中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 孙斌海军军医大学 2020年硕士导师: 袁文共96页

摘要 : 目的:成骨不全症（Osteogenesis Imperfecta，OI）是以骨脆性增加、胶原代谢紊乱为特征的全身性遗传性结缔组织疾病。绝大多数OI患者是由于编码Ⅰ型胶原蛋白α1链(Collagen typeⅠα1chain,Col1α1)和α2链（Collagen typeⅠα2chain,Col1α2）的基因... 展开目的:成骨不全症（Osteogenesis Imperfecta，OI）是以骨脆性增加、胶原代谢紊乱为特征的全身性遗传性结缔组织疾病。绝大多数OI患者是由于编码Ⅰ型胶原蛋白α1链(Collagen typeⅠα1chain,Col1α1)和α2链（Collagen typeⅠα2chain,Col1α2）的基因突变导致的胶原代谢紊乱。根据OI的特征性临床表现分为5个亚型（1-5型），其临床特征主要包括骨量降低、反复骨折、骨骼畸形、牙本质发育不全、关节松弛、身材矮小。OI症状多于儿童时期开始出现，严重影响患者的生活质量，也给家庭和社会带来沉重的负担。目前，针对OI尚缺乏有效的治愈手段，现行的临床治疗方案主要包括药物治疗、手术矫形、康复锻炼、分子与细胞治疗等。药物治疗为目前主要的治疗方式，其中以双膦酸盐(Bisphosphonates，BPs)的应用最为广泛。BPs是一种骨吸收抑制剂，在体内与骨基质中的羟基磷灰石相结合，通过抑制破骨细胞的活性来改善OI患者的骨骼结构。但BP的用药模式复杂，存在急性期反应（Acute phase response，APR）、非典型股骨骨折（Atypical femoral fracture，AFF）、下颌骨坏死(Osteonecrosis of the jaw,ONJ)、骨延迟愈合、肾功能损害、低钙血症等不良反应。地诺单抗(Denosumab)是一种特异性靶向核因κB受体活化因子配子(Receptor Activator of Nuclear Factor-κBLigand,RANKL)的抗体，能有效提高OI患者的骨密度，但儿童OI应用Denosumab治疗时有反跳性椎体骨折的发生。特立帕肽（Teriparatide）是目前唯一被FDA批准促进骨合成代谢的药物，能有效增加骨质疏松患者的骨密度、降低骨折风险，但对中重度OI患者的作用甚微并可能导致骨肉瘤的发生。雷奈酸锶（Strontium ranelate）具有抑制破骨和促进成骨的双重骨代谢调节作用，能有效降低OI模型鼠的骨折发生率，但该药由于存在增加心血管意外的风险面临退市可能。因此，有必要探索更有效、安全的OI治疗药物。鸢尾素(Irisin)是一种N-糖基化的肌源性蛋白质激素，是由骨骼肌在运动激发下分泌释放。Irisin可通过激活Wnt/β-catenin信号通路途径促进成骨细胞分化，激活p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)诱导成骨细胞增殖、分化、和矿化。同时Irisin可通过抑制破骨细胞系(RAW264.7)的核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）抑制破骨细胞的形成。动物实验结果表明Irisin可增加皮质骨密度、增强骨骼强度和改善骨骼微结构，同时能有效改善后肢悬吊模型鼠的废用性骨质流失和肌肉萎缩。因此，我们推测同时具有促进成骨、抑制破骨效能的Irisin或可有效改善OI患者的临床症状。本课题拟以oim/oim小鼠（OI模型鼠）为研究对象，明确Irisin在胶原缺陷的背景下对oim/oim小鼠成骨细胞及破骨细胞的作用;进一步通过体内实验观察Irisin对OI模型鼠的治疗作用。第一部分:Irisin在体外对OI模型鼠成骨细胞、破骨细胞的影响方法:以纯合子oim/oim小鼠及野生型wt/wt小鼠的成骨前体细胞、骨髓单核细胞为研究对象，给予不同浓度(10、100ng/ml)的Irisin进行干预，采用实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别在mRNA及蛋白水平检测成骨、破骨细胞分化成熟变化，采用ALP染色及茜素红S染色观察成骨分化及矿化情况，采用Trap染色、免疫荧光染色及骨吸收功能检测评估破骨细胞形成数量及骨吸收活性。结果:(1)qRT-PCR及蛋白质印迹法检测结果显示，Irisin在mRNA及蛋白水平均可促进oim/oim小鼠成骨细胞转录调节因子(Runx2)和分化标记基因(ALP、OCN和Col1α1)，同时抑制破骨细胞分化相关基因及转录因子(Calcr、Trap、CTSK、c-fos、NFATc1)的表达。(2)ALP染色及茜素红S染色结果显示，Irisin可促进oim/oim小鼠成骨细胞分化及矿化。(3)Trap染色、免疫荧光染色及骨吸收功能检测结果显示，Irisin可降低oim/oim小鼠破骨细胞形成数量和破骨细胞骨吸收活性。结论:Irisin可有效改善OI模型oim/oim小鼠的骨代谢失衡，在Ⅰ型胶原缺陷的背景下，Irisin同样可促进成骨细胞分化及矿化，并抑制破骨细胞的形成及骨吸收活性。第二部分:Irisin对OI模型鼠的治疗作用方法:(1)3周龄B6C3Fe-α/α-Collα2oim/+品系小鼠，按照基因型(oim/oim或wt/wt)及治疗方案(Irisin或Veh)随机分为4组:Oim+Veh组、Oim+Irisin组、Wt+Veh组和Wt+Irisin组。从第4周起，给予小鼠尾静脉注射Irisin（100μg/kg，1次/周）或等体积生理盐水(Veh)治疗8周。(2)动态测量体重、治疗后测量股骨长度用以评估生长发育情况。(3)治疗前后对oim/oim小鼠进行X线检查，进行骨折计数。(4)小鼠处死后，提取血清通过ELISA技术检测OCN、NTx和TRACP5b的活性。(5)实验结束后，分离小鼠左侧股骨进行Micro CT扫描并进行骨微结构分析。(6)取左侧胫骨进行动态骨形成分析。(7)分离右侧胫骨进行Trap染色和HE染色，并进行破骨细胞和成骨细胞计数。(8)取左侧股骨和骨折的股骨段，进一步进行生物力学分析。结果:(1)Irisin的干预对oim/oim小鼠和wt/wt小鼠体重的变化和股骨长度均无显著影响。(2)Irisin可有效减少oim/oim小鼠的骨折发生。(3)ELISA结果提示Irisin可提高OI模型鼠的成骨相关标记物OCN血清水平，同时降低破骨相关标记物NTx和TRACP5b。(4)Micro CT结果提示Irisin可同时改善OI模型鼠的皮质骨和松质骨的骨微结构。(5)Irisin可通过提高BFR促进OI模型鼠的骨矿化沉积。(6)Irisin诱导OI模型鼠的成骨细胞形成并抑制破骨细胞形成。(7)Irisin通过提高结构特性、降低骨脆性来改善OI模型鼠的骨生物力学特性。结论:Irisin可通过抑制骨吸收和维持骨形成的双重调节作用，对骨量、骨微结构和骨强度产生积极的改善作用，进而降低处于生长发育期OI模型鼠的骨折发生。小结:本研究首次采用OI模型B6C3Fe-α/α-Collα2oim/+小鼠，通过体外、体内实验，证实Irisin通过促进成骨分化、矿化和抑制骨吸收的双重骨代谢调节作用，提高骨密度、改善骨微结构及骨生物力学特性，降低生长发育期OI模型鼠的骨折发生。收起

