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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:成骨不全症(Osteogenesis Imperfecta,OI)是以骨脆性增加、胶原代谢紊乱为特征的全身性遗传性结缔组织疾病。绝大多数OI患者是由于编码Ⅰ型胶原蛋白α1链(Collagen typeⅠα1chain,Col1α1)和α2链(Collagen typeⅠα2chain,Col1α2)的基因突变导... 展开 目的:成骨不全症(Osteogenesis Imperfecta,OI)是以骨脆性增加、胶原代谢紊乱为特征的全身性遗传性结缔组织疾病。绝大多数OI患者是由于编码Ⅰ型胶原蛋白α1链(Collagen typeⅠα1chain,Col1α1)和α2链(Collagen typeⅠα2chain,Col1α2)的基因突变导致的胶原代谢紊乱。根据OI的特征性临床表现分为5个亚型(1-5型),其临床特征主要包括骨量降低、反复骨折、骨骼畸形、牙本质发育不全、关节松弛、身材矮小。OI症状多于儿童时期开始出现,严重影响患者的生活质量,也给家庭和社会带来沉重的负担。 目前,针对OI尚缺乏有效的治愈手段,现行的临床治疗方案主要包括药物治疗、手术矫形、康复锻炼、分子与细胞治疗等。药物治疗为目前主要的治疗方式,其中以双膦酸盐(Bisphosphonates,BPs)的应用最为广泛。BPs是一种骨吸收抑制剂,在体内与骨基质中的羟基磷灰石相结合,通过抑制破骨细胞的活性来改善OI患者的骨骼结构。但BP的用药模式复杂,存在急性期反应(Acute phase response,APR)、非典型股骨骨折(Atypical femoral fracture,AFF)、下颌骨坏死(Osteonecrosis of the jaw,ONJ)、骨延迟愈合、肾功能损害、低钙血症等不良反应。地诺单抗(Denosumab)是一种特异性靶向核因κB受体活化因子配子(Receptor Activator of Nuclear Factor-κBLigand,RANKL)的抗体,能有效提高OI患者的骨密度,但儿童OI应用Denosumab治疗时有反跳性椎体骨折的发生。特立帕肽(Teriparatide)是目前唯一被FDA批准促进骨合成代谢的药物,能有效增加骨质疏松患者的骨密度、降低骨折风险,但对中重度OI患者的作用甚微并可能导致骨肉瘤的发生。雷奈酸锶(Strontium ranelate)具有抑制破骨和促进成骨的双重骨代谢调节作用,能有效降低OI模型鼠的骨折发生率,但该药由于存在增加心血管意外的风险面临退市可能。因此,有必要探索更有效、安全的OI治疗药物。 鸢尾素(Irisin)是一种N-糖基化的肌源性蛋白质激素,是由骨骼肌在运动激发下分泌释放。Irisin可通过激活Wnt/β-catenin信号通路途径促进成骨细胞分化,激活p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)诱导成骨细胞增殖、分化、和矿化。同时Irisin可通过抑制破骨细胞系(RAW264.7)的核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)抑制破骨细胞的形成。动物实验结果表明Irisin可增加皮质骨密度、增强骨骼强度和改善骨骼微结构,同时能有效改善后肢悬吊模型鼠的废用性骨质流失和肌肉萎缩。因此,我们推测同时具有促进成骨、抑制破骨效能的Irisin或可有效改善OI患者的临床症状。本课题拟以oim/oim小鼠(OI模型鼠)为研究对象,明确Irisin在胶原缺陷的背景下对oim/oim小鼠成骨细胞及破骨细胞的作用;进一步通过体内实验观察Irisin对OI模型鼠的治疗作用。 第一部分:Irisin在体外对OI模型鼠成骨细胞、破骨细胞的影响 方法:以纯合子oim/oim小鼠及野生型wt/wt小鼠的成骨前体细胞、骨髓单核细胞为研究对象,给予不同浓度(10、100ng/ml)的Irisin进行干预,采用实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别在mRNA及蛋白水平检测成骨、破骨细胞分化成熟变化,采用ALP染色及茜素红S染色观察成骨分化及矿化情况,采用Trap染色、免疫荧光染色及骨吸收功能检测评估破骨细胞形成数量及骨吸收活性。 结果:(1)qRT-PCR及蛋白质印迹法检测结果显示,Irisin在mRNA及蛋白水平均可促进oim/oim小鼠成骨细胞转录调节因子(Runx2)和分化标记基因(ALP、OCN和Col1α1),同时抑制破骨细胞分化相关基因及转录因子(Calcr、Trap、CTSK、c-fos、NFATc1)的表达。(2)ALP染色及茜素红S染色结果显示,Irisin可促进oim/oim小鼠成骨细胞分化及矿化。(3)Trap染色、免疫荧光染色及骨吸收功能检测结果显示,Irisin可降低oim/oim小鼠破骨细胞形成数量和破骨细胞骨吸收活性。 结论:Irisin可有效改善OI模型oim/oim小鼠的骨代谢失衡,在Ⅰ型胶原缺陷的背景下,Irisin同样可促进成骨细胞分化及矿化,并抑制破骨细胞的形成及骨吸收活性。 第二部分:Irisin对OI模型鼠的治疗作用 方法:(1)3周龄B6C3Fe-α/α-Collα2oim/+品系小鼠,按照基因型(oim/oim或wt/wt)及治疗方案(Irisin或Veh)随机分为4组:Oim+Veh组、Oim+Irisin组、Wt+Veh组和Wt+Irisin组。从第4周起,给予小鼠尾静脉注射Irisin(100μg/kg,1次/周)或等体积生理盐水(Veh)治疗8周。(2)动态测量体重、治疗后测量股骨长度用以评估生长发育情况。(3)治疗前后对oim/oim小鼠进行X线检查,进行骨折计数。(4)小鼠处死后,提取血清通过ELISA技术检测OCN、NTx和TRACP5b的活性。(5)实验结束后,分离小鼠左侧股骨进行Micro CT扫描并进行骨微结构分析。(6)取左侧胫骨进行动态骨形成分析。(7)分离右侧胫骨进行Trap染色和HE染色,并进行破骨细胞和成骨细胞计数。(8)取左侧股骨和骨折的股骨段,进一步进行生物力学分析。 结果:(1)Irisin的干预对oim/oim小鼠和wt/wt小鼠体重的变化和股骨长度均无显著影响。(2)Irisin可有效减少oim/oim小鼠的骨折发生。(3)ELISA结果提示Irisin可提高OI模型鼠的成骨相关标记物OCN血清水平,同时降低破骨相关标记物NTx和TRACP5b。(4)Micro CT结果提示Irisin可同时改善OI模型鼠的皮质骨和松质骨的骨微结构。(5)Irisin可通过提高BFR促进OI模型鼠的骨矿化沉积。(6)Irisin诱导OI模型鼠的成骨细胞形成并抑制破骨细胞形成。(7)Irisin通过提高结构特性、降低骨脆性来改善OI模型鼠的骨生物力学特性。 结论:Irisin可通过抑制骨吸收和维持骨形成的双重调节作用,对骨量、骨微结构和骨强度产生积极的改善作用,进而降低处于生长发育期OI模型鼠的骨折发生。 小结:本研究首次采用OI模型B6C3Fe-α/α-Collα2oim/+小鼠,通过体外、体内实验,证实Irisin通过促进成骨分化、矿化和抑制骨吸收的双重骨代谢调节作用,提高骨密度、改善骨微结构及骨生物力学特性,降低生长发育期OI模型鼠的骨折发生。 收起
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