摘要: 第一部分:局部冷热交替和注射无水乙醇致骨坏死修复机制的研究 目的: 探索局部冷热交替和注射无水乙醇致大鼠股骨髁发生骨坏死的可能,比较不同损伤方式致骨坏死后骨修复的差异,分析成骨/破骨活动在骨坏死修复过程中的作用。 方法: 30只成... 展开 第一部分:局部冷热交替和注射无水乙醇致骨坏死修复机制的研究 目的: 探索局部冷热交替和注射无水乙醇致大鼠股骨髁发生骨坏死的可能,比较不同损伤方式致骨坏死后骨修复的差异,分析成骨/破骨活动在骨坏死修复过程中的作用。 方法: 30只成年SD大鼠随机分成两组:一组通过采用液氮-恒温水交替方式在大鼠右侧股骨髁进行冷热损伤造模,另一组在右侧股骨髁采用局部注射无水乙醇的方式造模,左侧股骨髁设为正常对照组。术后8周处死实验动物获取股骨髁标本后,采用显微CT进行骨形态计量学分析,纳米压痕技术测定骨小梁微观力学特性,病理学观察并测定骨形成速率,ALP染色和TRAP染色鉴定成骨/破骨细胞并计数比较。 结果: 1.显微CT结果显示,与正常对照组相比,冷热损伤组骨矿密度(BMD)、骨体积分数(BVF)、骨小梁数量(Tb.N.)显著降低;无水乙醇组骨矿密度(BMD)、骨体积分数(BVF)、骨小梁厚度(Tb.Th.)显著增高。 2.病理学结果显示,在两种损伤组中均可见大量死骨形成,空骨陷窝明显,冷热损伤组骨小梁结构断裂紊乱,无水乙醇组坏死骨小梁结构完整并且周围可见大量新生骨。 3.四环素-钙黄绿素标记结果显示,与正常对照组相比,无水乙醇组骨形成率显著增高;而冷热损伤组无显著差异。 4.纳米压痕测定结果显示,与正常对照组相比,无水乙醇组骨小梁微观弹性模量和硬度无显著差异;而冷热损伤组显著降低。 5.成骨/破骨细胞计数结果显示,与正常对照组相比,无水乙醇组破骨细胞数量显著减少,而成骨细胞数量显著增加;冷热损伤组破骨细胞数量显著增加,成骨细胞数量无显著差异。 结论: 1.局部冷热交替损伤和注射无水乙醇均可以导致骨坏死发生。 2.局部冷热交替损伤致骨坏死修复时,破骨活动增强,骨小梁微观力学性能降低,呈破坏性修复。 3.局部注射无水乙醇致骨坏死修复时,成骨活动增强,破骨活动减弱,骨小梁微观力学性能升高,呈重建性修复。 第二部分:PLGA局部缓释唑来膦酸促进骨形成的研究 目的: 观察PLGA局部缓释唑来膦酸对骨组织代谢的影响,探讨双膦酸盐局部缓释调节成骨/破骨活性的机制。 方法: 40只成年SD大鼠随机分成四组:右侧股骨髁分别植入不同含量唑来膦酸的PLGA药棒:1.空白对照组(0μg);2.低剂量组(唑来膦酸3μg);3.中剂量组(唑来膦酸30μg);4.高剂量组(唑来膦酸300μg)。术后6周处死实验动物获取股骨髁标本后,采用显微CT进行骨形态计量学分析,病理学染色观察骨形成情况,ALP染色和 TRAP染色鉴定成骨/破骨细胞并计数比较,免疫组织化学染色分析骨形成相关因子表达。 结果: 1.显微CT结果显示,在中剂量组和高剂量组中,股骨髁骨骺近端可见大量矿化组织形成。三种剂量唑来膦酸缓释组中的平均骨矿密度(BMD)和骨体积分数(BVF)都显著高于空白对照组。中剂量组和高剂量组中骨小梁平均厚度(Tb.Th.)显著高于低剂量组和空白对照组。 2.病理学结果显示,在中剂量组和高剂量组中,大量新生骨组织形成,但是骨小梁板层结构不明显,排列结构紊乱,呈不成熟新生网织骨表现。 3.成骨/破骨细胞计数结果显示,与空白对照组相比,中剂量组和高剂量组中破骨细胞数量显著减少,成骨细胞数量显著增加。 4.免疫组织化学结果显示,与空白对照组相比,中剂量组和高剂量组中骨形成相关因子:骨形态蛋白2(BMP2),骨钙蛋白(OCN),骨形态蛋白7(BMP7),Ⅰ型胶原(ColⅠ)和Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达均显著增高。 结论: 1.PLGA缓释唑来膦酸能够促进局部骨组织形成,但是新生骨组织病理学表现为不成熟的网织骨。 2.PLAG缓释不同浓度的唑来膦酸能够抑制局部破骨细胞介导的破骨活动,促进成骨细胞介导的成骨活动。 3.PLAG缓释不同浓度的唑来膦酸能够促进局部骨形成相关因子的表达。 第三部分:复合唑来膦酸脱细胞骨基质的制备及对体外培养成骨/破骨细胞的影响 目的: 利用唑来膦酸对骨组织的高亲和性,将不同浓度唑来膦酸与脱细胞骨基质复合,观察其对体外成骨/破骨细胞共培养体系的影响。 