关键词 : 成骨不全症鸢尾素成骨分化成骨矿化骨代谢

2. 骨细胞BMP信号调控成骨分化作用与机制研究

[学位论文] 赵怡心重庆医科大学 2021年硕士导师: 刘宏共74页

摘要 : 目的：BMP2、BMP7被FDA批准应用于骨不连、脊柱融合等的治疗，但未被应用于成骨药物，而临床BMP使用可能导致异位骨化、假关节等副作用。有研究报道成骨细胞中的BMP信号抑制骨形成，而骨细胞BMP成骨效应研究不明。我们前期研究发现骨细胞Smad4敲除小鼠... 展开

关键词 : BMP 骨细胞成骨分化成骨细胞

3. ox-LDL对与SMCs共培养中MSCs的增殖与成骨分化的影响

[学位论文] 丁峰内蒙古医学院 2008年硕士导师: 陈晓春;徐洋共51页

摘要 : 目的：观察一定浓度的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL，Oxidatirely Modified Low Density Lipoprotein)干预在成骨诱导剂存在或不存在两种条件下，对与平滑肌细胞(SMCs，Smooth muscle cells)共培养中骨髓间充质干细胞(MSCs，Mesenchymal StemCells)增殖... 展开目的：观察一定浓度的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL，Oxidatirely Modified Low Density Lipoprotein)干预在成骨诱导剂存在或不存在两种条件下，对与平滑肌细胞(SMCs，Smooth muscle cells)共培养中骨髓间充质干细胞(MSCs，Mesenchymal StemCells)增殖与成骨分化的影响，进而来阐释干细胞参与动脉粥样硬化(AS，atherosclerosis)形成的机制。方法：实验干预因素有两个：成骨诱导剂(简称诱导剂)和OX-LDI。以析因设计分为4组：联合干预组(诱导剂及ox-LDL);ox-LDL组；诱导剂组；普通组。四组均为在DMEM培养液中通过插入式培养皿间接共培养MSCs和SMCs两种细胞，插入式培养皿的底部为细胞因子可自由通过的半透膜。通过MTI、法测培养Od、4d、7d、10d、14d五个时间点各组MSCs细胞数量，绘制细胞生长曲线；采用逆转录酶链式反应检测培养7d时MSCs内骨桥蛋白(OPN，Osteopontin)mRNA的表达量；第10d检测细胞内碱性磷酸酶(AKP，Alkaline phosphatase)活性；14d免疫组化法测定MSCs内OPN及AKP的表达。结果：细胞生长曲线显示4组MSCs细胞数量均随培养时间的延长而增加，1到3d为潜伏期，4到7d为对数生长期，7到10d进入平台期，10d后进入凋亡期。0d时，OX-LDL与诱导剂两因素及其交互作用均无统计学意义；说明干预开始前各组细胞数量均等；和普通组相比ox-LDL促进MSCs增殖(7d，P<0．05)；诱导剂，两因素联合作用抑制细胞增殖(4～14d，P<0．05)。7d时4组MSCs均表达OPN mRNA，10d时4组均表达AKP，其中联合组表达OPN和AKP最强，统计学处理显示ox-LDL和诱导剂对于促进MSCs表达OPN及AKP具有正交互作用(P<0．05)。14d时细胞爬片经免疫组化染色显示联合组OPN及．AKP阳性表达最强。结论：SMCs与MSCs间接共培养条件下，ox-LDL促进MSCs增殖，诱导MSCs成骨作用微弱；诱导剂抑制MSCs增殖促进MSCs成骨分化；而ox-LDL和诱导剂共同作用明显抑制MSCs增殖促进MSCs成骨分化，有协同作用。推测这可能成为体内血管动脉粥样硬化异位钙化形成的机制之一。收起

