中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. 雾化吸入母牛分枝杆菌对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的影响及机制研究

[学位论文] 姜晓红广西医科大学 2015年博士导师: 李超乾共289页

摘要 : 目的:研究母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的防治作用，探讨其作用机制。方法:予OVA致敏制作Balb/c哮喘模型、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)滴鼻制作RSV感染模型，分别于模型制作前后予母牛分枝杆... 展开目的:研究母牛分枝杆菌雾化吸入对小鼠哮喘模型及呼吸道合胞病毒感染的防治作用，探讨其作用机制。方法:予OVA致敏制作Balb/c哮喘模型、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)滴鼻制作RSV感染模型，分别于模型制作前后予母牛分枝杆菌（商品名:微卡）雾化或腹腔注射。哮喘预防组于哮喘模型制作前1个月分别予微卡雾化或腹腔注射，哮喘模型制作成功后处死小鼠;哮喘治疗组于哮喘模型制成后雾化吸入微卡，分别于治疗前、治疗3天、治疗5天处死小鼠;RSV感染预防组分别从量—效关系和时—效关系研究，时—效关系于RSV感染模型制作前1个月或1周分别予微卡雾化吸入或腹腔注射，用106PFU RSV感染制作病毒感染模型。量—效关系于RSV感染模型制作前1周分别用1支或3支微卡雾化吸入，分别用106PFU和105PFURSV感染制作病毒感染模型。感染后第4天处死小鼠;RSV感染治疗组于RSV感染后第1天雾化吸入微卡，治疗第5天处死小鼠。以上各组均设正常对照组和模型对照组。所有小鼠处死前予无创肺功能仪检测气道反应性，哮喘组病理观察气道炎症，ELISA检测BALF中IL-9、OVA-IgE浓度，流式细胞术检测肺γδTCR+CD3+、IL-9+CD3+、IL-10+CD3+、IL-9+γδTCR+、IL-10+δTCR+淋巴细胞百分数，荧光定量PCR法测定肺IL-9R mRNA水平，哮喘预防组同时予免疫组化检测肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达，荧光定量PCR检测肺NGF mRNA水平;病毒组除了以上方法外予电镜、肺免疫荧光法观察肺RSV感染情况，荧光定量PCR检测肺IL9R、PU.1、PD-L2、JAK1、STAT1、STAT5A、RSV、IFN-γ、TLR7、TLR8mRNA水平，免疫组化监测肺EGFR、NF09、Acetylcholine含量。结果:与哮喘对照组相比，哮喘预防组气道反应性均明显下降、气道炎症明显减轻;肺IL-9、OVA-IgE、IL-9R mRNA、NGF mRNA水平明显下降、IL-10水平明显增高;肺BDNF、NF09、Acetylcholine表达明显下降。哮喘治疗组气道炎症明显减轻、肺IL-9水平明显下降、IL-10水平明显增高。RSV预防和治疗组较对照组比较电镜下RSV明显减少、免疫荧光示肺抗RSV明显减弱、RSV mRNA明显下降，机制研究发现微卡干预后IL-9水平明显下降、IL-10水平明显增高;IL-9-JAK1-STAT通路研究结果示JAK1、STAT1、STAT5A水平明显增高;TLR7、TLR8mRNA水平明显增高，PU.1mRNA水平明显降低，肺免疫组化NF09、Acetylcholine、EGFR表达明显下降。以小剂量微卡短期雾化吸入效果最佳。RSV感染治疗组同时发现微卡雾化后肺γδT细胞明显增多，但IL-9+γδT细胞明显减少。结论:实验剂量微卡雾化吸入可用于小鼠哮喘的防治，与其调节Th9细胞、γδT细胞、BDNF、NF09、Acetylcholine有关;实验剂量微卡雾化吸入可用于小鼠RSV感染的防治，与其调节Th9细胞、γδT细胞、IL-9-JAK-STAT通路、TLR7、TLR8、PU.1、神经机制、EGFR等有关。收起

关键词 : 哮喘呼吸道合胞病毒感染雾化吸入母牛分枝杆菌

2. Notch1信号对哮喘小鼠γδT17细胞的作用机制及雾化吸入灭活草分枝杆菌的干预研究

[学位论文] 杨霞广西医科大学 2018年博士导师: 李超乾共132页

摘要 : 本文分为以下几个部分进行探讨：第一部分 γδT17细胞在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义目的：观察γδT17细胞及细胞因子IL-17在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义，并探讨其可能的作用机制。方法：采用随机数字表法将SPF级健康雄性... 展开本文分为以下几个部分进行探讨：第一部分 γδT17细胞在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义目的：观察γδT17细胞及细胞因子IL-17在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义，并探讨其可能的作用机制。方法：采用随机数字表法将SPF级健康雄性Balb/c小鼠随机分为2组，即对照组和哮喘组，每组6只。采用鸡卵清蛋白(OVA)致敏、激发制备哮喘动物模型，对照组予以PBS代替OVA致敏、激发造模。两组小鼠在模型制作成功后12h内使用无创肺功能仪检测小鼠气道反应性情况，24h内迅速处死小鼠并取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。苏木素-伊红染色法(HE)观察小鼠大体支气管肺组织病变、气道炎症细胞浸润、气道黏膜充血水肿等情况;阿辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色下主要观察气道杯状细胞及粘液分泌等情况。收集BALF行细胞分类及计数，并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF上清液中IL-17的分泌水平;流式细胞术(FCM)检测脾细胞悬液中IL-17+占γδT+CD3+淋巴细胞的百分比;实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测肺组织RORγt mRNA的表达。结果：成功复制了哮喘小鼠模型。与对照组比较，哮喘组小鼠气道炎细胞浸润及黏液分泌等显著增加，BALF中嗜酸粒细胞显著增多（P＜0.05），予以不同浓度（6.25mg/ml、12.5mg/ml以及25mg/ml）乙酰甲胆碱(Mch)激发后发现小鼠sRaw的表达显著高于对照组（P＜0.05），表现出明显的气道高反应性;再者，哮喘组小鼠BALF上清液中细胞因子IL-17的分泌、脾细胞悬液中IL-17+占γδT+CD3+淋巴细胞的百分比以及肺组织中RORγtmRNA表达量均出现显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：γδT17细胞通过分泌细胞因子IL-17参与哮喘的气道炎症过程，并在其致病机制中发挥着重要的致炎作用。第二部分 γ分泌酶抑制剂(DAPT)对哮喘小鼠γδT17细胞的调控作用目的：探讨γ分泌酶抑制剂(DAPT)特异性阻断Notch信号通路后对哮喘小鼠γδT17细胞的作用机制。方法：按照随机数字表法将6～8周健康雄性SPF级Balb/c小鼠随机分为3组，即对照组、哮喘组以及DAPT干预组，每组6只。OVA致敏、激发制备哮喘动物模型。DAPT干预组在激发前30min予以γ分泌酶抑制剂(DAPT)雾化吸入。对照组予以PBS代替OVA造模并进行干预处理。各组在模型制作成功后24h内取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。HE染色及AB-PAS染色镜下观察小鼠支气管肺组织炎细胞浸润、杯状细胞增生及气道黏液分泌等情况; ELISA法检测BALF上清液中IL-17的分泌水平;FCM检测脾细胞悬液中IL-17+占γδT+CD3+细胞百分比情况;RT-PCR检测肺组织中ROR γt mRNA的表达情况。同时，借助于免疫磁珠分选技术分选出小鼠脾脏单个核细胞悬液中γδT细胞，FCM检测小鼠γδT细胞分选的纯度;继而在细胞水平予以不同浓度DAPT（5 μmol/L、10 μ mol/L以及20 μ mol/L）进行干预，检测DAPT特异性阻断Notch1信号通路对哮喘小鼠γδ T17细胞比例的影响。结果：(1)体内实验:与哮喘组相比，DAPT干预组小鼠气道炎症、管腔内黏液分泌及杯状细胞增生等情况显著减少，同时，小鼠BALF上清液中IL-17的表达、γδT+ CD3+细胞中IL-17+所占百分比以及肺组织RORγt mRNA的表达均出现明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 (2)体外实验:磁珠分选小鼠脾脏γδT细胞，结果发现与对照组相比，哮喘组γδT+细胞内IL-17+所占百分比显著增高，同时予以不同浓度DAPT干预细胞后γδT17细胞比例出现明显降低(P＜0.05)，并且表现出随着DAPT浓度的增加呈现剂量依赖性的降低。结论：γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch1信号通路后可以在一定程度上缓解哮喘小鼠的气道炎症反应，其作用机制与调控γδ T17细胞的功能有关，对哮喘的免疫靶向治疗具有潜在的治疗价值。第三部分雾化吸入灭活草分支杆菌对哮喘小鼠Notch1信号通路的影响目的：研究雾化吸入灭活草分支杆菌对哮喘小鼠Notch1信号通路的影响，从而探讨其可能的作用机制。方法：随机数字表法将18只SPF级雄性Balb/c小鼠随机分为3组，即对照组、哮喘组以及处理组。采用OVA致敏、激发制备哮喘小鼠模型。处理组在每次激发前30分钟予以雾化吸入灭活草分枝杆菌杆菌，每天1次，连用5天。对照组予以PBS代替OVA造模并进行干预处理。模型制作成功后24h内处死小鼠并取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。HE染色下观察小鼠肺组织大体病变、气道炎症细胞浸润以及气道黏膜充血水肿等情况; AB-PAS染色下主要观察气道杯状细胞及气道粘液分泌等情况;采用ELISA检测BALF上清液中相关细胞因子IL-17、IL-10、IL-4和IFN-γ的分泌情况;流式细胞术检测脾细胞悬液中IL-17+γδ T+CD3+淋巴细胞百分数;RT-PCR及免疫组织化学法(IHC)检测肺组织Notch1 mRNA和蛋白的表达情况;Western Blot检测肺组织NICD蛋白的表达情况。结果：予以雾化吸入灭活草分支杆菌干预处理后，与哮喘组小鼠比较，发现处理组小鼠气道炎症及气道黏液分泌等情况明显减轻;同时，γδ T17细胞比例及相关细胞因子IL-17的表达显著降低（P＜0.05）;再者，小鼠肺组织内Notch1受体mRNA及蛋白的表达亦存在显著差异(P＜0.05)。结论：Notch1受体mRNA及蛋白的表达在哮喘小鼠肺组织内表达显著增高，提示Notch信号与哮喘的发生发展过程密切相关，其机制可能与其调控γδ T17细胞分泌细胞因子有关;雾化吸入灭活草分枝杆菌可以通过调控Notch1信号通路来影响γδT17细胞及相关细胞因子IL-17的分泌，从而减轻哮喘小鼠气道炎症反应。收起

