摘要: 目的： 1.观察乳兔原生破骨细胞及大鼠单核诱导破骨细胞（osteoclast)典型特点。 2.探究体外环境下ZOL(zoledronic acid,唑来膦酸）对成骨细胞（osteoblast)，巨噬细胞（Macrophage），骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖分化的影响。 3.探讨局部... 展开 目的： 1.观察乳兔原生破骨细胞及大鼠单核诱导破骨细胞（osteoclast)典型特点。 2.探究体外环境下ZOL(zoledronic acid,唑来膦酸）对成骨细胞（osteoblast)，巨噬细胞（Macrophage），骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖分化的影响。 3.探讨局部及全身运用唑来膦酸对SD大鼠骨缺损修复中成骨-破骨的影响 方法: 1.新生新西兰大白兔骨髓细胞培养法观察原生典型破骨细胞的形态；使用M-CSF（macrophage-stimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子）及RANKL（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，核因子κB受体活化因子配体）细胞因子诱导SD大鼠骨髓细胞形成破骨细胞并进行相关检测（HE染色，免疫荧光等）。 2.使用CollagenⅡ酶（二型胶原酶）消化新生2-4日龄SD大鼠颅顶前份骨块分离培养大鼠成骨细胞，使用不同浓度ZOL处理大鼠成骨细胞，CCK-8（cell counting kit-8,细胞增殖毒性检测试剂盒）检测其在空白及成骨诱导环境环境下增殖活力，进行ALP（alkaline phosphatase，碱性磷酸酶）染色检测其成骨差异。骨髓冲出法分离SD大鼠BMSC，取P3细胞进行CCK-8检测。 3.构建大鼠股骨远端缺损，模拟GBR（Guided Bone Regeneration，引导性骨再生）术式植入煅烧牛骨粉DBBM，局部和全身使用ZOL，收集术后2周，4周，8周样本，观察局部骨缺损愈合情况，使用micro-CT（Micro Cone Beam,小动物活体成像系统)观察骨缺损区域骨愈合情况，并分析相关骨参数；制取组织切片，进行HE染色（hemotoxylin and eosin staining苏木素-伊红染色），trap染色（tartrate-resistnt acid phosphatase staining，抗酒石酸酶碱性磷酸酶染色），masson三色染色，IHC（immunohistochemistry，免疫组化）分析骨愈合过程中的成骨差异及破骨细胞位点及数量差异和相关蛋白表达的时序改变；TEM（transmission electron microscopy，透射显微镜）观察骨愈合过程中骨材料-骨界面附近的典型结构：成骨细胞，破骨细胞，新骨等结构并进行分析。 结果： 1.成功分离新生新西兰大白兔2-4日龄长骨内破骨细胞，可见破骨细胞典型特点为细胞体型巨大，多核（4-100个），边界可有封闭环，trap染色阳性；诱导破骨细胞：形态不规则，多核（2-10个），胞浆嗜酸，trap染色阳性，体内部分区域溶酶体活性高。 2.ZOL在长时间刺激下（7d）0.5μg/ml-2μg/ml浓度下对成骨细胞生长具有抑制作用，在短时间（1d-3d）无明显影响。在0.5μg/ml-2μg/ml浓度下对其成骨活性有抑制作用（7d）。ZOL在较长时间刺激下（day5）1.0μg/ml-2.0μg/ml对巨噬细胞raw264.7生长具有抑制作用，且随浓度增高抑制作用增强，较短时间（3d）的刺激，无明显影响。ZOL在较长时间的刺激下（day5），0.5μg/ml-2μg/ml浓度下对BMSC生长具有抑制作用，较短时间(1d）无明显影响。 3.（1）体式显微镜观察术后4d-8d股骨缺损表面尚可见环状缺损，边缘尚清晰，2周时部分缺损被纤维状组织覆盖，4周缺损表面已完全修复。（2）Micro-CT显示术后2周时骨粉周围已有骨质形成，4周成骨较多，骨密度显示已于干骺端附近骨质密度类似，8周时已无明显差别，全身给药组与局部给药组均较空白组成骨较多，其中局部给药组更为明显；（3）①时序变化：1.Masson三色染色显示术后2周时骨缺损周围已有早期骨质形成，HE染色显示此时尚有大量成骨间质（内有丰富成骨细胞）存在于早期骨质和骨粉处，trap染色显示此时骨粉及新生骨周围可见大量破骨细胞分布，且主要位于成骨活跃的区域。2.4周时Masson染色显示骨缺损区已有大量成熟骨形成，HE染色显示此时骨缺损周围已无贴附骨表面的成骨细胞，trap染色显示此时破骨细胞稀少。3.8周时Masson染色显示骨缺损中央成骨略有减少，trap破骨细胞细胞稀少。②不同组别：1.Masson及HE染色显示4周时ZOL全身给药及局部给药较空白组成骨较多，且成骨前间质多于空白组。2.trap染色显示ZOL处理组（全身及局部给药）破骨细胞多于空白组。IHC显示：Runx2（runt-related transcription factor2）阳性细胞在早期成骨（2周-4周）阶段出现较多，多位于新骨周围，OP主要位于新骨表面周围的细胞中，后期主要出现在骨及间质中。 4.TEM下（实验组）破骨细胞典型形态：巨大，多核，线粒体与溶酶体发达；骨粉表面新骨直接与材料结合，成骨细胞内具有丰富的内质网，高尔基体，紧密贴附于骨表面分泌骨基质。 结论： 1.SD大鼠骨髓细胞诱导形成破骨细胞的形态和兔原代破骨细胞类似，均表现为多核，trap阳性的特点；形态上，诱导形成的破骨细胞不规则，核数少于原代破骨细胞。 2.体外环境中ZOL较长时间刺激下，对成骨细胞，巨噬细胞，骨髓间充质干细胞生长具有较强抑制作用。 3.在局部药物释放及全身给药环境下，唑来膦酸在骨缺损修复促进骨增量的同时也增加了破骨细胞的数量。 收起