摘要: 骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种严重威胁中老年人群的常见病、多发病，特别是对于绝经后女性，其发生率高达74%，而OP又极易导致骨质疏松性压缩骨折（Osteoporoticcompressionfracture,OCF）。脊柱是OCF最易发生的部位，我国每年新发椎体OCF高达... 展开 骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种严重威胁中老年人群的常见病、多发病，特别是对于绝经后女性，其发生率高达74%，而OP又极易导致骨质疏松性压缩骨折（Osteoporoticcompressionfracture,OCF）。脊柱是OCF最易发生的部位，我国每年新发椎体OCF高达181万例。更为严重的是，对于重度椎体OCF的患者，由于其骨质严重疏松，椎体高度丢失及骨质缺损范围大，常规椎体成形术及后凸成形术等治疗方法无法恢复椎体高度及脊柱完整性。现有治疗方法仍存在严重不足，首先是对于椎体如此大范围缺损，自体骨量难以满足；其次椎体替代物和自体骨相比无骨整合作用；更重要的是，由于机体严重骨质疏松，使得修复效果明显下降。因此，探寻一种既可以修复骨缺损，又有一定抗骨质疏松作用的椎体替代物具有重要临床意义。 唑来膦酸（zoledronicacid，ZOL）是含氮三代双膦酸盐，对高代谢骨具有极强的特异性，目前临床应用主要针对恶性肿瘤溶骨性骨转移引起的骨痛及恶性肿瘤引起的高钙血症的治疗。众多学者关于唑来膦酸的动物实验表明，唑来膦酸在高代谢骨组织表面附着沉积，起到抑制破骨因子对骨的侵蚀、改变成骨-破骨稳态向成骨方向偏移的作用，从而抑制骨吸收，但其应用上仍存在缺陷：首先其全身应用的副作用较大，主要表现为肌痛、骨痛、重度流感样症状，亦可引起低钙血症、下颌骨坏死等副作用；其次，现阶段唑来膦酸对于特定部位骨质疏松骨缺损不能靶向给药，不能缓释给药。 因此，我们提出课题假设：通过“唑来膦酸纳米微球（ZOL-NPs）”复合“EBM多孔钛合金支架”，改进目前临床广泛使用的常规椎体替代物材料，以期能够构建一种新型的，既有良好的生物力学特性和骨缺损修复特性，又具有一定抗骨质疏松作用的多孔钛合金支架。 研究目的： 构建一种具有“符合椎体特性、利于缺损修复、治疗骨质疏松”的新型多功能多孔钛合金支架，为OP椎体缺损的临床治疗提供新思路、新方法。 研究方法： 1．新型ZOL-NPs多孔钛合金支架优化构建和载药释放规律研究：（1）制备明胶纳米微球作为ZOL的载体，扫描电镜（SEM）和纳米粒径分析仪检测明胶纳米微球的表观学特征和粒径；（2）使用电子束熔融（EBM）技术制备可应用于兔腰椎实验的多孔钛合金支架；（3）通过冻干法将ZOL-NPs均匀修饰于多孔钛合金支架表面及内部，通过生物力学测试分析ZOL-NPs多孔钛合金支架的力学性能，通过高效液相色谱法（HPLC）研究ZOL-NPs多孔钛合金支架载药释放规律。 2．不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞影响的体外研究：（1）通过细胞复合支架法，将成骨细胞接种至不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架（0μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，500μmol/L）；（2）通过扫描电镜（SEM）检测不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞粘附和生长形态的影响；（3）通过CCK-8法检测不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞早期增殖的影响；（4）通过ALP染色法检测不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞早期分化的影响；（5）流式细胞检测技术检测不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞凋亡的影响；（6）RT-PCR技术检测各组ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞成骨相关基因的表达影响。 3．不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架修复OP椎体缺损动物模型研究：（1）采用“双侧卵巢去势法”构建新西兰大白兔骨质疏松模型，在此基础上通过腹膜外入路切除新西兰大白兔腰椎椎体，构建OP椎体缺损模型；（2）将载有不同浓度ZOL-NPs的多孔钛合金支架（0μmol/L，10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L）植入OP新西兰大白兔椎体缺损处，不同时间点（4w，12w）处死动物取材，通过显微CT扫描和组织学染色检测骨长入和骨整合效果，通过有限元模拟生物力学测试评价ZOL-NPs多孔钛合金支架周围新生骨的生物力学。 