关键词 : 支气管哮喘 &gamma &delta T17细胞 Notch1信号通路灭活草分枝杆菌雾化吸入

3. 灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘气道炎症和Vγ1+、Vγ4+γδT细胞亚群的影响

[学位论文] 张景鸿广西医科大学 2012年博士导师: 李超乾共131页

摘要 : 第一部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的影响目的:探讨雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响。方法:将50只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:正... 展开第一部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的影响目的:探讨雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响。方法:将50只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:正常对照组(A)、哮喘模型组(B0、B3、B4、B5)、治疗组(C0、C3、C4、C5)、预防组(D)。用卵清蛋白(OVA)致敏和激发制成小鼠支气管哮喘模型。C组在卵蛋白激发后给予雾化吸入草分枝杆菌治疗，一天一次，C3、C4、C5分别治疗3天、4天、5天，D组在每次OVA激发前给予草分枝杆菌雾化吸入，一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。肺组织进行病理HE染色、AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况，并行病理半定量分析。BALF离心后行炎症细胞计数，计算细胞总数及分类计数;酶联免疫吸附法检测BALF上清液中IL-4、IL-10、IFN-γ水平。采用SPSS17.0软件统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法，病理半定量结果采用非参数秩和检验。结果:BALF中IL-4值治疗4天组（15.35±3.53）、5天组（14.48±4.21）、预防组(14.60±2.89)，分别较同期模型组（分别是28.41±4.45，30.52±3.57，26.81±3.59）减少(P＜0.01)，IL-10值治疗4天组（70.00±6.28）、5天组（70.72±5.40）、预防组（71.36±6.46）较同期模型组（分别是46.53±4.41，45.47±4.14，47.68±4.47）增加(P＜0.01)，IFN-γ值治疗4天组（243.80±58.78）、5天组（248.40±62.53）、预防组（259.00±43.29）较同期模型组（分别是166.20±54.25，157.20±51.74，175.20±55.35）增加（P＜0.05），BALF中嗜酸性粒细胞比例低于模型组，治疗5天组、预防组气道炎症病变均较模型组减轻，病理半定量结果差异有显著性(P＜0.05）。结论:雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症，其效应与调节细胞因子分泌有关。第二部分灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘小鼠γδT细胞功能和Vγl+，Vγ4+γδT细胞亚群的影响目的：观察雾化吸入灭活草分枝杆菌对哮喘小鼠气道炎症和γδT细胞功能的影响，探讨草分枝杆菌治疗哮喘与γδT细胞分泌细胞因子和Vγl+，Vγ4+γδT细胞亚群的关系。方法：雄性Balb/c小鼠随机分为3组，每组6只，分别为:空白对照组(A)，哮喘模型组(B)，治疗组©。OVA致敏激发制备支气管哮喘模型，C组予以草分枝杆菌雾化吸入治疗5天。治疗结束24小时内处死小鼠，收集肺组织标本。病理HE染色观察肺部及气道炎症状况。免疫组化染色检测肺内协TCR表达以了解肺内协T细胞分布。流式细胞学检协T细胞胞内细胞因子IL-10和IFN-y。荧光定量PCR检测肺内Vγl mRNA，Vγ4 mRNA表达量。结果：治疗组小鼠气道炎症较模型组明显减轻;IL-lO+γδT细胞，IFN-γδT细胞比模型组增加，有统计学差异(P<0.05);治疗组小鼠肺组织Vγ4 mRNA表达量较模型组增加，Vγ1 mRNA表达量较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：雾化吸入灭活草分枝杆菌能调节γδT细胞功能和Vγl+,Vγ4+γδT细胞亚群数量，其减轻哮喘气道炎症的作用可能与调析γδT细胞功能和亚群比例有关。第三部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对TOLL样受体2表达的影响目的:研究雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响，探讨TOLL样受体2(TLR2)表达在雾化吸入灭活草分支杆菌防治支气管哮喘中的作用。方法:将24只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为3组，每组8只:正常对照组(A)、哮喘模型组(B)、干预组©。卵清蛋白(OVA)致敏制成小鼠支气管哮喘模型。C组在每次卵蛋白激发前给予雾化吸入草分枝杆菌治疗，一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液((BALF)。进行病理HE染色、一AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况，并行半定量分析。BALF中炎症细胞计数，检测BALF中IL-4，IL-10，IFN-γ水平。实时定量PCR检测肺组织TLR2 mRNA表达水平。结果：干预组BALF中IL-4分泌减少，IL-10，IFN-γ增加(P＜0.05)，BALE中嗜酸性粒细胞比例低于模型组，气道炎症病变较模型组减轻，肺组织TLR2 mRNA表达水平较模型组显著升高(P＜0.05)。结论：雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症，其效应与调节肺内细胞因子分泌有关。草分枝杆菌可能通过上调TLR2基因的表达调节支气管哮喘的免疫失衡。收起

