摘要: 背景: 鸢尾素（irisin）是2012年首次发现的一种新型肌细胞因子，由跨膜蛋白Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5（fibronectintypeⅢdomaincontaining5，Fndc5）在特异性蛋白裂解酶作用下裂解产生。Irisin主要由运动诱导骨骼肌分泌，其通过促进白色脂肪组织中解偶... 展开 背景: 鸢尾素（irisin）是2012年首次发现的一种新型肌细胞因子，由跨膜蛋白Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5（fibronectintypeⅢdomaincontaining5，Fndc5）在特异性蛋白裂解酶作用下裂解产生。Irisin主要由运动诱导骨骼肌分泌，其通过促进白色脂肪组织中解偶联蛋白（uncouplingprotein1，UCP1）的表达，参与白色脂肪褐变反应，增加产热效应，参与机体的能量代谢。 目前的研究表明irisin可能介导了运动产生的积极效应，在维持机体的糖脂稳态和骨代谢平衡中发挥作用，具有重要的价值和应用前景。此外，也有研究发现irisin与炎症的发生、神经发育和抗衰老相关。但目前的研究内容较分散，缺乏系统性；且结果尚不一致，甚至相互矛盾。此外，目前的研究主要观察了外源性补充irisin对体内葡萄糖稳态、脂代谢和骨代谢异常等相关疾病的影响，而内源性irisin缺乏是否对机体代谢造成影响需要进一步的研究。在现有的研究中，irisin与生殖的关系尚未见报道。因此，本研究拟构建Fndc5基因敲除小鼠模型，系统性地观察内源性irisin缺乏对小鼠糖脂代谢、骨代谢和生殖功能的影响。初步探讨irisin在小鼠代谢中的作用和相关调控机制，为代谢综合征和生育力下降的治疗提供实验依据和新的策略。 第一章Fndc5敲基因鼠模型构建及表型观察 目的： 构建能稳定遗传的Fndc5敲基因小鼠模型，探讨内源性irisin缺乏对小鼠生存和生长发育的影响。 方法： 1.采用TALEN技术，造成Fndc5基因发生移码突变，构建Fndc5基因敲除小鼠模型，并建立能稳定遗传的F1代小鼠。2.采用DNA测序、RT-qPCR和Westernblot方法进一步验证敲基因小鼠体内Fndc5基因敲除效率。3.小鼠三周龄时剪鼠尾进行基因型鉴定。4.观察并记录小鼠出生至24周龄的体貌形态、生存情况和生长发育状况，绘制小鼠生存曲线和体重增长曲线。4.小鼠下丘脑组织进行转录组测序，分析生长发育、炎症反应和免疫反应相关基因的表达水平。5.采用ELISA方法检测小鼠血清中生长发育、炎症反应和免疫反应相关因子水平。 结果： 1.采用TALEN技术成功构建Fndc5基因敲除稳定遗传的F1代小鼠，并在mRNA水平和蛋白水平验证了敲基因鼠体内无Fndc5表达，血清中未检测到irisin存在。 2.Fndc5基因敲除小鼠死亡率明显增加，尤其以出生4周内死亡率增加更为显著，差异有统计学意义；此外，Fndc5基因敲除小鼠生长发育差，体重明显低于同龄野生型小鼠，差异有统计学意义。 3.小鼠下丘脑组织转录组测序结果显示，Fndc5基因敲除小鼠生长激素、胰岛素样生长因子结合蛋白、白细胞介素-1b、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-a的mRNA表达水平明显增加，免疫球蛋白mRNA表达水平明显下调，差异有统计学意义。 4.小鼠血清学检测结果显示，Fndc5基因敲除小鼠生长激素、胰岛素样生长因子结合蛋白、白细胞介素-1b、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-a的含量明显增加，而胰岛素样生长因子、IgA、IgM和IgG含量明显降低，差异有统计学意义。 