研究结果： 1．新型ZOL-NPs多孔钛合金支架优化构建和载药释放规律研究：（1）成功制备明胶纳米微球，球形规整、分散均一，平均粒径为151.4±62.2nm，吸水膨胀后平均粒径为269.5±84.6nm；（2）成功制备多孔钛合金支架，生物力学测试显示其弹性模量为1.85GPa，与人骨松质骨相近，有效解决应力遮挡问题；（3）成功制备构建ZOL-NPs多孔钛合金支架，其载药量为0.285±0.038μmol，载药率71.3%；并得到其载药释放曲线。 2．不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞影响的体外研究：（1）SEM结果显示1μmol/L组与对照组ZOL-NPs多孔钛合金支架表面成骨细胞形态无明显差异；成骨细胞在10μmol/L、50μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架表面铺展形态较好，伪足伸展更充分；100μmol/L、500μmol/L组出现凋亡细胞，且总细胞数量明显低于其他各组。（2）第1天，1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架对成骨细胞增值有一定促进作用，但未发现明显统计学差异（P＞0.05），100μmol/L组对成骨细胞增殖表现出一定的抑制作用，但同样未发现统计学差异(P＜0.05)，而500μmol/L组表现出明显抑制作用（P＜0.05）。第4、7天，10μmol/L、50μmol/L组对成骨细胞增值存在明显促进作用（P＜0.05）,100μmol/L、500μmol/L组对成骨细胞增值表现出明显抑制作用（P＜0.05）。（3）1μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架第1，4，7d对成骨细胞分化有一定促进作用，但未见显著统计学差异（P＞0.05）；10μmol/L组在第7d对成骨细胞分化有显著性促进作用（P＜0.05）；50μmol/L组在1、4、7d均对成骨细胞分化有显著性促进作用（P＜0.05）；100μmol/L组第1，7d与对照组相比，对成骨细胞分化有明显抑制作用（P＜0.05），第4d虽然有抑制作用，但未见统计学差异（P＞0.05）;500μmol/L组在第1，4，7d对成骨细胞分化均有明显抑制作用（P＜0.05）。（4）1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架第7d细胞凋亡率(3.27%±0.79%，3.71%±0.82%，3.39%±0.52%)与对照组（5.71%±0.37%）相比有明显降低（P＜0.05）；100μmol/L、500μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架上细胞凋亡率（14.0%±1.64%，21.7%±1.41%）明显高于对照组（5.71%±0.37%）（P＜0.05）。（5）RT-PCR检测成骨相关基因表达，结果发现，各基因表达都与唑来膦酸浓度呈双向相关，基于各基因自身特点，具体表达量有所差异。在成骨细胞接种ZOL-NPs多孔钛合金支架72h后，Runx2、OPN在10μmol/L，50μmol/L组的表达量均较对照组产生明显的统计学高表达（P＜0.05）；而随着浓度进一步提高，在100μmol/L组表达减少，但未检测到显著性差异（P＞0.05）；500μmol/L组出现显著性表达抑制（P＜0.05）。同样的BMP-2、OCN均于培养后72h于10μmol/L，50μmol/L组高表达（P＜0.05），BMP-2和OCN于100μmol/L、500μmol/L组的表达显著性降低（P＜0.05）。 3．不同浓度ZOL-NPs多孔钛合金支架对OP椎体缺损动物模型的体内研究：（1）Micro-CT和组织学结果表明，术后4w、12w，大量新生骨在10μmol/L,50μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架周围形成，在骨小梁数量和质量上均优于对照组；100μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架周围见少量新生骨形成，周围骨组织骨小梁数量和质量上优于对照组(P＜0.05)；（2）有限元分析结果表明，10μmol/L、50μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架周围骨组织最大压缩强度显著高于对照组(P＜0.05)，而组间未见明显差异；100μmol/L组ZOL-NPs多孔钛合金支架周围骨组织最大压缩强度高于对照组（P＜0.05），同时低于10μmol/L、50μmol/L组（P＜0.05）。 小结： 新型ZOL-NPs多孔钛合金支架符合椎体生物力学特性，一定程度上解决普通金属植入物存在的应力遮挡问题；低浓度（10μmol/L,50μmol/L）ZOL-NPs多孔钛合金支架更有利于成骨细胞增殖分化，促进新生骨形成，具有局部抗骨质疏松作用。 收起