摘要: 妇女绝经后随着体内雌激素水平的下降易出现绝经后骨质疏松症（postmenopausalosteoporosis,PMO），双磷酸盐（bisphosphonate,BPs）是PMO的常用治疗药物。双膦酸盐相关性颌骨坏死（bisphosphonate-relatedosteonecrosisofthejaws,BRONJ）是BPs的严重... 展开 妇女绝经后随着体内雌激素水平的下降易出现绝经后骨质疏松症（postmenopausalosteoporosis,PMO），双磷酸盐（bisphosphonate,BPs）是PMO的常用治疗药物。双膦酸盐相关性颌骨坏死（bisphosphonate-relatedosteonecrosisofthejaws,BRONJ）是BPs的严重并发症，但具体的病理生理机制还不清楚。牙周炎可引起牙槽骨的吸收破坏，最终导致牙齿松动丧失。近年来的研究表明牙周炎是BRONJ的危险因素，但具体的作用机制还有待阐明。 目的 通过体外分离培养颌骨成骨细胞（mandibleosteoblasts,MOBs）和股骨成骨细胞（femurosteoblasts,FOBs），比较不同胚层来源成骨细胞生物学行为的差异。通过构建绝经后骨质疏松（postmenopausalosteoporosis,PMO）大鼠模型，培养PMO大鼠MOBs和FOBs，并给予唑来膦酸（zoledronate,ZOL）刺激，比较ZOL对PMO状态下不同胚层来源成骨细胞生物学行为的影响。对PMO大鼠MOBs分别给予ZOL及牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide,P.gingivalisLPS）刺激，探讨在P.gingivalisLPS作用下ZOL对骨质疏松大鼠MOBs成骨和破骨及成血管调控相关基因表达的影响。 方法 1.体外分离培养大鼠MOBs和FOBs，经流式细胞术进行细胞表面抗原鉴定，CCK-8（cellcountingkit-8）比较细胞的增殖能力。2.成骨诱导后，通过碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）染色与活性检测、矿化结节染色及定量分析，以及实时荧光定量聚合酶链反应（real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR）检测成骨相关基因表达，比较大鼠MOBs和FOBs的成骨分化能力。3.通过Real-timePCR和酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）比较大鼠MOBs和FOBs表达成血管相关因子的能力。4.通过Real-timePCR、蛋白免疫印迹（WesternBlot,WB）比较人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）经大鼠MOBs和FOBs的上清液刺激后成血管相关基因和蛋白的表达，并通过CCK-8、划痕试验、Transwell小室及成管试验比较HUVECs经两种细胞上清液刺激后的相关功能变化。5.采用双侧卵巢切除术建立大鼠PMO模型，分离培养PMO大鼠MOBs和FOBs，经ZOL作用后检测两种细胞的增殖能力及成骨和破骨、成血管调控相关基因的表达情况。6.采用ZOL和P.gingivalisLPS刺激PMO大鼠MOBs，检测细胞中成骨和破骨及成血管调控相关基因的表达情况。 结果 1.大鼠MOBs和FOBs在形态上无明显区别，流式细胞术检测结果均为CD31和CD45阴性，但MOBs的增殖能力较FOBs强。2.经成骨诱导后，FOBs表现出较MOBs更强的ALP活性及矿化结节形成能力，且成骨相关基因Alpl、Runt转录相关因子2（runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、骨钙素（osteocalcin,Oc）、骨涎蛋白（bonesialoprotein,Bsp）的表达在FOBs中也更高。3.Real-timePCR和ELISA结果显示大鼠MOBs较FOBs表达更高水平的血管生成素-1（angiopontin-1,ANGPT1）、成纤维生长因子2（fibroblastgrowthfactor2,FGF2），而血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达较少，但FOBs的趋化因子配体9（chemokine(C-X-Cmotif)ligand9,CXCL9）表达更高。4.与FOBs的上清液刺激相比，HUVECs经大鼠MOBs的上清液刺激后，成血管相关因子如低氧诱导因子1α（hypoxia-induciblefactor-1alpha,HIF1A）、内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase,eNOS）、激酶结构域（kinasedomainregion,KDR）、内皮特异性受体酪氨酸激酶2（endothelial-specificreceptortyrosinekinase2,TIE2）的表达更高，且细胞的增殖、迁移和成管能力也更强。5.ZOL对MOBs和FOBs的增殖有抑制作用且呈剂量依赖性；MOBs较FOBs对ZOL的作用更为敏感，MOBs经10-5M的ZOL作用后细胞的成骨基因表达明显受抑制，而破骨与成血管调控相关基因表达显著增加。6.在P.gingivalisLPS作用下，经10-5M的ZOL刺激后，PMO大鼠MOBs的成骨相关基因表达进一步下调，而破骨与成血管调控相关基因表达水平则进一步增加。 结论 1.不同胚层来源成骨细胞存在位点特异性差异，MOBs的增殖及促成血管能力较FOBs强，而FOBs的成骨分化能力更强。2.PMO大鼠的MOBs较FOBs对ZOL的刺激更为敏感。3.在P.gingivalisLPS作用下，ZOL对PMO大鼠MOBs的作用更加明显，在进一步抑制细胞成骨能力的同时，可进一步提高细胞的破骨及成血管调控能力。 收起