摘要: 目的: 锂盐是一种人体非必须的微量元素。锂盐可独立影响骨代谢，并增加骨密度，降低骨折风险。有研究表明，氯化锂可促进骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞等干细胞的成骨作用。并且，也有动物实验表明氯化锂作用于骨折模型小鼠和腭中缝扩大后的大鼠... 展开 目的: 锂盐是一种人体非必须的微量元素。锂盐可独立影响骨代谢，并增加骨密度，降低骨折风险。有研究表明，氯化锂可促进骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞等干细胞的成骨作用。并且，也有动物实验表明氯化锂作用于骨折模型小鼠和腭中缝扩大后的大鼠，其新骨形成都有所增加。然而，氯化锂是否能促进成骨细胞成骨分化还存在争议。目前，国内外对氯化锂在钛片表面复合培养成骨细胞后其生长情况、分化成骨及其作用机制的研究报道比较少见。 本研究探索不同时间点不同浓度氯化锂对钛片上成骨细胞增殖和成骨分化的影响，为进一步的动物实验及临床实验提供基础。 方法: 1.将实验所用钛片进行粗化处理，再将成骨细胞接种于钛片上，进行体外复合培养。将实验分成5个组，实验组4个即氯化锂组（2.5 mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L）和空白组对照组（未加氯化锂组）。 2.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。用CCK8法检测各组在第1天至第4天各时间点在450nm波长时的吸光度值，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞增殖的影响。结果进行统计分析。 3.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定各组细胞在第4天和第8天时ALP的活性，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 4.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用ELISA OC试剂盒检测第6天和第12天各组OC的分泌表达，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 5.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用实时荧光定量PCR法，检测第6天各组成骨细胞OC mRNA、Runx2mRNA和COL-ⅠmRNA的基因表达，评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。 6.将MC3T3-E1成骨细胞接种在钛片上培养，分别用含不同浓度氯化锂的培养基进行培养。采用Western-blot法观察各组Runx2和COL-Ⅰ蛋白条带。评价不同浓度氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，评价各个蛋白条带变化。 结果: 1.成骨细胞MC3T3-E1在钛片表面第1天至第4天的CCK8吸光值（OD值），间接反映了细胞的增殖情况。在第1天各种浓度氯化锂组OD值无明显变化;在第2天时，2.5mmol/L氯化锂组OD值比空白组大，5mmol/L和10mmol/L氯化锂组OD分别都小于空白对照组，但三组数据与空白对照组比较，差异均无统计学意义(p＞0.05);20mmol/L氯化锂组OD值比空白组小(p＜0.05)，差异有统计学意义，说明20mmol/L氯化锂浓度起到了抑制作用。不同浓度氯化锂组处理MC3T3-E1细胞第3天与第4天后，其中2.5mmol/L氯化锂组与空白对照组相比OD值大(p＜0.05)，说明该浓度促进了MC3T3-E1细胞增殖(p＜0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化锂组OD值均小于空白对照组(p＜0.05)，说明这两个浓度抑制细胞增殖作用，且随着浓度增大抑制作用呈递增趋势。5mmol/L氯化锂组比空白对照组OD值小但差异无统计学意义(p＞0.05)，说明该浓度对细胞增殖无明显作用。 2.各浓度氯化锂组在第4天和第8天对MC3T3-E1细胞ALP活性检测结果显示，仅10mmol/L和20mmol/L氯化锂组检测结果高于空白对照组，均有统计学差异(p＜0.05)，且随着浓度增大促进作用呈递增趋势。2.5mmol/L和5mmol/L氯化锂组结果高于与空白对照组但差异无统计学意义(p＞0.05)。 3.各浓度氯化锂组在第6天与第12天对MC3T3-E1细胞的骨钙素表达量进行检测。5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L氯化锂组检测结果均小于空白对照组，且均有统计学差异(p＜0.05)。2.5mmol/L和氯化锂组与空白组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。 4.各浓度氯化锂组在第6天对Runx2mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表达进行检测，结果显示在2.5mmol/L氯化锂组Runx2mRNA、COL-Ⅰ RNA基因及OC mRNA的表达水平低于空白对照组，但无显著性差异(p＞0.05)。在5mmol/L氯化锂组COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表达低于空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明对COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表达起到了抑制作用。但此浓度Runx2 mRNA表达低于与空白对照组，差异无统计学意义(p＞0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化锂组Runx2 mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表达水平均低于空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。 5.根据western-blot的实验结果，在2.5mmol/L、5mmol/L氯化锂组中Runx2和COL-Ⅰ蛋白表达均低于空白对照组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。在10mmol/L、20mmol/L组氯化锂Runx2和COL-Ⅰ蛋白表达均低于与空白对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。 结论: 氯化锂在高浓度（10mmol/L和20mmol/L）抑制了成骨细胞成骨表达。在低浓度（2.5mmol/L和5mmol/L）则不影响成骨细胞成骨表达。低浓度氯化锂（2.5mmol/L）可促进成骨细胞的增殖。本研究结果提示，氯化锂的促成骨作用可能不是通过成骨细胞，其包含了其他不同的机制。使用氯化锂促成骨应该注意浓度剂量，以防止对成骨细胞的过度抑制从而影响成骨作用。 收起