关键词 : 支气管哮喘灭活草分枝杆菌雾化吸入气道炎症细胞因子免疫失衡

4. 甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠糖皮质激素受体及高迁移率族蛋白1表达的影响

[学位论文] 张剑锋广西医科大学 2010年博士导师: 李超乾共113页

摘要 : 第一部分甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织糖皮质激素受体及核因子κB表达的影响目的：观察甘草酸二铵(GL)对急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织核因子κB(NF-κB)、糖皮质激素受体(GR)表达的调控作用及对血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL... 展开第一部分甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织糖皮质激素受体及核因子κB表达的影响目的：观察甘草酸二铵(GL)对急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织核因子κB(NF-κB)、糖皮质激素受体(GR)表达的调控作用及对血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)表达的影响。方法：将54只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组、ALI模型组、GL干预组、地塞米松干预组、ALI受体阻断组和GL干预受体阻断组。各组动物造成失血性休克，ALI模型组、GL干预组和地塞米松干预组分别给予内毒素(LPS)2mg/kg腹腔注射；LPS注射前1h，GL干预组和地塞米松干预组分别给予GL20mg/kg或地塞米松2mg/kg腹腔注射。ALI受体阻断组和GL干预受体阻断组则在内毒素注射前1h按20mg/kg肌肉注射受体阻断剂RU486。观察6h后各组大鼠肺组织病理，测定肺湿干比(W/D)、PaO2，并采用逆转录-PCR反应检测肺组织NF-κBmRNA、GRmRNA的表达，westernblot法测定肺组织NF-κB及GR蛋白的表达，ELISA法测定血清TNF-α、IL-10浓度，免疫组化法检测肺组织NF-κB、TNF-α、IL-10的表达。采用SPSS13.0软件进行统计学分析，各组间均数比较采用单因素方差分析，均数两两比较采用q检验。结果：(1)ALI模型组TNF-α为(153.67±20.44)ng/L，明显高于假手术组[(43.98±7.52)ng/L](q=27.68，p＜0.01)、HLGR组[(102.53±8.41)ng/L](q=12.36，p＜0.01)和GL干预组[(87.20±7.55)ng/L](q=17.33，p＜0.01)。ALI模型组IL-10为(42.45±6.85)ng/L，明显高于假手术组[(24.75±8.04)ng/L](q=7.15，p＜0.01)，但低于GL干预组[(58.30±9.65)mg/L](q=6.13，p＜0.05)和HLGR组[(56.88±5.36)ng/L](q=5.76，p＜0.05)。(2)ALI模型组NF-κBmRNA和蛋白的表达水平[分别为(3.418±0.527)和(277.7±22.1)]明显高于假手术组[分别为(0.437±0.087)和(45.7±7.2)](q值分别为26.56和77.35，均p＜0.01)，而GRmRNA和蛋白的表达[分别为(0.157±0.029)和(13.5±2.3)]则明显低于假手术组[分别为(0.434±0.014)和(56.6±6.3)](q值分别为7.78和31.27，均p＜0.01)；GL干预组NF-κBmRNA和蛋白的表达水平[分别为(1.892±0.277)和(110.3±11.5)]明显低于ALI模型组(q值分别为14.16和44.19，均p＜0.01)，GRmRNA和蛋白的表达[分别为(0.306±0.035)和(24.3±4.8)]则明显高于ALI模型组(q值分别为4.42和11.86，分别p＜0.05，p＜0.01)；受体阻断后，ALIR组NF-κBmRNA表达进一步增高[(4.412±0.508)](q=37.15，p＜0.01)，而采用GLY干预后，HLGR组NF-κBmRNA显著下降[(2.142±0.217)](q=11.51，p＜0.01)。(3)ALI模型组大鼠肺组织NF-κB、TNF-α、IL-10表达均有增高，GL干预后，NF-κB、TNF-α表达显著减少，而IL-10表达进一步增高；(4)ALI模型组肺组织出现充血、水肿、中性粒细胞浸润，GL干预组肺部炎症较ALI模型组减轻。结论：甘草酸二铵可能通过下调NF-κB的表达，同时提高GR的表达，进而调节炎症因子TNF-α及抗炎介质IL-10的表达，从而起到减轻ALI的作用。第二部分甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织HMGB1mRNA、TGF-β1mRNA表达的影响目的：观察甘草酸二铵(GL)对急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)表达的调控作用及对血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)表达的影响。方法：将42只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组、ALI模型组、GL干预组和地塞米松干预组。各组动物造成失血性休克，ALI模型组、GL干预组和地塞米松干预组分别给予内毒素(LPS)2mg/kg腹腔注射；LPS注射前1h，GL干预组和地塞米松干预组分别给予GL20mg/kg或地塞米松2mg/kg腹腔注射。观察24h后各组大鼠肺组织病理，测定肺湿干比(W/D)、Pa02，并采用逆转录-PCR反应检测肺组织TGF-β1mRNA、HMGB1mRNA的表达，ELISA法测定血清及肺泡灌洗液TNF-α、IL-10、TGF-β1浓度。结果：(1)ALI模型组TNF-α为(84.52±12.78)ng/L，明显高于假手术组[(41.89±7.25)ng/L](q=17.20，p＜0.01)和GL干预组[(65.13±6.64)ng/L](q=7.52，p＜0.01)。ALI模型组IL-10为(53.43±6.94)ng/L，明显高于假手术组[(26.57±6.40)ng/L](q=11.07，p＜0.01)，但低于GL干预组水平[(65.40±10.46)ng/L](q=5.64，p＜0.05)；ALI模型组TGF-β1为(366.02±18.84)ng/L，明显高于假手术组[(150.95±14.51)ng/L](q=27.02，p＜0.01)和GL干预组[(221.28±17.91)ng/L](q=13.25，p＜0.01)。(2)ALI模型组TGF-β1mRNA、HMGB1mRNA的表达水平[分别为(1.852±0.229)和(2.622±0.387)]明显高于假手术组[分别为(0.536±0.118)和(0.332±0.013)](q值分别为10.04和17.29,均p＜0.01)和GL干预组[分别为(1.207±0.251)和(1.477±0.166)](q值分别为4.28和7.85，p＜0.05和p＜0.01)。(3)ALI模型组肺组织出现充血、水肿、中性粒细胞浸润，GL干预组肺部炎症较ALI模型组减轻。结论：甘草酸二铵可能通过抑制TGF-β1mRNA、HMGB1mRNA及TNF-α的表达，同时增强抗炎介质IL-10的表达，从而起到减轻ALI的作用。收起

