育过程中细胞增殖与分化指标的异常。PCNA与Ki67免疫组化结果显示，在PTPRO-/-小鼠乳腺的TEB结构中细胞增殖有所降低，这可能是导致TEB数目减少的主要原因；而在involution期，PTPRO-/-乳腺导管上皮细胞增殖明显增加，这种异常增加的细胞增殖可能影响了乳腺导管的正常退化和重塑过程；另外， PTPRO的缺失还导致了乳腺导管上皮细胞中CK15和CK19蛋白的表达下调。异常表达的CK15与CK19提示我们，PTPRO可能参与调控了小鼠乳腺导管在不同时期的成熟及分化等过程。PTPRO缺失造成小鼠乳腺的异常发育，很有可能促进了乳腺癌的发生与发展。收起

关键词 : 酪氨酸磷酸化受体型酪氨酸磷酸酶乳腺发育抑癌作用

6. 大鼠局灶性脑缺血再灌注后STAT3表达与酪氨酸磷酸化及神经元凋亡研究

[学位论文] 郭科中南大学 2005年硕士导师: 资晓宏共59页

摘要 : 　　本课题研究了脑缺血再灌注后STAT3蛋白表达及其酪氨酸磷酸化，同时研究STAT3酪氨酸磷酸化与凋亡相关蛋白Bcl-2、Fas的关系，探讨其在脑缺血再灌注损伤的分子病理机制，为临床治疗新靶点提供实验基础。　　方法采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉... 展开

关键词 : 缺血再灌注神经元凋亡酪氨酸磷酸化 STAT3

7. 酪氨酸磷酸化修饰调控Sox2的转录活性

[学位论文] 王蕾浙江大学 2017年博士导师: 夏总平共150页

摘要 : 胚胎干细胞是一种具有自我更新与多能性的细胞，受到多种转录因子的调控。在胚胎干细胞中，参与调控的转录因子调控网络是以Sox2、Oct4和Nanog组成环路为中心。这三个因子对于胚胎干细胞的多能性维持和自我更新过程以及胚胎的早期发育都至关重要。与此... 展开胚胎干细胞是一种具有自我更新与多能性的细胞，受到多种转录因子的调控。在胚胎干细胞中，参与调控的转录因子调控网络是以Sox2、Oct4和Nanog组成环路为中心。这三个因子对于胚胎干细胞的多能性维持和自我更新过程以及胚胎的早期发育都至关重要。与此同时，Sox2、Oct4和Nanog还是诱导体细胞重编程的关键因子。这三个因子在细胞内的表达及活性受到精密的调控。研究发现，Sox2，Oct4和Nanog蛋白通过不同的翻译后修饰调控它们的功能，这些翻译后修饰包括磷酸化，泛素化以及糖基化修饰等。其中，Sox2蛋白已知的翻译后修饰有磷酸化、甲基化、糖基化和泛素化等。S ox2蛋白在苏氨酸118位和丝氨酸253位等位点上具有磷酸化修饰，而且这些修饰参与调控Sox2的功能。到目前为止，并没有关于Sox2酪氨酸位点磷酸化的报道。本文中，我们发现酪氨酸磷酸化修饰也参与调控Sox2的功能。首先，我们发现有三个酪氨酸位点影响Sox2蛋白在体细胞重编程中的功能，其中两个位点直接参与Sox2蛋白与DNA的结合，另一个位点Y279影响Sox2蛋白功能的机制未知。通过软件分析Y279附近的蛋白序列并结合实验数据，发现磷酸化该位点的激酶是Pyk2。随后，我们发现Sox2 Y279位磷酸化会影响Sox2的转录活性，并且这一磷酸化修饰促进了Sox2和Tet2之间的相互作用。Y279位点的磷酸化对于Sox2在胚胎干细胞中和体细胞重编程中的功能都很重要。综上所述，我们发现了Sox2蛋白的酪氨酸磷酸化修饰位点，而且这一位点的磷酸化参与调控Sox2蛋白在胚胎干细胞和体细胞重编程中的功能。我们还发现这一磷酸化修饰可以促进Sox2与Tet2的相互作用。Tet2在胚胎干细胞内高表达，可以催化DNA上的甲基化修饰发生氧化反应从而实现去甲基化。Tet2也可以促进体细胞重编程过程。因此，我们提出了一个模型:在体细胞重编程过程中，一开始，Sox2与甲基化修饰的DNA结合。然后，Sox2招募Tet2蛋白对DNA进行去甲基化修饰过程，进而提高Sox2和DNA之间的结合能力，促进下游基因的表达。在这个过程中，Y279位磷酸化修饰会促进Sox2与Tet蛋白结合，加快DNA去甲基化过程，提高体外重编程的效率。收起

关键词 : 胚胎干细胞酪氨酸磷酸化修饰 Sox2蛋白转录活性

8. 体外获能马鹿精子酪氨酸磷酸化蛋白的分布与表达

[学位论文] 张士芳东北林业大学 2010年硕士导师: 李和平共46页

摘要 : 人及哺乳动物的受精过程是一系列的复杂事件。哺乳动物精子必须在雌性生殖道内经历成熟过程才能获得受精能力,这一现象称为获能(Capacitation)。精子获能是精卵结合的前提,许多因素参与调节精子获能,其中精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子运动力、精子超激活... 展开

关键词 : 马鹿精子体外获能酪氨酸磷酸化蛋白

9. 酪氨酸可逆磷酸化参与ABA调控的种子吸胀脱水耐性丧失

[学位论文] 李林北京林业大学 2010年硕士导师: 汪晓峰共44页

摘要 : 本实验以“郑58”自交系玉米种子为试材,研究种子在吸胀萌发过程中,脱落酸(ABA)调控的种子脱水耐性逐渐消失与蛋白酪氨酸磷酸化的关系。种子在15℃条件下吸胀不同时间(0、1、2、3、4、5d)后脱水回干至原始含水量。结果表明,种子吸胀3d后其脱水耐性显著... 展开

关键词 : ABA调控脱水耐性蛋白酪氨酸可逆磷酸化种子吸胀

10. 腺苷对T淋巴细胞白细胞介素-2受体信号传导的影响

[学位论文] 赵川莉山东大学 2002年博士导师: 徐从高共64页

摘要 : 目的：阐明腺苷对T淋巴细胞白细胞介素质-2受体（IL-2R）信号传导途径影响的具体作用机制,有助于寻找一种对抗肿瘤免疫逃避的有效方法.结论：1）该研究在国内率先证实腺苷抑制IL-2R信号传导,这种抑制不是出腺苷的非特异性毒性引起的.2）腺苷在受体水平... 展开

关键词 : 腺苷白细胞介素-2受体信号传导酪氨酸磷酸化蛋白酪氨酸激酶