摘要: 背景：百草枯(paraquat PQ)是一种剧毒除草剂，能引起以急性肺损伤为代表的多脏器损害。临床中发现百草枯中毒患者血NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)可明显升高，其变化特点与原因尚不清楚，如果补充外源性BNP(重组人脑利钠肽,rhBNP)是否能对PQ中毒患者... 展开 背景：百草枯(paraquat PQ)是一种剧毒除草剂，能引起以急性肺损伤为代表的多脏器损害。临床中发现百草枯中毒患者血NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)可明显升高，其变化特点与原因尚不清楚，如果补充外源性BNP(重组人脑利钠肽,rhBNP)是否能对PQ中毒患者产生保护性影响尚不清楚。现阶段在临床已有关于补充rhBNP治疗脓毒症相关急性肺损伤的研究并取得一定成效，这为rhBNP治疗百草枯中毒急性肺损伤提供新的研究方向。TLR4/NF-κB信号通路是重要的炎症反应信号通路，可能参与到百草枯中毒急性肺损伤机制，但rhBNP是否参与TLR4/NF-κB信号通路调节有待研究。肺微血管内皮细胞损伤是百草枯中毒的重要基础之一，rhBNP对PQ染毒肺微血管内皮细胞的影响尚不清楚。 目的：揭示百草枯中毒大鼠血BNP变化特点；通过生存实验探讨rhBNP早期治疗对百草枯中毒大鼠生存率的影响及合适的给药剂量；探索重组人脑利钠肽对PQ中毒急性肺损伤的保护作用，及是否基于影响TLR4/NF-κB信号通路及相关蛋白表达而发挥保护作用的机制；在细胞层面揭示rhBNP对PQ染毒肺微血管内皮细胞的增殖影响。 方法：体内部分 第一部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型，大鼠分别随机分为两组：空白对照组(NC)、模型组(PQ组)。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，PQ组予以腹腔注射百草枯20mg/kg，复制肺损伤模型。造模成功后连续观察，在12小时、24小时、3天、7天、14天的时间点，每组分别处死4只老鼠。收集大鼠血清和肺组织。血清行ELISA检测细胞因子BNP、IL-6的浓度，肺组织用于HE染色观察组织病理学改变和测量湿干重比。 第二部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型。大鼠分别随机分为四组：空白对照组(NC)、PQ+高剂量rhBNP组，PQ+中剂量rhBNP组，PQ+低剂量rhBNP组。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，其余三组在予以腹腔注射百草枯30mg/kg1h后行腹腔注射不同剂量rhBNP(40ug/kg ， 20ug/kg，10ug/kg 0.5ml)，rhBNP每天1次连续给药7天。连续观察14天。记录大鼠死亡情况计算生存率并行死亡大鼠肺解剖检查。 第三部分：采用百草枯诱导的SD大鼠为体内模型。大鼠分别随机分为四组：空白对照组(NC)、PQ组，PQ+rhBN组，PQ+地塞米松组。空白对照组给予生理盐水腹腔注射，PQ组予以腹腔注射百草枯20mg/kg，其余两组在予以腹腔注射百草枯20mg/kg后，分别1h后行腹腔注射rhBNP(20ug/kg)和地塞米松(25ug/kg)，每组按第1，3，7各时间分别处死大鼠，取血后行ELISA检测血清中IL-6和TNF-α浓度，取肺组织检测湿干比值(W/D)；Western-blot检测肺组织TLR4、NF-κB蛋白的表达和RT-RCR检测肺组织TLR4、NF－κB、TGF-β1mRNA的表达。其余备行于检测肺组织SOD活力、MDA含量测定及HE染色观察病理情况，计算肺组织损伤病理积分。 体外实验：以PQ染毒人肺微血管内皮细胞(HPMEC)为体外模型。将细胞分为4组，分别为正常对照组、PQ染毒组(PQ组)、PQ+重组人脑利钠肽治疗组(PQ+rhBNP组)、PQ+地塞米松治疗组(PQ+地米组)。用CCK-8法测定各组细胞增殖指数，ELISA测定细胞上清中IL-6、TNF-α的浓度水平，RT-PCR测定TLR4、NF-κB的mRNA水平 结果： 体内实验 第一部分：PQ中毒大鼠在各时间节点上肺组织的湿干重比均大于对照组，且肺组织病理情况及评分较对照组严重。与对照组相比，PQ组大鼠血清中的细胞因子BNP(脑钠尿肽)、IL-6浓度均明显升高，BNP12小时即可观察到升高，且于第三天达到峰值；IL-6与BNP浓度具有显著的正相关关系。 第二部分：通过生存分析发现，中剂量rhBNP(20ug/kg 0.5ml)可改善中毒大鼠生存率(P＜0.05)，而高、低剂量组与对照组相比，生存率差异没有统计学意义。 第三部分： 1、HE染色结果显示，对照组：大鼠未见明显异常。PQ组：肺泡内可见炎症细胞浸润和扩张的毛细血管，肺泡结构破坏严重。PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组：大鼠的肺泡结构稍显完整，肺泡内充血和炎性细胞浸润的含量较PQ组也显著减少。与对照组相比，PQ组大鼠肺组织损伤评分上升。与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织损伤评分均偏低。 2、W/D情况:与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组在各时间点大鼠肺W/D值显著高于对照组，而与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺W/D值均低于PQ组。 3、ELISA结果：与对照组相比，各染毒组大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度上升。与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠血清TNF-α和IL-6浓度均降低。 4、MDA含量、SOD活力:与对照组相比,PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组在染毒后肺组织中MDA含量上升、SOD活性降低。与PQ组相比较，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠血清MDA含量均降低、SOD活性均升高。PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组相比无明显差异。 5、RT-PCR结果：与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA的表达水平明显增高。但与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组肺组织中TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表达显著降低。 6、Western-blot结果：与对照组相比，PQ组、PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平显增高。但与PQ组相比，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组肺组织中TLR4和NF-κB蛋白表达显著降低，PQ+rhBNP组和PQ+地塞米松组两者无明显差异。 体外实验 1、与正常组比较，PQ组细胞增殖明显降低，而经过rhBNP干预后，PQ所致的细胞增殖明显改善，rhBNP干预组细胞增殖指数明显高于PQ组细胞。 2、ELISA结果，与正常组比较，PQ组细胞炎症因子IL-6和TNF-α的含量明显增多，而经过rhBNP干预后，PQ所致的炎症因子IL-6和TNF-α的表达明显减小。 3、RT-PCR结果，与正常组比较，PQ组TLR4、NF-κBmRNA表达明显增加，而经过rhBNP干预后，TLR4、NF-κBmRNA表达明显减小。 结论： (1)PQ大鼠早期血BNP水平可出现升高。 (2)rhBNP早期治疗可能改善百草枯中毒大鼠生存率。 (3)rhBNP可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路来减缓炎症发生从而改善PQ中毒大鼠肺损伤。 收起