关键词 : 共培养增殖成骨分化

4. 硅橡胶密闭通道诱导修复兔长管骨大段骨缺损:一种新的骨诱导方法

[学位论文] 谷峰吉林大学 2022年博士导师: 于铁成共140页

摘要 : 研究背景：因严重创伤、骨肿瘤切除和骨髓炎清创术后出现的长管骨大段骨缺损一直以来是骨科领域治疗的难点。长管骨大段骨缺损导致的骨不连和其他并发症往往会造成肢体残疾等严重后果，给患者造成巨大的痛苦和沉重的经济负担。目前临床治疗长管... 展开研究背景：因严重创伤、骨肿瘤切除和骨髓炎清创术后出现的长管骨大段骨缺损一直以来是骨科领域治疗的难点。长管骨大段骨缺损导致的骨不连和其他并发症往往会造成肢体残疾等严重后果，给患者造成巨大的痛苦和沉重的经济负担。目前临床治疗长管骨大段骨缺损的手段中，自体骨移植仍是金标准。但在骨缺损范围较大的情况时，由于自体骨的来源有限，往往难以获得足够的移植骨，而且大量的自体取骨常会出现许多并发症，包括神经和血管损伤、感染、供骨区慢性疼痛等等。除了自体骨移植，一些其他手段也被应用于长管骨大段骨缺损的修复和治疗，包括Ilizarov技术、Masquelet技术和骨组织工程等方式。不过目前以上几种方式都存在一定的不足，Ilizarov技术需要较为复杂的外固定器械，且在牵张成骨过程中因软组织局部的压力，往往造成患者肢体的持续疼痛，并且伴随着力线偏移、针道感染和神经损伤的风险。Masquelet技术在其治疗的第一阶段通过植入PMMA形成诱导膜，在治疗的第二阶段仍然依赖于自体骨移植。另外Masquelet技术治疗周期漫长，也增加了治疗过程中的不确定性。骨组织工程技术是近年来研究的热点之一，骨组织工程所需的最主要三种生物学要素包括种子细胞、细胞外基质支架和促进生长、分化和血管生成的细胞因子。尽管发展迅速，但目前为止尚无一种最佳材料可以完全解决长管骨大段骨缺损的治疗问题。骨折愈合是一个复杂的生物学过程，其中包含诸多成骨要素，其中任何一个环节受到损害，都有可能使骨折愈合过程受阻，并最终形成骨不连。长管骨大段骨缺损由于局部缺乏骨质和血运，如果在一期治疗无法形成骨愈合，多导致形成萎缩性骨不连。所以长管骨大段骨缺损的治疗，需尽可能使其在一期实现骨愈合，避免骨不连的发生，减少患者痛苦，并提高患者的生活质量和肢体功能。Masquelet技术的膜诱导成骨机制激发了本课题组的的浓厚兴趣，本课题尝试基于这项技术的基本原理和操作，在此基础上进行进一步的探索和改进，以获得一种更为优良的骨诱导技术。同时，探究是否能够不依靠骨移植和种子细胞，单纯使用一种新型的诱导技术来修复长管骨大段骨缺损。目前硅橡胶材料已经广泛应用于生物医学相关领域，包括乳房假体、医用导管和口腔医学等领域，显示出良好的安全性。在周围神经再生研究中，一些研究者使用硅橡胶管套接，用于诱导神经再生，并且得到了良好的效果。但硅橡胶材料用于诱导治疗长管骨大段骨缺损目前尚无文献报道。本课题组基于Masquelet技术的原理和硅橡胶管诱导神经纤维再生的启发，开发了一种全新的骨诱导方法，尝试使用硅橡胶密闭通道，用于诱导修复长管骨大段骨缺损，并设计了相关的体内和体外实验。研究目的：本课题拟通过体内和体外实验，证明硅橡胶密闭通道诱导修复兔长管骨大段骨缺损的有效性，并对其成骨过程和机制进行探究。研究方法： 1.分离、培养SD大鼠BMMSCs，并对提取细胞进行鉴定。 2.设计体外实验，利用提取的BMMSCs，验证硅橡胶材料的生物相容性和长期植入体内的可行性。 3.设计体内实验，建立兔桡骨大段骨缺损模型，手术植入硅橡胶密闭通道进行诱导。在术后1天、3天、7天、14天、4周、8周、12周和16周八个时间点进行取材，探究硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损的有效性。并通过X线、MicroCT、骨组织荧光标记和病理染色等方式，进一步阐释硅橡胶密闭通道诱导成骨的过程。研究结果： 1.本课题成功提取了SD大鼠的BMMSCs，并以此为基础通过体外实验证明，医用硅橡胶材料在细胞毒性、溶血反应、细胞粘附性和对骨髓间充质干细胞的成骨能力影响等方面，均符合植入标准，作为一种植入体内的成骨诱导材料具有可行性。 2.本课题通过体内实验证明了，硅橡胶密闭通道可以诱导兔长管骨大段骨缺损的修复和再生，这一过程是一个软骨内成骨的过程。诱导成骨的初始阶段，密闭硅橡胶通道内形成血肿组织，并形成骨缺损断端的桥接。新生血肿组织中富含成骨相关蛋白、成血管相关蛋白和TGF-β1等因子。随后血肿组织逐渐出现血管化和软骨内成骨，最终软骨组织被成熟骨组织替代完成骨愈合，新生骨组织具有良好的血运。这种诱导方式依赖于硅橡胶通道完整密闭的环境。结论：本实验通过体外和体内实验证明，医用硅橡胶材料具有良好的生物相容性，硅橡胶密闭通道可以诱导修复兔长管骨大段骨缺损，实现骨再生。在本实验中这一过程不依赖植骨，并可以实现骨愈合。硅橡胶通道诱导成骨的过程是一个软骨内成骨过程，早期形成的血肿组织富含成骨和成血管相关蛋白，并逐渐发生血管化和软骨内成骨反应，最终实现骨的再生。在这一诱导过程中，成功的关键因素在于硅橡胶通道的完整密闭环境。这种新的骨诱导方法，为未来临床治疗长管骨大段骨缺损提供了新的思路。本研究创新点: 1.本研究首次提出了“硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损”的方法。用密闭硅橡胶通道连接骨缺损的两端，在局部创造密闭环境，避免了纤维组织长入干扰骨组织的再生，有效避免了骨不连的发生。实验结果显示硅橡胶材料本身不能直接诱导BMMSCs成骨矿化，这进一步说明：诱导成骨关键因素是通道的密闭环境，而不是材料直接诱导成骨。 2.本实验使用的骨诱导方法和以往的Masquelet技术相比，最主要的优势在于治疗过程不需要植骨。本实验不同于骨组织工程技术，不使用种子细胞和复杂的合成材料，目的是提出一种全新的骨诱导方法和成骨理念。 3.本实验中使用的骨缺损模型，缺损长度超过4.5倍骨直径，在同类实验中属于较长节段，这说明本诱导方式具有良好的诱导成骨效果。研究结果揭示了“硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损”的发生机制是一个软骨内成骨的过程。密闭通道内早期形成血肿组织，并在骨缺损两端形成桥接，新生血肿组织中富含成骨相关蛋白、成血管相关蛋白和TGF-β1等因子，可有效诱导成骨。这种诱导方式依赖于硅橡胶通道完整密闭的环境。收起