结论： Fndc5敲基因鼠死亡率显著增加，生长发育差，体重明显降低。敲基因鼠体内生长激素轴代谢紊乱，提示irisin缺乏对小鼠生长发育的影响。此外，敲基因鼠体内促炎细胞因子表达增加，免疫球蛋白表达下降，提示内源性irisin缺乏可能导致小鼠炎症反应增加和免疫功能低下。 第二章Irisin对小鼠代谢的影响 目的： 探讨内源性irisin缺乏对小鼠糖脂代谢和骨代谢的影响。 方法： 1.将24周龄小鼠进行OGTT和ITT实验。2.小鼠断颈处死后留取脂肪组织进行准确称重（计算脂肪组织系数）及组织学检查。3.采用ELISA方法检测小鼠血清中空腹胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。4.收集小鼠胫骨和股骨标本，通过三点弯曲力学实验、Micro-CT扫描检测骨强度和骨密度等指标。5.采用特殊染色和免疫组化方法，分析成骨细胞和破骨细胞相关代谢指标。6.检测小鼠血清中骨代谢相关因子的含量。7.通过电化学发光法检测小鼠血清中促炎细胞因子水平。 结果： 1.Fndc5基因敲除小鼠糖耐量下降，胰岛素敏感性降低，出现胰岛素抵抗，差异有统计学意义。 2.Fndc5基因敲除小鼠出现高脂血症，表现为血清中低密度脂蛋白含量增加，高密度脂蛋白水平降低，差异有统计学意义。血清中甘油三酯和总胆固醇水平在敲基因鼠和野生型鼠间无明显差异。 3.Fndc5基因敲除小鼠脂肪组织褐变反应减弱，表现为白色脂肪组织系数升高、褐色脂肪组织系数降低，差异有统计学意义；脂肪组织切片显示敲基因鼠的白色脂肪细胞数量明显增加，体积显著增大，而褐色脂肪细胞区域面积明显减小，差异有统计学意义。 4.三点弯曲力学实验结果显示，Fndc5基因敲除小鼠骨强度显著下降，表现为最大弯曲载荷和刚性值明显下降，差异有统计学意义；最大弯曲位移值在敲基因鼠有下降趋势，但差异无统计学意义。 5.Micro-CT扫描结果显示，Fndc5基因敲除小鼠骨量明显下降，表现为皮质骨密度、骨小梁密度、骨体积分数和骨小梁数目显著降低，差异有统计学意义；而连接密度在敲基因鼠和野生型鼠间无明显差异。 6.基因敲除小鼠成骨细胞介导的骨形成反应无明显改变，甲苯胺蓝染色结果显示股骨表面成骨细胞数量和大小无明显变化；免疫组化结果也显示成骨细胞活性指标OPG和OCN蛋白表达在两组间无明显差异。然而，相比于野生型小鼠，敲基因鼠破骨细胞介导的骨吸收反应明显增强，TRAP染色结果表明，敲基因鼠破骨细胞数量明显增多，细胞明显增大，差异有统计学意义；此外，破骨细胞活性指标RANKL表达明显增加，差异有统计学意义。 7.敲基因鼠血清中OPG和OCN水平与野生型鼠无明显差异，而血清中TRAP含量却明显高于野生型，差异有统计学意义。 8.敲基因鼠血清中IL-6和TNF-a含量明显增加，差异有统计学意义；其余促炎细胞因子IFN-γ,IL-10,IL-12p70,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5和KC/GRO含量在两组间无明显差异。 结论： Fndc5基因敲除小鼠表现出糖耐量下降，胰岛素抵抗；脂肪褐变反应建托；骨强度和骨量明显下降，炎症反应增加。以上结果提示irisin缺乏的敲基因鼠处于代谢紊乱的状态。 第三章Irisin对小鼠生殖功能的影响及机制初探 目的： 初步探讨irisin对小鼠生殖功能的影响及可能调控机制。 方法： 1.将小鼠按照雌雄比例2：1合笼，进行繁殖实验；合笼次日检查阴栓，有阴栓的记为妊娠0d。