关键词 : 急性肺损伤甘草酸二铵转化生长因子&beta 1 高迁移率族蛋白1 细胞因子糖皮质激素受体

5. 过继免疫γδT细胞和雾化吸入母牛分枝杆菌对哮喘小鼠气道炎症和细胞因子的影响

[学位论文] 陈晓菊广西医科大学 2019年博士导师: 李超乾共102页

摘要 : 本文主要从以下几方面进行论述：第一部分雾化吸入注射用母牛分枝杆菌调控γδT细胞对哮喘小鼠的影响目的:通过提取经雾化吸入注射用母牛分枝杆菌干预的TCR-β-/-小鼠的γδT细胞过继免疫治疗哮喘小鼠，探讨注射用母牛分枝杆菌是否通过调... 展开本文主要从以下几方面进行论述：第一部分雾化吸入注射用母牛分枝杆菌调控γδT细胞对哮喘小鼠的影响目的:通过提取经雾化吸入注射用母牛分枝杆菌干预的TCR-β-/-小鼠的γδT细胞过继免疫治疗哮喘小鼠，探讨注射用母牛分枝杆菌是否通过调控γδT细胞影响哮喘小鼠的气道炎症及影响下游细胞因子IL-4、IFN-γ。方法:按随机数字表法将40只雄性Balb/c小鼠分为4组:正常组(A)、哮喘组(B)、哮喘治疗对照组(C)和哮喘治疗干预组(D)。（TCR-β-/-小鼠分为对照组和治疗干预组:治疗干预组每天1次，连续5天雾化吸入注射用母牛分枝杆菌。对照组予雾化吸入生理盐水10ml。末次取脾，分离γδT细胞悬液鼠尾静脉注射到BALB/C雄性小鼠体内，得到哮喘治疗对照组(C)、哮喘治疗干预组(D)。)模型组和治疗对照组、治疗干预组各组均经卵清蛋白(OVA)致敏和激发制成小鼠支气管哮喘模型。C、D组激发后给予尾静脉注射提取的经雾化吸入生理盐水干预和雾化吸入注射用母牛分枝杆菌干预γδT细胞，每天一次到激发结束。采用肺功能仪检查各组小鼠肺功能后处死提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。病理HE染色观察肺组织支气管肺炎症。离心BALF行炎症细胞计数;BALF中IFN-γ和IL-4表达水平用ELISA法检测;肺组织单个核细胞IL-4、IFN-γ占γδT细胞百分比用流式细胞术检测。结果:哮喘组小鼠气道反应性均高于正常组小鼠，哮喘组小鼠气道反应性均高于哮喘治疗对照组和治疗干预组。哮喘治疗干预组小鼠气道炎症病变较哮喘治疗对照组减轻。ELISA结果显示，哮喘组BALF中IL-4水平与正常组相比明显升高，而IFN-γ水平较之明显降低;哮喘治疗对照组与治疗干预组BALF中IL-4水平与哮喘组相比明显降低，而IFN-γ水平教之升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。流式细胞术结果显示:哮喘组小鼠γδT淋巴细胞分泌的IL-4与正常组相比明显增高，IFN-γ明显降低，显示向Th2细胞分化的特征，差异具有统计学意义(p＜0.05)。哮喘治疗对照组与治疗干预组小鼠肺内的γδT细胞分泌IL-4与哮喘组对比明显减低，IFN-γ明显增高，显示向Th1细胞分化的特征，差异均有统计学意义(p＜0.05)。结论:雾化吸入母牛分枝杆菌可以减轻OVA致敏引起的Th2优势免疫应答，调节哮喘Th1/Th2免疫失衡。雾化吸入注射用母牛分枝杆菌通过调控γδT细胞影响哮喘小鼠的气道炎症反应，其效应与调节细胞因子分泌有关。第二部分过继免疫γδT细胞对哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子的影响目的:通过鼠尾静脉过继免疫γδT细胞干预哮喘小鼠模型，探讨过继免疫γδT细胞对哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-18的影响。方法:按随机数字表法将24只雄性Balb/c小鼠分为3组:正常组(A)、哮喘组(B)、哮喘治疗组(C)，每组8只。制成小鼠支气管哮喘模型(卵清蛋白(OVA)致敏和激发）。C组激发后给予鼠尾静脉过继免疫γδT细胞治疗，每天一次到激发结束。采用肺功能仪检查各组小鼠肺功能后处死提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。病理HE染色观察肺组织支气管肺炎症。离心BALF行炎症细胞计数;检测各组小鼠BALF中IL-1β、IL-18、IL-4和IFN-γ表达水平采用酶联免疫吸附(ELISA)实验;肺组织单个核细胞IL-4、IFN-γ占γδT细胞百分比采用流式细胞术检测。结果:哮喘组小鼠气道反应性均高于正常组小鼠，哮喘组小鼠气道反应性高于哮喘治疗组。哮喘治疗组小鼠气道炎症病变较哮喘组减轻。ELISA结果显示，哮喘组BALF中IFN-γ水平与正常组相比明显降低，而BALF中IL-1β、IL-4和IL-18水平与正常组相比明显升高;哮喘治疗组BALF中IFN-γ水平与哮喘组相比明显升高，而BALF中IL-1β、IL-4和IL-18水平与哮喘组相比明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。流式细胞术结果显示:哮喘组小鼠γδT淋巴细胞分泌的IFN-γ与正常组对比明显降低，IL-4明显增高，显示向Th2细胞分化的特征，差异具有统计学意义(p＜0.05)。哮喘治疗组小鼠肺内的γδT细胞分泌IFN-γ与哮喘组对比明显增高，IL-4明显减低，显示向Th1细胞分化的特征，差异均有统计学意义(p＜0.05)。结论:鼠尾静脉过继免疫γδT细胞能减轻哮喘小鼠气道炎症，降低IL-1β、IL-4和IL-18水平，升高IFN-γ水平，减轻OVA致敏引起的Th2优势免疫应答。第三部分雾化吸入注射用母牛分枝杆菌对哮喘小鼠NLRP3炎症小体及IL-1β和IL-18的影响目的:观察雾化吸入注射用母牛分枝杆菌对哮喘小鼠外周血中单个核细胞中NLRP3炎症小体表达水平及血清中下游因子白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)水平变化，探讨雾化吸入注射用母牛分枝杆菌对哮喘小鼠NLRP3炎症小体及血清中IL-1β和IL-18的影响。方法:按随机数字表法将40只雄性Balb/c小鼠分为4组:正常组(A)、哮喘组(B)、哮喘治疗组(C)和哮喘干预组(D)。制成小鼠支气管哮喘模型(卵清蛋白(OVA)致敏和激发）。C组激发后给予雾化吸入注射用母牛分枝杆菌，每天一次。D组激发前给予注射用母牛分枝杆菌雾化吸入，每天一次。采用肺功能仪检查各组小鼠肺功能后处死提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。病理HE染色观察肺组织支气管肺炎症。离心BALF行炎症细胞计数;检测各组小鼠外周血单个核细胞中NLRP3用实时荧光定量PCR法。检测各组小鼠血清中IL-1β和IL-18水平用酶联免疫吸附(ELISA)实验。结果:哮喘组小鼠气道反应性均高于正常组小鼠，哮喘组小鼠气道反应性均高于小鼠哮喘治疗组和干预组。哮喘组小鼠外周血单个核细胞中NLRP3、血清中IL-1β和IL-18水平均高于正常组小鼠(P＜0.01);哮喘组小鼠外周血单个核细胞中NLRP3及血清中IL-1β和IL-18水平均高于小鼠哮喘模型治疗组和干预组(P＜0.05)。结论:哮喘小鼠外周血NLRP3炎症小体及下游因子IL-1β和IL-18水平升高，NLRP3炎症小体通路可能促进了哮喘的发病过程。雾化吸入注射用母牛分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症，其效应与调节NLRP3炎症小体及血清中IL-1β和IL-18有关。收起