关键词 : 大段骨缺损诱导成骨硅橡胶成骨分化骨再生

5. 氯化锂对钛表面成骨细胞成骨分化的影响

[学位论文] 卢佩佩温州医科大学 2016年硕士导师: 丁熙共45页

摘要 : 目的: 锂盐是一种人体非必须的微量元素。锂盐可独立影响骨代谢，并增加骨密度，降低骨折风险。有研究表明，氯化锂可促进骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞等干细胞的成骨作用。并且，也有动物实验表明氯化锂作用于骨折模型小鼠和腭中缝扩大后的大... 展开目的: 锂盐是一种人体非必须的微量元素。锂盐可独立影响骨代谢，并增加骨密度，降低骨折风险。有研究表明，氯化锂可促进骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞等干细胞的成骨作用。并且，也有动物实验表明氯化锂作用于骨折模型小鼠和腭中缝扩大后的大鼠，其新骨形成都有所增加。然而，氯化锂是否能促进成骨细胞成骨分化还存在争议。目前，国内外对氯化锂在钛片表面复合培养成骨细胞后其生长情况、分化成骨及其作用机制的研究报道比较少见。本研究探索不同时间点不同浓度氯化锂对钛片上成骨细胞增殖和成骨分化的影响，为进一步的动物实验及临床实验提供基础。方法: 1.将实验所用钛片进行粗化处理，再将成骨细胞接种于钛片上，进行体外复合培养。将实验分成5个组，实验组4个即氯化锂组（2.5 mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L）和空白组对照组（未加氯化锂组）。 2.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。用CCK8法检测各组在第1天至第4天各时间点在450nm波长时的吸光度值，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞增殖的影响。结果进行统计分析。 3.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定各组细胞在第4天和第8天时ALP的活性，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 4.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用ELISA OC试剂盒检测第6天和第12天各组OC的分泌表达，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 5.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用实时荧光定量PCR法，检测第6天各组成骨细胞OC mRNA、Runx2mRNA和COL-ⅠmRNA的基因表达，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 6.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用Western-blot法观察各组Runx2和COL-Ⅰ蛋白条带。评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，评价各个蛋白条带变化。结果: 1.成骨细胞MC3T3-E1在钛片表面第1天至第4天的CCK8吸光值（OD值），间接反映了细胞的增殖情况。在第1天各种浓度氯化锂组OD值无明显变化;在第2天时，2.5mmol/L氯化锂组OD值比空白组大，5mmol/L和10mmol/L氯化锂组OD分别都小于空白对照组，但三组数据与空白对照组比较，差异均无统计学意义(p＞0.05);20mmol/L氯化锂组OD值比空白组小(p＜0.05)，差异有统计学意义，说明20mmol/L氯化锂浓度起到了抑制作用。不同浓度氯化锂组处理MC3T3-E1细胞第3天与第4天后，其中2.5mmol/L氯化锂组与空白对照组相比OD值大(p＜0.05)，说明该浓度促进了MC3T3-E1细胞增殖(p＜0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化锂组OD值均小于空白对照组(p＜0.05)，说明这两个浓度抑制细胞增殖作用，且随着浓度增大抑制作用呈递增趋势。5mmol/L氯化锂组比空白对照组OD值小但差异无统计学意义(p＞0.05)，说明该浓度对细胞增殖无明显作用。 2.各浓度氯化锂组在第4天和第8天对MC3T3-E1细胞ALP活性检测结果显示，仅10mmol/L和20mmol/L氯化锂组检测结果高于空白对照组，均有统计学差异(p＜0.05)，且随着浓度增大促进作用呈递增趋势。2.5mmol/L和5mmol/L氯化锂组结果高于与空白对照组但差异无统计学意义(p＞0.05)。 3.各浓度氯化锂组在第6天与第12天对MC3T3-E1细胞的骨钙素表达量进行检测。5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L氯化锂组检测结果均小于空白对照组，且均有统计学差异(p＜0.05)。2.5mmol/L和氯化锂组与空白组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。 4.各浓度氯化锂组在第6天对Runx2mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表达进行检测，结果显示在2.5mmol/L氯化锂组Runx2mRNA、COL-Ⅰ RNA基因及OC mRNA的表达水平低于空白对照组，但无显著性差异(p＞0.05)。在5mmol/L氯化锂组COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表达低于空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明对COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表达起到了抑制作用。但此浓度Runx2 mRNA表达低于与空白对照组，差异无统计学意义(p＞0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化锂组Runx2 mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表达水平均低于空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。 5.根据western-blot的实验结果，在2.5mmol/L、5mmol/L氯化锂组中Runx2和COL-Ⅰ蛋白表达均低于空白对照组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。在10mmol/L、20mmol/L组氯化锂Runx2和COL-Ⅰ蛋白表达均低于与空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。结论: 氯化锂在高浓度（10mmol/L和20mmol/L）抑制了成骨细胞成骨表达。在低浓度（2.5mmol/L和5mmol/L）则不影响成骨细胞成骨表达。低浓度氯化锂（2.5mmol/L）可促进成骨细胞的增殖。本研究结果提示，氯化锂的促成骨作用可能不是通过成骨细胞，其包含了其他不同的机制。使用氯化锂促成骨应该注意浓度剂量，以防止对成骨细胞的过度抑制从而影响成骨作用。收起