方法: 采用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)去污剂方法制备猪脱细胞松质骨骨基质,将脱细胞骨基质浸润于不同浓度的唑来膦酸溶液(空白对照组、10-5M组、10-6M组和10-7M组)24小时,使唑来膦酸与脱细胞骨基质进行复合。采用核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)体外建立大鼠成骨/破骨细胞共培养体系,与复合唑来膦酸的脱细胞骨基质联合培养7天后,ALP染色和TRAP染色鉴定成骨/破骨细胞并计数比较,实时定量qRT-PCR和蛋白印迹法Western blot分析成骨/破骨相关基因和蛋白的表达。 结果: 1.TRAP染色破骨细胞计数结果显示,与空白对照组相比,复合不同浓度的脱细胞骨基质均能显著抑制破骨细胞的形成。 2.ALP染色成骨细胞计数结果显示,与空白对照组相比,复合不同浓度的脱细胞骨基质均能显著促进成骨细胞的形成。 3.qRT-PCR结果显示,与空白对照组相比,高浓度和中浓度组中RANK基因表达显著降低,低浓度组中RANKL基因表达显著降低,三组实验组中OPG基因表达均显著增高。 4.Western blot结果显示,与空白对照组相比,高浓度和中浓度组中RANK因子表达显著降低,中浓度组中RANKL因子表达增高,低浓度组中RANKL因子表达显著降低,三组实验组中OPG因子表达均显著增高。 结论: 1.复合唑来膦酸脱细胞骨基质可以有效在体外抑制破骨细胞的增殖和分化。 2.复合唑来膦酸脱细胞骨基质可以有效在体外促进成骨细胞的增殖。 3.复合唑来膦酸脱细胞骨基质可以升高成骨-破骨共培养体系中OPG/RANKL比率。 第四部分:复合唑来膦酸脱细胞骨基质促进局部骨形成的研究 目的: 观察复合唑来膦酸脱细胞骨基质对体内骨组织代谢的影响,探索通过复合双膦酸盐调节成骨/破骨活性防止移植骨吸收,促进宿主骨形成的可能方法。 方法: 40只成年SD大鼠随机分成四组,将复合不同浓度唑来膦酸猪脱细胞骨基质(空白对照组、10-5M组、10-6M组和10-7M组)植入大鼠胫骨近端预制骨隧道,术后8周处死实验动物获取胫骨近端标本后,采用显微CT分别对移植骨和宿主骨进行骨形态计量学分析,纳米压痕技术测定骨小梁微观力学特性,病理学观察骨吸收和新骨形成情况,ALP染色和 TRAP染色鉴定成骨/破骨细胞并计数比较。 结果: 1.显微CT结果显示,空白对照组中移植的脱细胞骨基质结构模糊,高浓度组和中浓度组中移植骨边界清楚且小梁结构完整,低浓度组中移植骨部分小梁结构不清。与空白对照组相比,高浓度组和中浓度组胫骨近端和移植骨周围可见大量高密度组织生成。 2.骨形态计量学分析显示,与空白对照组相比,在高浓度组和中浓度组中胫骨近端宿主骨骨矿密度(BMD)、骨体积分数(BVF)、骨小梁数量(Tb.N.)显著增高,骨小梁厚度(Tb.Th.)和骨小梁间隙(Tb.Sp.)显著降低;高浓度组和中浓度组中移植骨骨矿密度(BMD)显著高于对照组,三组实验组中移植骨骨体积分数(BVF)和骨小梁数量(Tb.N.)均显著高于对照组,而骨小梁厚度(Tb.Th.)却显著低于对照组,骨小梁间隙(Tb.Sp.)四组间无显著差异。 3.对于胫骨近端宿主骨病理学观察结果显示,在高浓度组和中浓度组中胫骨近端和移植骨周围可见大量新生骨组织。对于移植骨病理学观察结果显示,在空白对照组中可见骨小梁断裂且结构紊乱;在高浓度组和中浓度组中骨小梁结构完整排列有序,移植骨与宿主骨之间存在明显界限,被大量纤维组织填充;在低浓度组中部分骨小梁结构完整,少量纤维组织填充。 4.对于胫骨近端宿主骨骨小梁纳米压痕测定结果显示,与空白对照组相比,三组实验组中宿主骨骨小梁弹性模量和硬度均显著降低。对于移植骨骨小梁纳米压痕测定结果显示,三组实验组移植骨骨小梁弹性模量和硬度均显著高于空白对照组。 5.破骨细胞计数结果显示,高浓度和中浓度组胫骨近端宿主骨周围破骨细胞数量显著少于空白对照组;三组实验组中移植骨周围破骨细胞数量均显著少于空白对照组。 6.成骨细胞计数结果显示,三组实验组中胫骨近端宿主骨周围成骨细胞数量显著多于空白对照组;低浓度组中移植骨周围成骨细胞数量显著多于空白对照组。 结论: 1.复合唑来膦酸能够有效维持脱细胞骨基质植入后骨矿密度、骨体积分数和微观力学特性。 2.复合唑来膦酸脱细胞骨基质能够促进局部骨形成。 3.复合唑来膦酸脱细胞骨基质能够抑制局部破骨细胞活动,促进成骨细胞活动。 收起