关键词 : 哮喘过继免疫 &gamma &delta T细胞雾化吸入母牛分枝杆菌气道炎症细胞因子

6. miR-29c靶向NASP对肺癌A549细胞凋亡和自噬的影响

[学位论文] 王方炜广西医科大学 2021年硕士导师: 李超乾共99页

摘要 : 目的：探究miR-29c和NASP对肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和自噬的影响。方法：采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测miR-29cmRNA在肺正常上皮细胞（BEAS-2B）和肺腺癌细胞(A549)中的相对表达水平；脂质体转染miR-29c过表达序列（miR-2... 展开目的：探究miR-29c和NASP对肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和自噬的影响。方法：采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测miR-29cmRNA在肺正常上皮细胞（BEAS-2B）和肺腺癌细胞(A549)中的相对表达水平；脂质体转染miR-29c过表达序列（miR-29cmimics）后，通过CCK8实验检测过表达miR-29c对A549细胞增殖的影响；通过Transwell实验检测miR-29c对A549细胞迁移、侵袭能力的影响；通过流式法检测miR-29c对A549细胞凋亡率的影响；定量分析过表达miR-29c凋亡、自噬相关蛋白（LC3BⅡ、beclin1、p62、bax、bcl-2、caspase-3）表达量的影响。通过生物信息学软件TargetScan分析推测miR-29c的靶基因；构建野生和突变型的NASP3’-UTR的重组质粒，通过双荧光素酶报告验证miR-29c的靶基因；通过Westernblot实验检测miR-29c过表达后NASP的表达。采用慢病毒载体构建稳定干扰NASP的细胞株A549后，通过CCK8实验检测沉默NASP对肺癌A549细胞增殖的影响，通过Transwell实验检测沉默NASP对肺癌A549细胞迁移、侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测沉默NASP对肺癌A549细胞凋亡率的影响；定量分析沉默NASP凋亡、自噬相关蛋白（LC3BⅡ、beclin1、p62、bax、bcl-2、caspase-3）表达量的影响。通过Westernblot检测miR-29c模拟物与过表达NASP或miR-29c模拟物与NASP阴性对照共转染对NASP表达水平的影响。通过CCK8时间检测恢复NASP的表达量对肺腺癌A549细胞增殖活性的影响。通过Transwell实验检测恢复NASP的表达量对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭的影响；通过流式细胞术检测恢复NASP的表达量对肺腺癌A549细胞对肺癌A549细胞凋亡率的影响；定量分析恢复NASP的表达量对肺腺癌A549细胞对肺癌A549细胞凋亡、自噬相关蛋白（LC3BⅡ、beclin1、p62、bax、bcl-2、caspase-3）表达量的影响。结果：相比于肺正常上皮细胞（BEAS-2B），肺腺癌细胞(A549)中miR-29c的表达水平显著下调。miR-29c过表达抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力，miR-29c过表达可提高肺癌细胞A549细胞的凋亡率，miR-29c过表达抑制肺癌细胞A549中LC3BⅡ/Ⅰ、beclin1蛋白水平，增加caspase-3蛋白水平，抑制bcl-2蛋白水平。生物信息学预测显示NASP为miR-29c的靶基因；双荧光素酶证实NASP与miR-29c有靶向关系；miR-29c过表达可以抑制肺癌A549细胞中NASP的表达。沉默NASP抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力；沉默NASP可提高肺癌细胞A549细胞的凋亡率；沉默NASP抑制肺癌细胞A549中LC3BⅡ/Ⅰ、beclin1蛋白水平，增加p63蛋白水平，增加bax蛋白水平，抑制bcl-2蛋白水平。过表达NASP和miR-29c共转染显著增加A549细胞中NASP蛋白表达量，恢复NASP表达量显著逆转miR-29c对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭、自噬的抑制作用和对凋亡的促进作用。结论：miR-29c在肺癌A549细胞中表达量下调，miR-29c过表达可以抑制肺癌A549细胞增殖迁移、侵袭、自噬，并且促进其凋亡。NASP为miR-29c的直接靶位基因。NASP沉默后可可以抑制肺癌A549细胞增殖迁移、侵袭、自噬，并且促进其凋亡。而miR-29c通过调节NASP可发挥其对肺癌A549细胞恶性生物学特性的抑制作用。收起

关键词 : 肺癌病理机制微小核糖核酸-29c NASP蛋白 A549细胞细胞凋亡细胞自噬

7. 赛乐西帕对ARDS的作用及其机制研究

[学位论文] 陈洪流广西医科大学 2021年博士导师: 李超乾共99页

摘要 : 背景和目的: 各种致病因素导致机体的损伤可诱导炎症反应的产生，过度炎症反应可引起肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的受损，从而导致以弥漫性肺间质和肺泡水肿为主要特征的急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的发生... 展开背景和目的: 各种致病因素导致机体的损伤可诱导炎症反应的产生，过度炎症反应可引起肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的受损，从而导致以弥漫性肺间质和肺泡水肿为主要特征的急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的发生。以往的研究表明血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)/前列环素(Prostacyclin，PGI2)失衡与ARDS的发生、发展密切相关，PGI2在ARDS发生时代偿性、反应性增高，以拮抗TXA2的不良作用。TXA2和PGI2的半衰期仅为数分钟，化学性质非常不稳定，在体内被迅速分解为血栓素B2(ThromboxaneB2，TXB2)和6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）。PGI2及其类似物如贝前列腺素、伊洛前列腺素在急性肺损伤实验中显示出抗炎和内皮依赖性抗水肿作用。赛乐西帕(selexipag)是一种选择性前列环素IP受体激动剂，于2015年12月作为肺动脉高压治疗新药在美国上市。近年的研究发现赛乐西帕具有抗炎、减轻氧化应激、保护血管内皮细胞、抗纤维化等作用。本研究旨在探讨赛乐西帕对ARDS的作用及其机制。第一部分探讨ARDS患者血浆ESM-1、TXB2/6-keto-PGF1α的变化及其意义;第二部分建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠ARDS模型，探讨赛乐西帕是否对ARDS有保护作用，以及潜在的作用机制;第三部分探讨赛乐西帕对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用并了解其对SOCS3/STAT3、RhoA/ROCK1信号通路的影响。方法: 第一部分: 收集广西医科大学第一附属医院EICU收治的32例ARDS患者临床资料，内容包括年龄、性别、病因，确诊ARDS24小时内急性生理和慢性健康评分Ⅱ(AcutephysiologyandchronichealthevaluationⅡ,APACHEⅡ)、血管外肺水指数（extravascularlungwaterindex，EVLWI）、白细胞(whitebloodcell，WBC)、血清白蛋白(albumin，Alb)、D-二聚体、降钙素原(Procalcitonin，PCT)、血气分析等，并记录患者转归（以入院28天为研究终点）;检测健康体检者和患者（确诊ARDS24小时内）血浆ESM-1、TXB2、6-keto-PGF1α水平;分析评估影响ARDS患者预后的因素。第二部分: 小鼠ARDS模型构建:腹腔注射LPS;实验分组:对照组、LPS组、LPS+低剂量赛乐西帕预防给药组、LPS+高剂量赛乐西帕预防给药组;实验内容:①比较各组小鼠死亡率。②小鼠HE染色及肺损伤评分。③小鼠肺渗漏指标检测:肺W/D比、肺泡灌洗液蛋白含量、肺组织伊文思蓝(EvansBlue)含量。④小鼠炎症因子检测:ELISA检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织匀浆IL-1β、MCP-1、IL-6水平。⑤小鼠肺血管内皮损伤和内皮屏障功能检测:RT-PCR检测肺组织E-selectin、VCAM-1mRNA表达，Westernblotting检测肺组织VE-cadherin、ZO-1表达。⑥赛乐西帕保护ARDS小鼠的可能机制:ELISA检测小鼠肺组织匀浆cAMP水平，Westernblotting检测肺组织p-PKA、PKA以及Epac1表达。第三部分: 利用LPS诱导HUVECs细胞，观察赛乐西帕预防给药对HUVECs细胞的影响。实验分为以下几个部分:①MTT检测HUVECs细胞活力:单独给予不同剂量LPS、赛乐西帕刺激HUVECs细胞，确定适宜的LPS和赛乐西帕干预浓度。观察赛乐西帕对LPS诱导的HUVECs细胞活力的影响。②将HUVECs细胞分为四组:Control组（对照组）、LPS组（模型组）、LPS+低剂量赛乐西帕预防给药组、LPS+高剂量赛乐西帕预防给药组，分别进行以下实验:A.利用Transwell小室、异硫氰酸荧光素-葡聚糖检测HUVECs通透性。B.ELISA检测各组HUVECs分泌的IL-1β、IL-6水平。C.ELISA检测各组HUVECs细胞内cAMP水平。D.免疫荧光、westernblotting检测各组HUVECs细胞VE-cadherin、β-catenin、ZO-1，claudin-1蛋白的表达。③探讨赛乐西帕保护LPS诱导的HUVECs细胞的可能机制。实验分组:对照组、LPS组、LPS+赛乐西帕组、LPS+赛乐西帕+ESI-09（Epac抑制剂）组或LPS+赛乐西帕+H89(PKA抑制剂)组。westernblotting检测各组HUVECs细胞Epac1、PKA、SOCS3/STAT3、RhoA/ROCK1蛋白的表达情况。结果第一部分: ARDS患者血浆TXB2、6-keto-PGF1α、ESM-1水平以及TXB2/6-keto-PGF1α比值均高于健康体检者，差异有统计学意义。纳入研究的32例ARDS患者19例存活，13例死亡。两组间性别、年龄无明显差异，死亡组APACHEⅡ评分、EVLWI高于存活组。WBC、Alb、TXB2、6keto-PGF1α水平两组间比较无显著差异。死亡组PCT、ESM-1、D-二聚体水平、TXB2/6-keto-PGF1α比值高于存活组。ESM-1与TXB2/6-keto-PGF1α、EVLWI正相关。第二部分: 赛乐西帕预防给药减少小鼠死亡率;减轻脂多糖导致的ARDS小鼠肺组织病理损伤和肺组织渗漏;减少脂多糖刺激的炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1水平;减少脂多糖诱导的E-selectin、VCAM-1mRNA表达;增加连接蛋白ZO-1、VE-cadherin表达;增加肺组织cAMP水平，上调肺组织p-PKA、Epac1蛋白表达。第三部分; 10μg/ml及以上浓度的LPS刺激可引起HUVECs细胞增殖活力下降，浓度10、20μg/ml赛乐西帕预处理可增强LPS抑制的HUVECs细胞增殖活力;LPS干预6小时，HUVECs通透性明显增高，赛乐西帕预处理可降低HUVECs通透性;赛乐西帕抑制LPS诱导的HUVECs分泌炎症因子IL-6、IL-1β，增加LPS抑制的HUVECs连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1、claudin-1表达;LPS诱导HUVECs细胞表达SOCS3、p-STAT3、RhoA-GTP、ROCK1水平上升，c-AMP、Epac1、p-PKA水平下降;赛乐西帕预处理上调c-AMP、Epac1、SOCS3、p-PKA水平，下调p-STAT3、RhoA-GTP、ROCK1蛋白表达水平，给予ESI-09(Epac抑制剂)部分逆转赛乐西帕对SOCS3的上调、p-STAT3的下调，对RhoA-GTP、ROCK1蛋白表达无明显影响，而给予H89（PKA抑制剂）部分逆转赛乐西帕对RhoA-GTP、ROCK1的下调，轻微抑制赛乐西帕对SOCS3的上调、p-STAT3的下调。结论 1.ARDS死亡组患者APACHEⅡ评分、EVLWI，血浆D-二聚体、PCT、ESM-1水平以及TXB2/6-keto-PGF1α比值高于存活组，且ESM-1与TXB2/6-keto-PGF1α、EVLWI正相关。 2.赛乐西帕可能通过上调肺组织cAMP水平，激活下游分子Epac1、p-PKA，发挥抑制炎症反应、减少肺血管内皮细胞损伤、增强肺毛细血管内皮细胞屏障功能等作用减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺损伤。 3.赛乐西帕可能通过上调cAMP水平，激活Epac1/SOCS3/STAT3、PKA/RhoA/ROCK1信号通路减轻炎症反应、增强血管屏障功能，保护LPS对HUVECs的损伤。收起