关键词 : 成骨细胞成骨分化细胞增殖氯化锂

6. 细菌脂多糖调控JAK2/STAT5信号通路抑制成骨细胞成骨分化的作用

[学位论文] 吴昊南方医科大学 2018年博士导师: 余斌共132页

摘要 : 成骨细胞-破骨细胞正常的功能偶联是骨折愈合的重要因素，骨折局部感染可导致骨折不愈合，局部感染会引起骨折断端成骨细胞及破骨细胞功能异常，进而干扰正常的成骨细胞-破骨细胞偶联，使断端出现游离死骨，死骨形成后导致感染难以控制形成恶性循环，... 展开成骨细胞-破骨细胞正常的功能偶联是骨折愈合的重要因素，骨折局部感染可导致骨折不愈合，局部感染会引起骨折断端成骨细胞及破骨细胞功能异常，进而干扰正常的成骨细胞-破骨细胞偶联，使断端出现游离死骨，死骨形成后导致感染难以控制形成恶性循环，最终导致骨折不愈合。因此临床又把感染导致的骨折不愈合称之为难治性骨折不愈合。骨折感染通常为混合感染，革兰氏阴性菌参与其中，脂多糖(LPS)是构成革兰氏阴性菌细胞壁主要的成分之一。但是脂多糖是否能干扰成骨细胞的正常功能导致偶联失调，及其相应的具体机制尚不明确。JAK-STAT信号通路作为一个重要的细胞信号通路在成骨细胞的发生、成熟、分化和凋亡中发挥着重要的作用。根据文献报道及本实验的研究结果，证实细菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信号通路，继而干扰成骨细胞正常的分化功能;阻断JAK2/STAT5信号通路可逆转细胞脂多糖对于成骨细胞分化功能的影响。目的： 1.体外实验。研究不同浓度脂多糖对成骨细胞活性、成骨功能指标的影响，为寻找脂多糖作用成骨细胞的靶点提供分子生物学研究基础。 2.培养MC3T3-E1细胞，以不同浓度LPS处理，结合JAK2-siRNA，检测成骨细胞活性、成骨功能指标的影响，为寻找治疗细菌感染导致的骨不连的药物靶点提供分子生物学研究基础。 3.体内实验。建立动物感染骨折愈合模型，分为对照组、炎症组、治疗组，观察骨折愈合过程情况、检测骨折处骨密度、骨小梁分离度等指标的变化，检测骨折处软骨化骨程度、成骨细胞数量的变化，说明JAK2-STAT5信号通路在脂多糖是否影响成骨细胞生长分化中发挥作用，为治疗细菌感染导致的骨折不愈合垫定实验基础。方法：第一部分： 1.体外培养MC3T3-E1细胞系。 2.成骨细胞骨矿化结节染色，碱性磷酸酶活性检测。 3.人类重组骨形态发生蛋白2(BMP-2)，RunX-2蛋白及Ⅰ型前胶原氨基端前肽的含量检测。 4.MTT法细胞活性检测。 5.免疫印迹法检测脂多糖干扰成骨细胞中TLR-2、TLR-4、STAT5b蛋白的表达。第二部分： 1.细胞系培养。 2.siRNA的转染。 3.免疫印迹法检测转染后JAK2表达水平。 4.JAK2-siRNA转染成骨细胞骨矿化结节染色的检测。 5.RT-PCR法检测TLR2，TLR4的mRNA水平。 6.酶联免疫吸附试验检测ALP,RUNX，BMP-2和PINP蛋白水平的变化。第三部分： 1.动物骨折模型及内固定手术。 2.X线检查骨折愈合情况，Micro-CT检测骨折部位骨密度(BMD)及骨小梁分离度(Tb.Sp)。 3.番红固绿染色观察检测软骨细胞骨化成骨程度。 4.HE染色、OCN免疫组化染色观察检测成骨细胞的数量。统计分析采用软件IBM SPSS Statistics21进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示。对于基本符合正态分布或者偏正态分布的数据，2组或2组以上组间均数比较分别采用独立样本t检验和单因素方差分析。对于不符合正态分布的数据，2组或2组以上组间均数比较分别采用两独立样本非参数检验和多个独立样本非参数检验，检验方法分别为Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05表示有统计学差异。结果与结论： 1.LPS诱导成骨细胞矿化点呈浓度依赖性下降。 2.LPS干扰成骨细胞，成骨细胞细胞活性降低，活性碱性磷酸酶水平降低。成骨分化相关蛋白RUNX2，BMP-2和PINP表达量逐渐递减，且与LPS呈浓度依赖性。 3.不同浓度LPS干扰成骨细胞后TLR2，TLR4的mRNA与蛋白表达升高，p-STAT5b和JAK2的蛋白表达上升，并且均呈剂量依存性。 4.siRNA-JAK2转染成骨细胞，JAK2的mRNA和蛋白表达水平下降。 5.LPS干扰siRNA-JAK2转染成骨细胞骨后，转染组矿化点高于未转染组。RUNX2，BMP-2和PINP蛋白表达上升。 6.术后2周小鼠胫骨骨折骨折愈合，对照组、治疗组中软骨细胞骨化程度高于炎症组，炎症组愈合过程较对照组与治疗组滞后。 7.术后2周骨折区域骨密度对照组、治疗组均高于炎症组。骨小梁分离度对照组、治疗组均低于炎症组。 8.术后2周、4周对照组、治疗组中成骨细胞个数较炎症组多，成骨活跃。收起

