摘要: 背景和目的: 各种致病因素导致机体的损伤可诱导炎症反应的产生，过度炎症反应可引起肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的受损，从而导致以弥漫性肺间质和肺泡水肿为主要特征的急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的发生。... 展开 背景和目的: 各种致病因素导致机体的损伤可诱导炎症反应的产生，过度炎症反应可引起肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的受损，从而导致以弥漫性肺间质和肺泡水肿为主要特征的急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的发生。以往的研究表明血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)/前列环素(Prostacyclin，PGI2)失衡与ARDS的发生、发展密切相关，PGI2在ARDS发生时代偿性、反应性增高，以拮抗TXA2的不良作用。TXA2和PGI2的半衰期仅为数分钟，化学性质非常不稳定，在体内被迅速分解为血栓素B2(ThromboxaneB2，TXB2)和6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）。PGI2及其类似物如贝前列腺素、伊洛前列腺素在急性肺损伤实验中显示出抗炎和内皮依赖性抗水肿作用。赛乐西帕(selexipag)是一种选择性前列环素IP受体激动剂，于2015年12月作为肺动脉高压治疗新药在美国上市。近年的研究发现赛乐西帕具有抗炎、减轻氧化应激、保护血管内皮细胞、抗纤维化等作用。本研究旨在探讨赛乐西帕对ARDS的作用及其机制。第一部分探讨ARDS患者血浆ESM-1、TXB2/6-keto-PGF1α的变化及其意义;第二部分建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠ARDS模型，探讨赛乐西帕是否对ARDS有保护作用，以及潜在的作用机制;第三部分探讨赛乐西帕对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用并了解其对SOCS3/STAT3、RhoA/ROCK1信号通路的影响。 方法: 第一部分: 收集广西医科大学第一附属医院EICU收治的32例ARDS患者临床资料，内容包括年龄、性别、病因，确诊ARDS24小时内急性生理和慢性健康评分Ⅱ(AcutephysiologyandchronichealthevaluationⅡ,APACHEⅡ)、血管外肺水指数（extravascularlungwaterindex，EVLWI）、白细胞(whitebloodcell，WBC)、血清白蛋白(albumin，Alb)、D-二聚体、降钙素原(Procalcitonin，PCT)、血气分析等，并记录患者转归（以入院28天为研究终点）;检测健康体检者和患者（确诊ARDS24小时内）血浆ESM-1、TXB2、6-keto-PGF1α水平;分析评估影响ARDS患者预后的因素。 第二部分: 小鼠ARDS模型构建:腹腔注射LPS;实验分组:对照组、LPS组、LPS+低剂量赛乐西帕预防给药组、LPS+高剂量赛乐西帕预防给药组;实验内容:①比较各组小鼠死亡率。②小鼠HE染色及肺损伤评分。③小鼠肺渗漏指标检测:肺W/D比、肺泡灌洗液蛋白含量、肺组织伊文思蓝(EvansBlue)含量。④小鼠炎症因子检测:ELISA检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织匀浆IL-1β、MCP-1、IL-6水平。⑤小鼠肺血管内皮损伤和内皮屏障功能检测:RT-PCR检测肺组织E-selectin、VCAM-1mRNA表达，Westernblotting检测肺组织VE-cadherin、ZO-1表达。⑥赛乐西帕保护ARDS小鼠的可能机制:ELISA检测小鼠肺组织匀浆cAMP水平，Westernblotting检测肺组织p-PKA、PKA以及Epac1表达。 第三部分: 利用LPS诱导HUVECs细胞，观察赛乐西帕预防给药对HUVECs细胞的影响。