关键词 : 急性呼吸窘迫综合征赛乐西帕 PKA 炎症反应血管内皮细胞损伤

8. 脑利钠肽在ARDS中的作用及其机制的研究

[学位论文] 林化广西医科大学 2018年博士导师: 李超乾共99页

摘要 : 急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由各种致病因素（包括肺内和肺外）所导致的急性弥漫性肺损伤以及进而发展的急性呼吸衰竭，主要病理特征是肺内或全身炎症失控致肺微血管通透性增高，肺泡渗出富含蛋白质的液体，进... 展开急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由各种致病因素（包括肺内和肺外）所导致的急性弥漫性肺损伤以及进而发展的急性呼吸衰竭，主要病理特征是肺内或全身炎症失控致肺微血管通透性增高，肺泡渗出富含蛋白质的液体，进而肺水肿及透明膜形成，常伴肺泡出血。已有研究发现，ARDS患者血清氨基末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptid，NT-proBNP)明显升高，由于NT-proBNP与脑利钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)是等摩尔分泌的，NT-proBNP水平的升高在一定程度上可以反映BNP的升高。近年来越来越多的研究发现，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在ARDS的发生发展过程中发挥着重要的作用，而BNP是RAS的天然拮抗剂。首先研究ARDS患者血清NT-proBNP水平改变及其意义，并通过建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介导的大鼠ARDS模型，探讨重组人脑利钠肽(recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP)对ARDS大鼠的干预作用及其机制。目的：探讨ARDS患者血清NT-proBNP水平改变及其意义，并进一步研究rhBNP对LPS介导的ARDS大鼠的干预作用及其机制。方法：第一部分：选取36名入住广西中医药大学第一附属医院ICU的ARDS患者。以患者入住综合ICU作为研究起点，入院28天内患者痊愈好转出院、转出ICU或死亡作为研究终点，剔除放弃治疗或自动出院的病例。根据转归将ARDS患者分为存活组和死亡组。各组患者入住ICU后行脉搏指示性连续心输出量(pulse-indicated continuous cardiac output，PICCO)监测血流动力学，记录各组患者入住ICU时，入住ICU24h，入住ICU24h时的血管外肺水指数(extravascular lung water index，EVLWI)，肺血管通透性指数(pulmonary vascular permeability index，PVPI)值。检测各组患者入住ICU时，入住ICU24h，入住ICU24h时的血清NT-proBNP、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)。同时检测各组患者入住ICU时的血气分析。比较存活组和死亡组患者NT-proBNP，CRP，EVLWI及PVPI，并采用双变量Pearson相关分析法分析NT-proBNP与氧合指数(oxygenation index，OI)、CRP和EVLWI的相关性。第二部分：利用腹腔注射LPS复制ARDS大鼠模型，观察不同剂量的rhBNP对ARDS大鼠6h及12h生存率以及肺组织湿/干重比的影响。分别利用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)及电镜观察不同剂量的rhBNP对ARDS大鼠肺组织病理改变以及超微结构改变的影响。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测不同剂量的rhBNP对ARDS大鼠肺细胞凋亡的影响。分别采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative-PCR，RT-PCR)及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测不同剂量的rhBNP对ARDS大鼠肺组织炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因及蛋白表达的影响。采用ELISA检测不同剂量的rhBNP对ARDS大鼠肺组织血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)及血管紧张素1-7(Angiotensin1-7，Ang1-7)蛋白水平的影响。采用免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)观察rhBNP对ARDS大鼠肺组织血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE）及血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2，ACE2)蛋白表达的影响。结果：第一部分：各时间点死亡组NT-proBNP水平均显著高于存活组(P＜0.01)，但两组间CRP水平没有显著性差异（P＞0.05）。PICCO监测结果显示，ARDS患者入ICU时EVLWI及PVPI均高于正常;死亡组在入ICU时、入ICU48h时EVLWI均显著高于存活组（P＜0.01，P＜0.01）;死亡组在入ICU48h时PVPI明显高于存活组（P＜0.05）。ARDS患者在入住ICU时血清NT-proBNP水平与OI（r=-0.228，P＞0.05）及血清CRP水平(r=0.085，P＞0.05)均没有直线相关性，但与EVLWI成正相关（r=0.774，P＜0.01）。第二部分：低剂量及高剂量rhBNP均能显著减轻ARDS大鼠肺水肿(P＜0.01，P＜0.01)，降低ARDS大鼠12h病死率(P＜0.05)。HE染色及电镜结果显示，低剂量及高剂量rhBNP均显著改善肺组织的病理损伤。同时，低剂量及高剂量rhBNP均显著降低ARDS大鼠肺细胞的凋亡率（P＜0.01，P＜0.01）。低剂量及高剂量rhBNP不仅可以抑制LPS诱导的ARDS大鼠肺组织炎症因子IL-1β(P＜0.01，P＜0.01)及TNF-α(P＜0.01，P＜0.01)基因的表达，还降低了肺组织匀浆IL-1β(P＜0.01，P＜0.05)及TNF-α(P＜0.01，P＜0.01)蛋白的水平。虽然低剂量及高剂量rhBNP对肺组织IL-6基因表达的影响均没有统计学意义(P＞0.05，P＞0.05)，低剂量rhBNP对肺组织匀浆IL-6蛋白水平的影响也没有统计学意义（P＞0.05），但高剂量rhBNP可以明显降低肺组织匀浆IL-6蛋白的水平(P＜0.05)。尽管低剂量rhBNP对LPS诱导的ARDS大鼠肺组织匀浆AngⅡ及Ang1-7蛋白水平的影响没有统计学意义，但高剂量rhBNP可以明显抑制ARDS大鼠肺组织匀浆AngⅡ蛋白的水平(P＜0.05)，并显著上调Ang1-7蛋白的水平(P＜0.05)。此外，低剂量及高剂量rhBNP均可以显著抑制LPS诱导的ARDS大鼠肺组织ACE蛋白的表达（P＜0.01，P＜0.01），同时明显上调ACE2蛋白的表达(P＜0.05，P＜0.05)。结论： (1)ARDS患者血清NT-proBNP水平与肺水肿程度具有正相关性，早期动态联合监测血清NT-proBNP、EVLWI及PVPI对评估ARDS患者的预后具有一定的价值。 (2)LPS介导的ARDS大鼠存在肺组织RAS的局部稳态失衡，rhBNP能通过调节ARDS大鼠肺组织RAS的局部稳态失衡以改善肺组织的炎症损伤以及肺细胞凋亡，从而减轻ARDS大鼠的肺水肿。收起