关键词 : 成骨细胞成骨分化细菌脂多糖调控机制

7. 两种不同矿化诱导液对根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的影响

[学位论文] 王玲菲广西医科大学 2012年硕士导师: 廖红兵共68页

摘要 : 目的：干细胞需要经历增殖、诱导分化的阶段，才能获得需要的生物表性，干细胞向成骨/成牙本质细胞谱系分化的前提是经过矿化诱导阶段。目前用于干细胞矿化诱导的矿化液种类较多，配方各异，各成分在某些配方中的添加浓度也有不同，最终的矿化诱... 展开目的：干细胞需要经历增殖、诱导分化的阶段，才能获得需要的生物表性，干细胞向成骨/成牙本质细胞谱系分化的前提是经过矿化诱导阶段。目前用于干细胞矿化诱导的矿化液种类较多，配方各异，各成分在某些配方中的添加浓度也有不同，最终的矿化诱导效果有差异。近来有文献把KH2PO4作为矿化液的常规添加成分，与矿化诱导液其他成分共同起矿化诱导作用。与矿化诱导液其他的成分相比，KH2PO4的作用机制有待进一步阐明，它对各类干细胞是否具有广泛促矿化作用，也尚未见报道。根尖乳头干细胞(stemcells from apical papilla，SCAP)来源于根尖未发育完全的根尖乳头组织，是间充质干细胞的一种，被认为是牙再生组织工程重要的细胞来源，SCAP在矿化液诱导下可以向成骨/成牙本质细胞谱系分化。本研究选用SCAP作为含KH2PO4矿化液的矿化作用靶细胞，通过体外/体内实验，观察含KH2PO4矿化液对SCAP细胞增殖能力和成骨/成牙本质向分化能力的影响，试阐明KH2PO4在矿化液中的作用机理，以及与其他矿化诱导液诱导效能相比，矿化液中添加KH2PO4的优越性。方法：从根尖孔未发育完全、带有根尖乳头软组织的年轻恒牙，分离并提纯SCAP细胞，评价体内/体外SCAP细胞在两种不同矿化诱导液中的增殖和分化能力。一、配置两种矿化诱导液，分别为含(MM2)/不含(MM1)KH2PO4(1.8mM)的两种矿化诱导液(50μg/mL抗坏血酸、10nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸)，L-DMEM培养液为对照组(Control组)，分别用于培养SCAP细胞。二、体外实验，通过四唑盐比色实验(MTT)、流式细胞术(FCM)检测细胞周期，绘制生长曲线图和计算生长指数，评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外增殖能力:通过碱性磷酸酶(ALP)检测和茜素红钙结节染色，以及Westemblot和Real-timeRT-PCR分别从蛋白和基因水平检测相关矿化指标(DSP/DSPP，OCN/OCN)，评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外分化能力。三、体内实验，从4-7dSD大鼠磨牙分离出SCAP细胞，经过两种不同矿化液诱导后，制成细胞团放入预先处理的大鼠切牙根片段，一同植入8-lOw的雌性大鼠肾被膜下。14d后，移植组织块回收，样本于4％福尔马林固定，脱钙，进行石蜡包埋，切片后分别做HE染色和免疫组织化学染色，检测成骨/成牙本质向分化相关蛋白(OCN，DSP)表达强度，比较SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体内分化能力。结果：一、体外实验:四唑盐比色实验和流式细胞术显示两矿化诱导液组SCAP细胞的增殖能力都增高，其中MM2组的SCAP细胞增殖能力高于MM1组。两矿化诱导液组的碱性磷酸酶活性均高于对照组，其中MM2组的碱性磷酸酶活性明显提高(P＜0.01)。MM2组与其余两组相比，表现出更多的钙结节沉积。WesternBlot及Real-timeRT-PCR结果显示:MM2组的SCAP细胞早期成骨/成牙本质向分化相关指标表达明显高于MM1组的SCAP细胞的表达(如:DSP/DSPP、OCN/OCN;P＜0.05)，进一步从蛋白和基因水平证实，加KH2PO4的矿化诱导液能促进SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力。二、体内实验，肾被膜下移植的含SCAP细胞团牙根片段两周后回收，HE染色显示:各组牙根片段内都有牙髓样组织形成，对照组没有新的矿化组织形成，两矿化诱导液组在根管内都有新的矿化组织形成，而MM2组的SCAP细胞团形成更多的矿化组织:免疫组织化学检测样本DSP和OCN的表达，MM1组OCN表达呈弱阳性，DSP表达呈阳性;MM2组OCN表达呈阳性，DSP表达呈强阳性，MM2组目的蛋白的表达明显比MM1组表达强。与其余两组相比较，MM2组SCAP细胞团表达更多的成骨/成牙本质向分化相关蛋白。结果显示，含KH2PO4的矿化诱导液培养的SCAP细胞增殖能力增强，成骨/成牙本质向分化相关蛋白的表达水平上调。结论：本研究表明，加KH2PO4的矿化诱导液能增强SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力:与其他矿化诱导液相比，含KH2PO4的矿化诱导液矿化效能更高;KH2PO4可能是一种方便，经济的干细胞矿化诱导剂成分。收起