实验分为以下几个部分:①MTT检测HUVECs细胞活力:单独给予不同剂量LPS、赛乐西帕刺激HUVECs细胞，确定适宜的LPS和赛乐西帕干预浓度。观察赛乐西帕对LPS诱导的HUVECs细胞活力的影响。②将HUVECs细胞分为四组:Control组（对照组）、LPS组（模型组）、LPS+低剂量赛乐西帕预防给药组、LPS+高剂量赛乐西帕预防给药组，分别进行以下实验:A.利用Transwell小室、异硫氰酸荧光素-葡聚糖检测HUVECs通透性。B.ELISA检测各组HUVECs分泌的IL-1β、IL-6水平。C.ELISA检测各组HUVECs细胞内cAMP水平。D.免疫荧光、westernblotting检测各组HUVECs细胞VE-cadherin、β-catenin、ZO-1，claudin-1蛋白的表达。③探讨赛乐西帕保护LPS诱导的HUVECs细胞的可能机制。实验分组:对照组、LPS组、LPS+赛乐西帕组、LPS+赛乐西帕+ESI-09（Epac抑制剂）组或LPS+赛乐西帕+H89(PKA抑制剂)组。westernblotting检测各组HUVECs细胞Epac1、PKA、SOCS3/STAT3、RhoA/ROCK1蛋白的表达情况。 结果 第一部分: ARDS患者血浆TXB2、6-keto-PGF1α、ESM-1水平以及TXB2/6-keto-PGF1α比值均高于健康体检者，差异有统计学意义。纳入研究的32例ARDS患者19例存活，13例死亡。两组间性别、年龄无明显差异，死亡组APACHEⅡ评分、EVLWI高于存活组。WBC、Alb、TXB2、6keto-PGF1α水平两组间比较无显著差异。死亡组PCT、ESM-1、D-二聚体水平、TXB2/6-keto-PGF1α比值高于存活组。ESM-1与TXB2/6-keto-PGF1α、EVLWI正相关。 第二部分: 赛乐西帕预防给药减少小鼠死亡率;减轻脂多糖导致的ARDS小鼠肺组织病理损伤和肺组织渗漏;减少脂多糖刺激的炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1水平;减少脂多糖诱导的E-selectin、VCAM-1mRNA表达;增加连接蛋白ZO-1、VE-cadherin表达;增加肺组织cAMP水平，上调肺组织p-PKA、Epac1蛋白表达。 第三部分; 10μg/ml及以上浓度的LPS刺激可引起HUVECs细胞增殖活力下降，浓度10、20μg/ml赛乐西帕预处理可增强LPS抑制的HUVECs细胞增殖活力;LPS干预6小时，HUVECs通透性明显增高，赛乐西帕预处理可降低HUVECs通透性;赛乐西帕抑制LPS诱导的HUVECs分泌炎症因子IL-6、IL-1β，增加LPS抑制的HUVECs连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1、claudin-1表达;LPS诱导HUVECs细胞表达SOCS3、p-STAT3、RhoA-GTP、ROCK1水平上升，c-AMP、Epac1、p-PKA水平下降;赛乐西帕预处理上调c-AMP、Epac1、SOCS3、p-PKA水平，下调p-STAT3、RhoA-GTP、ROCK1蛋白表达水平，给予ESI-09(Epac抑制剂)部分逆转赛乐西帕对SOCS3的上调、p-STAT3的下调，对RhoA-GTP、ROCK1蛋白表达无明显影响，而给予H89（PKA抑制剂）部分逆转赛乐西帕对RhoA-GTP、ROCK1的下调，轻微抑制赛乐西帕对SOCS3的上调、p-STAT3的下调。 结论 1.ARDS死亡组患者APACHEⅡ评分、EVLWI，血浆D-二聚体、PCT、ESM-1水平以及TXB2/6-keto-PGF1α比值高于存活组，且ESM-1与TXB2/6-keto-PGF1α、EVLWI正相关。 2.赛乐西帕可能通过上调肺组织cAMP水平，激活下游分子Epac1、p-PKA，发挥抑制炎症反应、减少肺血管内皮细胞损伤、增强肺毛细血管内皮细胞屏障功能等作用减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺损伤。 3.赛乐西帕可能通过上调cAMP水平，激活Epac1/SOCS3/STAT3、PKA/RhoA/ROCK1信号通路减轻炎症反应、增强血管屏障功能，保护LPS对HUVECs的损伤。 收起