关键词 : 重组人脑利钠肽急性呼吸窘迫综合征氨基末端脑钠肽前体抗炎作用

9. NKT细胞在肥胖合并支气管哮喘中作用机制的研究

[学位论文] 陈一平广西医科大学 2015年博士导师: 李超乾共98页

摘要 : 本文主要从以下几方面展开论述：第一部分不同品系小鼠肥胖哮喘模型建立及比较目的:探讨不同品系小鼠营养性肥胖合并哮喘模型特点。方法:选用KM，BALB/c，C57BL/6j三个品系3-4周龄清洁级雌性小鼠，随机分为A组（正常对照组）、B组... 展开本文主要从以下几方面展开论述：第一部分不同品系小鼠肥胖哮喘模型建立及比较目的:探讨不同品系小鼠营养性肥胖合并哮喘模型特点。方法:选用KM，BALB/c，C57BL/6j三个品系3-4周龄清洁级雌性小鼠，随机分为A组（正常对照组）、B组（正常哮喘组）、C组（肥胖组）、D组（肥胖哮喘组），分别以高脂饲料及普通饲料饲喂小鼠12周后，以卵清蛋白(OVA)及磷酸盐缓冲液(PBS)致敏激发小鼠，每周记录各组小鼠身长、体重变化，实验终点测定小鼠体重、身长、脂肪重量、肝脏重量、Lee's指数;全自动生化分析仪测定小鼠血清总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平;酶联免疫吸附法测支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液中OVA特异性IgE浓度。肺及脂肪组织进行病理HE染色，观察各组脂肪细胞形态改变、脂肪细胞横截面积、肺及支气管炎症及气道重塑情况。采用SPSS19.0软件进行统计，采用单因素方差分析进行比较，先行方差齐性检验，两两比较采用LSD检验。结果:与正常饲料喂养的小鼠相比，高脂饲料喂养的KM小鼠，体重、脂肪重量、肝脏重量、脂肪细胞横截面积均明显增加(P＜0.01)，Lee's指数、血清TC水平增加也有显著性差异(P＜0.05);OVA致敏及激发后KM小鼠BALF上清液中OVA特异性IgE浓度无显著性差异(P＞0.05)，肺脏及支气管病理检查中炎症细胞浸润、腺体增生及气道平滑肌、基底膜增厚表现不明显。相同条件饲养的BALB/c小鼠，体重、脂肪重量、肝脏重量、Lee's指数均明显增加(P＜0.01)，脂肪细胞横截面积、血清TC水平增加也有显著性差异(P＜0.05); OVA致敏及激发后BALB/c小鼠出现典型的哮喘发作表现，BALF上清液中OVA特异性IgE浓度增加有显著性差异(P＜0.01)，肺脏及支气管病理检查中炎症细胞浸润、腺体增生及气道平滑肌、基底膜增厚表现最为明显。相同条件饲养的C57BL/6j小鼠体重、脂肪重量、肝脏重量、Lee's指数增加(P＜0.05)较不稳定，脂肪细胞横截面积、血清TC水平无显著性差异(P＞0.05); OVA致敏及激发后C57BL/6j小鼠BALF上清液中OVA特异性IgE浓度有显著性差异(P＜0.05)，肺脏及支气管病理检查中出现炎症细胞浸润、腺体增生表现，但气道平滑肌、基底膜增厚表现不明显。结论:BALB/c小鼠经高脂饲料诱导，OVA致敏激发后能形成良好的肥胖合并哮喘模型，可作为研究肥胖合并哮喘更加合适的模型动物。第二部分 NKT细胞在小鼠肥胖合并支气管哮喘发病中作用机制目的:通过观察肥胖合并哮喘小鼠气道炎症，气道反应性、NKT细胞数量、分泌细胞因子、细胞表面标记和血清细胞因子的变化，初步探讨NKT细胞在肥胖合并哮喘中的作用及机制。方法:雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只，分别为:空白对照组（A组），哮喘模型组（B组），肥胖组（C组），肥胖合并哮喘组（D组）。高脂饲料饲养诱导肥胖模型，OVA致敏激发制备支气管哮喘模型，处死小鼠，收集肝脏及肺组织标本。双室体积描记法测定小鼠特殊气道阻力。病理HE染色观察肺部及气道炎症、气道重塑等表现。ELISA法检测血清IL-4和IFN-γ浓度。流式细胞学检肝脏NKT细胞及CD69+NKT细胞数量、及NKT细胞胞内细胞因子IL-4和IFN-γ表达情况。结果:单纯肥胖组小鼠在低浓度乙酰甲胆碱雾化时表现出明显升高的气道阻力(P＜0.01)，但在中高浓度的乙酰甲胆碱雾化时与正常小鼠相比，气道阻力有增加但无统计学意义(P＞0.05);肥胖合并哮喘组小鼠气道阻力在各浓度乙酰甲胆碱雾化时均表现出于其他各组明显增加的趋势(P＜0.01)，肥胖合并哮喘组表现最为明显。单纯肥胖组小鼠肺脏病理无明显变化。哮喘及肥胖哮喘组小鼠肺脏病理表现出炎症细胞浸润、腺体增生等气道炎症表现，可见气道平滑肌、基底膜增厚表现，以肥胖合并哮喘组小鼠肺部表现最为明显。与正常对照组相比，肥胖组小鼠血清IL-4浓度有升高明显，哮喘组及肥胖哮喘组血清IL-4浓度明显升高，均有显著性差异，以肥胖组血清IL-4浓度最高。与正常对照组相比，肥胖组小鼠血清IFN-γ浓度有降低，有显著性差异(P＜0.05)，哮喘组及肥胖哮喘组血清IFN-γ浓度明显降低，均有显著性差异(P＜0.01)，以肥胖哮喘组血清IFN-γ浓度最低。较之正常对照组，哮喘组小鼠CD1d+NKT细胞百分比、IL-4+NKT细胞百分明显增加， IFN-γ+NKT细胞百分比明显减少;肥胖组小鼠CD1d+NKT细胞百分比及I FN-γ+NKT细胞百分比明显降低，IL-4+NKT细胞百分比明显增加;肥胖哮喘组CD1d+NKT细胞百分比升高最为明显，IL-4+NKT细胞百分比升高，IFN-γ+NKT细胞百分比降低最为明显。各组间CD69+NKT细胞百分比与IFN+NKT细胞变化并不一致。结论:NKT细胞在肥胖、哮喘的过程中通过细胞数目的变化及分泌细胞因子功能的变化，在气道炎症、气道反应性等方面发挥了重要的作用。收起