关键词 : 根尖乳头干细胞成骨分化成牙分化矿化诱导液

8. 兔体外成骨细胞和脂肪细胞横向分化的初步研究

[学位论文] 赵豪遵义医学院 2011年硕士导师: 王兆杰共60页

摘要 : 目的:探讨成骨细胞和脂肪细胞两者间横向分化的能力和方法,为进一步行缝隙连接通讯对其调控的实验做准备。方法:选取3月龄新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织进行分离培养脂肪细胞,天花板贴壁法对脂肪细胞进行细胞去分化培养,利用第3代去分化脂肪细胞... 展开目的:探讨成骨细胞和脂肪细胞两者间横向分化的能力和方法,为进一步行缝隙连接通讯对其调控的实验做准备。方法:选取3月龄新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织进行分离培养脂肪细胞,天花板贴壁法对脂肪细胞进行细胞去分化培养,利用第3代去分化脂肪细胞进行成骨诱导,并设立对照组进行对比。成骨分化指标的检测:对培养3周后的两组细胞进行Ⅰ型胶原免疫组化染色;使用BCIP/NBTALP显色试剂盒对两组细胞进行ALP染色;使用ALP活性检测试剂盒分别检测各组第7天、第14天、第21天细胞的ALP活性;使用茜素红对连续培养3周的两组细胞进行钙结节染色。取出生7天内的乳兔颅骨进行成骨细胞的获得及培养,利用第3代成骨细胞细胞进行成脂诱导,并设立对照组对比。脂肪细胞分化指标的检测:两组细胞培养3周后行油红0染色:RT-PCR检测两组细胞PPARγmRNA的表达。结果:1、提取的成熟脂肪细胞经天花板贴壁法培养后形态为长梭形成纤维细胞状。2、成骨分化检测:Ⅰ型胶原免疫组化染色显示实验组细胞内表达出Ⅰ型胶原,与对照组比较有统计学意义(p＜0.05);ALP活性检测试剂盒检测各组细胞不同时段的ALP活性发现实验组较对照组高(p＜0.05);且随着培养时间的增长实验组ALP活性逐渐增强(组内p＜0.05),与对照组比较均有统计学意义(p＜0.05);经BCIP/NBTALP染色试剂盒检测,实验组细胞染色有棕黑色细微颗粒,多数分布在细胞膜上以及周围,对照组细胞染色无棕黑色颗粒出现:茜素红对连续培养3周的两组细胞进行钙结节染色发现实验组有较多橘红色结节,而对照组无明显发现。3、对提取的乳兔颅骨原代细胞茜素红染色后证实提取的细胞为成骨细胞。4、成脂检测指标:油红0染色显示实验组细胞内出现大量红染颗粒,对照组细胞未被红染;RT-PCR检测两组细胞PPARγmRNA的表达,实验组可见有PPARγmRNA表达,而对照组无PPARγmRNA的表达。结论:成熟脂肪细胞可以通过体外天花板培养实现去分化,去分化的脂肪细胞在成骨诱导环境下可以向成骨细胞分化;成骨细胞在成脂诱导环境下可以分化为脂肪细胞;成骨细胞和脂肪细胞在一定条件下可以相互转化。收起