合笼后每天称量并记录小鼠体重，并进行相关分娩检查（产仔或产后出血）；记录雌鼠产仔率、交配后产仔时间、平均每笼产仔数和胚胎存活率。2观察并记录小鼠阴道开口时间；小鼠阴道开口后行阴道细胞涂片，记录首次出现无核上皮和首次出现动情周期的时间。小鼠出现动情周期后，进行连续10日阴道细胞涂片，根据不同细胞所占比例判断小鼠所处动情阶段。3.检测小鼠下丘脑GnRH和垂体FSH、LHmRNA表达水平；采用ELISA检测小鼠血清中E2、T、P、FSH和LH水平。4.小鼠断颈处死后，收集双侧卵巢并精确称量；一侧卵巢用于提取RNA进行转录组测序，另一侧卵巢用于连续切片观察卵泡发育情况。5.采用pET28(+)-irisin重组质粒和大肠杆菌合成重组irisin，并鉴定重组irisin蛋白的功能。6.采用重组irisin处理人卵巢颗粒细胞，共设4组：空白对照组、irisin10nM组、irisin20nM组和irisin30nM组。细胞处理48小时后提取RNA和蛋白，采用RT-qPCR和Westernblot方法，检测类固醇激素合成相关基因（Akr1c18、Mamld1和Cyp19a1）在mRNA水平和蛋白水平的表达情况；同时检测细胞培养上清中E2、T和P的含量。7.采用Fndc5-siRNA（转染浓度100nM）转染人卵巢颗粒细胞48小时后，检测Akr1c18、Mamld1和Cyp19a1在mRNA水平和蛋白表达的水平，同时检测细胞培养上清中E2、T和P含量。 结果： 1.敲基因鼠阴道开口时间、首次出现无核角化上皮时间及首次出现动情周期时间明显延后，差异有统计学意义；敲基因鼠动情周期紊乱，表现为动情间期和动情前期延长，动情期明显缩短，差异有统计学意义。 2.敲基因鼠卵巢体积减小，卵巢系数明显降低，差异有统计学意义。 3.敲基因鼠卵巢中发育期卵泡数量明显减少，窦卵泡比例（窦卵泡数/总卵泡数）明显下降，差异有统计学意义。 4.敲基因鼠下丘脑GnRH和垂体FSH、LHmRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义；敲基因鼠血清中E2、FSH和LH水平下降，P水平增加，差异有统计学意义；T含量在两组间无明显差异。 5.Fndc5敲基因鼠生育力明显降低，表现为产仔率明显下降、平均产仔数减少、胚胎存活率显著降低、平均产仔时间明显延长，差异有统计学意义。 6.小鼠卵巢组织转录组测序结果表明，敲基因鼠卵巢中有2217个基因出现差异化表达，其中表达上调基因1790个，表达下调基因427个，差异有统计学意义。在表达下调的基因中，有28个基因参与类固醇激素的合成与代谢过程。 7.本研究合成的重组irisin能成功激活3T3-L1细胞中p38和ERK蛋白磷酸化，具有生物学活性，可用于后续实验。 8.采用重组irisin处理人卵巢颗粒细胞，在irisin30nM组，类固醇激素合成相关基因（Akr1c18、Mamld1和Cyp19a1）的mRNA和蛋白表达水平均明显升高，差异有统计学意义；此外，在irisin30nM组的细胞培养上清中E2含量明显增加，而P含量明显降低，差异有统计学意义。 9.采用Fndc5-siRNA转染人卵巢颗粒细胞后，Akr1c18、Mamld1和Cyp19a1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义；此外，细胞培养上清中E2水平下降，P水平升高，差异有统计学意义。 结论： Fndc5敲基因鼠动情周期紊乱、卵泡发育异常、体内性激素代谢失调，引起生育能力明显下降。Irisin通过影响类固醇激素合成相关基因的表达，影响体内性激素的合成与代谢，以上结果提示了irisin对小鼠生殖功能的积极作用。 收起