关键词 : 肥胖支气管哮喘发病机制 NKT细胞炎症反应

10. 重组人脑利钠肽对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护研究

[学位论文] 邓旺生广西医科大学 2020年博士导师: 李超乾共97页

摘要 : 背景：百草枯(paraquat PQ)是一种剧毒除草剂，能引起以急性肺损伤为代表的多脏器损害。临床中发现百草枯中毒患者血NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)可明显升高，其变化特点与原因尚不清楚，如果补充外源性BNP(重组人脑利钠肽,rhBNP)是否能对PQ中毒患者... 展开背景：百草枯(paraquat PQ)是一种剧毒除草剂，能引起以急性肺损伤为代表的多脏器损害。临床中发现百草枯中毒患者血NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)可明显升高，其变化特点与原因尚不清楚，如果补充外源性BNP(重组人脑利钠肽,rhBNP)是否能对PQ中毒患者产生保护性影响尚不清楚。现阶段在临床已有关于补充rhBNP治疗脓毒症相关急性肺损伤的研究并取得一定成效，这为rhBNP治疗百草枯中毒急性肺损伤提供新的研究方向。TLR4/NF-κB信号通路是重要的炎症反应信号通路，可能参与到百草枯中毒急性肺损伤机制，但rhBNP是否参与TLR4/NF-κB信号通路调节有待研究。肺微血管内皮细胞损伤是百草枯中毒的重要基础之一，rhBNP对PQ染毒肺微血管内皮细胞的影响尚不清楚。目的：揭示百草枯中毒大鼠血BNP变化特点；通过生存实验探讨rhBNP早期治疗对百草枯中毒大鼠生存率的影响及合适的给药剂量；探索重组人脑利钠肽对PQ中毒急性肺损伤的保护作用，及是否基于影响TLR4/NF-κB信号通路及相关蛋白表达而发挥保护作用的机制；在细胞层面揭示rhBNP对PQ染毒肺微血管内皮细胞的增殖影响。方法：体内部分第一部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型，大鼠分别随机分为两组：空白对照组(NC)、模型组(PQ组)。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，PQ组予以腹腔注射百草枯20mg/kg，复制肺损伤模型。造模成功后连续观察，在12小时、24小时、3天、7天、14天的时间点，每组分别处死4只老鼠。收集大鼠血清和肺组织。血清行ELISA检测细胞因子BNP、IL-6的浓度，肺组织用于HE染色观察组织病理学改变和测量湿干重比。第二部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型。大鼠分别随机分为四组：空白对照组(NC)、PQ+高剂量rhBNP组，PQ+中剂量rhBNP组，PQ+低剂量rhBNP组。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，其余三组在予以腹腔注射百草枯30mg/kg1h后行腹腔注射不同剂量rhBNP(40ug/kg ， 20ug/kg，10ug/kg 0.5ml)，rhBNP每天1次连续给药7天。连续观察14天。记录大鼠死亡情况计算生存率并行死亡大鼠肺解剖检查。第三部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型。大鼠分别随机分为四组：空白对照组(NC)、PQ组，PQ+rhBN组，PQ+地塞米松组。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，PQ组予以腹腔注射百草枯20mg/kg，其余两组在予以腹腔注射百草枯20mg/kg后，分别1h后行腹腔注射rhBNP(20ug/kg)和地塞米松(25ug/kg)，每组按第1，3，7各时间分别处死大鼠，取血后行ELISA检测血清中IL-6和TNF-α浓度，取肺组织检测湿干比值(W/D)；Western-blot检测肺组织TLR4、NF-κB蛋白的表达和RT-RCR检测肺组织TLR4、NF－κB、TGF-β1mRNA的表达。其余备行于检测肺组织SOD活力、MDA含量测定及HE染色观察病理情况，计算肺组织损伤病理积分。体外实验：以PQ染毒人肺微血管内皮细胞(HPMEC)为体外模型。将细胞分为4组，分别为正常对照组、PQ染毒组(PQ组)、PQ+重组人脑利钠肽治疗组(PQ+rhBNP组)、PQ+地塞米松治疗组(PQ+地米组)。用CCK-8法测定各组细胞增殖指数，ELISA测定细胞上清中IL-6、TNF-α的浓度水平，RT-PCR测定TLR4、NF-κB的mRNA水平结果：体内实验第一部分：PQ中毒大鼠在各时间节点上肺组织的湿干重比均大于对照组，且肺组织病理情况及评分较对照组严重。与对照组相比，PQ组大鼠血清中的细胞因子BNP(脑钠尿肽)、IL-6浓度均明显升高，BNP12小时即可观察到升高，且于第三天达到峰值；IL-6与BNP浓度具有显著的正相关关系。第二部分：通过生存分析发现，中剂量rhBNP(20ug/kg 0.5ml)可改善中毒大鼠生存率(P＜0.05)，而高、低剂量组与对照组相比，生存率差异没有统计学意义。第三部分： 1、HE染色结果显示，对照组：大鼠未见明显异常。PQ组：肺泡内可见炎症细胞浸润和扩张的毛细血管，肺泡结构破坏严重。PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组：大鼠的肺泡结构稍显完整，肺泡内充血和炎性细胞浸润的含量较PQ组也显著减少。与对照组相比，PQ组大鼠肺组织损伤评分上升。与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织损伤评分均偏低。 2、W/D情况:与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组在各时间点大鼠肺W/D值显著高于对照组，而与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺W/D值均低于PQ组。 3、ELISA结果：与对照组相比，各染毒组大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度上升。与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠血清TNF-α和IL-6浓度均降低。 4、MDA含量、SOD活力:与对照组相比,PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组在染毒后肺组织中MDA含量上升、SOD活性降低。与PQ组相比较，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠血清MDA含量均降低、SOD活性均升高。PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组相比无明显差异。 5、RT-PCR结果：与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA的表达水平明显增高。但与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组肺组织中TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表达显著降低。 6、Western-blot结果：与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平显增高。但与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组肺组织中TLR4和NF-κB蛋白表达显著降低，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组两者无明显差异。体外实验 1、与正常组比较，PQ组细胞增殖明显降低，而经过rhBNP干预后，PQ所致的细胞增殖明显改善，rhBNP干预组细胞增殖指数明显高于PQ组细胞。 2、ELISA结果，与正常组比较，PQ组细胞炎症因子IL-6和TNF-α的含量明显增多，而经过rhBNP干预后，PQ所致的炎症因子IL-6和TNF-α的表达明显减小。 3、RT-PCR结果，与正常组比较，PQ组TLR4、NF-κBmRNA表达明显增加，而经过rhBNP干预后，TLR4、NF-κBmRNA表达明显减小。结论： (1)PQ大鼠早期血BNP水平可出现升高。 (2)rhBNP早期治疗可能改善百草枯中毒大鼠生存率。 (3)rhBNP可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路来减缓炎症发生从而改善PQ中毒大鼠肺损伤。收起

关键词 : 百草枯急性肺损伤脑钠肽重组人脑利钠肽 TLR4 NF-&kappa B