关键词 : 脂肪细胞去分化成骨细胞横向分化

9. 唑来膦酸对骨质疏松大鼠成骨细胞的作用研究

[学位论文] 阳雪福建医科大学 2019年硕士导师: 骆凯共82页

摘要 : 妇女绝经后随着体内雌激素水平的下降易出现绝经后骨质疏松症（postmenopausalosteoporosis,PMO），双磷酸盐（bisphosphonate,BPs）是PMO的常用治疗药物。双膦酸盐相关性颌骨坏死（bisphosphonate-relatedosteonecrosisofthejaws,BRONJ）是BPs的严重... 展开妇女绝经后随着体内雌激素水平的下降易出现绝经后骨质疏松症（postmenopausalosteoporosis,PMO），双磷酸盐（bisphosphonate,BPs）是PMO的常用治疗药物。双膦酸盐相关性颌骨坏死（bisphosphonate-relatedosteonecrosisofthejaws,BRONJ）是BPs的严重并发症，但具体的病理生理机制还不清楚。牙周炎可引起牙槽骨的吸收破坏，最终导致牙齿松动丧失。近年来的研究表明牙周炎是BRONJ的危险因素，但具体的作用机制还有待阐明。目的通过体外分离培养颌骨成骨细胞（mandibleosteoblasts,MOBs）和股骨成骨细胞（femurosteoblasts,FOBs），比较不同胚层来源成骨细胞生物学行为的差异。通过构建绝经后骨质疏松（postmenopausalosteoporosis,PMO）大鼠模型，培养PMO大鼠MOBs和FOBs，并给予唑来膦酸（zoledronate,ZOL）刺激，比较ZOL对PMO状态下不同胚层来源成骨细胞生物学行为的影响。对PMO大鼠MOBs分别给予ZOL及牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide,P.gingivalisLPS）刺激，探讨在P.gingivalisLPS作用下ZOL对骨质疏松大鼠MOBs成骨和破骨及成血管调控相关基因表达的影响。方法 1.体外分离培养大鼠MOBs和FOBs，经流式细胞术进行细胞表面抗原鉴定，CCK-8（cellcountingkit-8）比较细胞的增殖能力。2.成骨诱导后，通过碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）染色与活性检测、矿化结节染色及定量分析，以及实时荧光定量聚合酶链反应（real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR）检测成骨相关基因表达，比较大鼠MOBs和FOBs的成骨分化能力。3.通过Real-timePCR和酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）比较大鼠MOBs和FOBs表达成血管相关因子的能力。4.通过Real-timePCR、蛋白免疫印迹（WesternBlot,WB）比较人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）经大鼠MOBs和FOBs的上清液刺激后成血管相关基因和蛋白的表达，并通过CCK-8、划痕试验、Transwell小室及成管试验比较HUVECs经两种细胞上清液刺激后的相关功能变化。5.采用双侧卵巢切除术建立大鼠PMO模型，分离培养PMO大鼠MOBs和FOBs，经ZOL作用后检测两种细胞的增殖能力及成骨和破骨、成血管调控相关基因的表达情况。6.采用ZOL和P.gingivalisLPS刺激PMO大鼠MOBs，检测细胞中成骨和破骨及成血管调控相关基因的表达情况。结果 1.大鼠MOBs和FOBs在形态上无明显区别，流式细胞术检测结果均为CD31和CD45阴性，但MOBs的增殖能力较FOBs强。2.经成骨诱导后，FOBs表现出较MOBs更强的ALP活性及矿化结节形成能力，且成骨相关基因Alpl、Runt转录相关因子2（runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、骨钙素（osteocalcin,Oc）、骨涎蛋白（bonesialoprotein,Bsp）的表达在FOBs中也更高。3.Real-timePCR和ELISA结果显示大鼠MOBs较FOBs表达更高水平的血管生成素-1（angiopontin-1,ANGPT1）、成纤维生长因子2（fibroblastgrowthfactor2,FGF2），而血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达较少，但FOBs的趋化因子配体9（chemokine(C-X-Cmotif)ligand9,CXCL9）表达更高。4.与FOBs的上清液刺激相比，HUVECs经大鼠MOBs的上清液刺激后，成血管相关因子如低氧诱导因子1α（hypoxia-induciblefactor-1alpha,HIF1A）、内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase,eNOS）、激酶结构域（kinasedomainregion,KDR）、内皮特异性受体酪氨酸激酶2（endothelial-specificreceptortyrosinekinase2,TIE2）的表达更高，且细胞的增殖、迁移和成管能力也更强。5.ZOL对MOBs和FOBs的增殖有抑制作用且呈剂量依赖性；MOBs较FOBs对ZOL的作用更为敏感，MOBs经10-5M的ZOL作用后细胞的成骨基因表达明显受抑制，而破骨与成血管调控相关基因表达显著增加。6.在P.gingivalisLPS作用下，经10-5M的ZOL刺激后，PMO大鼠MOBs的成骨相关基因表达进一步下调，而破骨与成血管调控相关基因表达水平则进一步增加。结论 1.不同胚层来源成骨细胞存在位点特异性差异，MOBs的增殖及促成血管能力较FOBs强，而FOBs的成骨分化能力更强。2.PMO大鼠的MOBs较FOBs对ZOL的刺激更为敏感。3.在P.gingivalisLPS作用下，ZOL对PMO大鼠MOBs的作用更加明显，在进一步抑制细胞成骨能力的同时，可进一步提高细胞的破骨及成血管调控能力。收起

关键词 : 骨质疏松成骨细胞唑来膦酸成骨分化

10. 不同浓度万古霉素对大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的影响

[学位论文] 黄俊中南大学 2009年硕士导师: 倪江东共34页

摘要 : 目的：研究大鼠脂肪干细胞（ADSCs）在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞及成脂细胞的能力，初步观察不同浓度万古霉素对其增殖、成骨分化的影响方法：将大鼠ADSCs放入成脂诱导液中培养，采用油红O染色观察其成脂分化能力；同时将大鼠ADSCs放入... 展开

关键词 : 脂肪干细胞万古霉素成骨分化成脂分化