摘要: 目的： 干细胞需要经历增殖、诱导分化的阶段，才能获得需要的生物表性，干细胞向成骨/成牙本质细胞谱系分化的前提是经过矿化诱导阶段。目前用于干细胞矿化诱导的矿化液种类较多，配方各异，各成分在某些配方中的添加浓度也有不同，最终的矿化诱导... 展开 目的： 干细胞需要经历增殖、诱导分化的阶段，才能获得需要的生物表性，干细胞向成骨/成牙本质细胞谱系分化的前提是经过矿化诱导阶段。目前用于干细胞矿化诱导的矿化液种类较多，配方各异，各成分在某些配方中的添加浓度也有不同，最终的矿化诱导效果有差异。近来有文献把KH2PO4作为矿化液的常规添加成分，与矿化诱导液其他成分共同起矿化诱导作用。与矿化诱导液其他的成分相比，KH2PO4的作用机制有待进一步阐明，它对各类干细胞是否具有广泛促矿化作用，也尚未见报道。根尖乳头干细胞(stemcells from apical papilla，SCAP)来源于根尖未发育完全的根尖乳头组织，是间充质干细胞的一种，被认为是牙再生组织工程重要的细胞来源，SCAP在矿化液诱导下可以向成骨/成牙本质细胞谱系分化。本研究选用SCAP作为含KH2PO4矿化液的矿化作用靶细胞，通过体外/体内实验，观察含KH2PO4矿化液对SCAP细胞增殖能力和成骨/成牙本质向分化能力的影响，试阐明KH2PO4在矿化液中的作用机理，以及与其他矿化诱导液诱导效能相比，矿化液中添加KH2PO4的优越性。 方法： 从根尖孔未发育完全、带有根尖乳头软组织的年轻恒牙，分离并提纯SCAP细胞，评价体内/体外SCAP细胞在两种不同矿化诱导液中的增殖和分化能力。 一、配置两种矿化诱导液，分别为含(MM2)/不含(MM1)KH2PO4(1.8mM)的两种矿化诱导液(50μg/mL抗坏血酸、10nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸)，L-DMEM培养液为对照组(Control组)，分别用于培养SCAP细胞。 二、体外实验，通过四唑盐比色实验(MTT)、流式细胞术(FCM)检测细胞周期，绘制生长曲线图和计算生长指数，评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外增殖能力:通过碱性磷酸酶(ALP)检测和茜素红钙结节染色，以及Westemblot和Real-timeRT-PCR分别从蛋白和基因水平检测相关矿化指标(DSP/DSPP，OCN/OCN)，评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外分化能力。 三、体内实验，从4-7dSD大鼠磨牙分离出SCAP细胞，经过两种不同矿化液诱导后，制成细胞团放入预先处理的大鼠切牙根片段，一同植入8-lOw的雌性大鼠肾被膜下。14d后，移植组织块回收，样本于4％福尔马林固定，脱钙，进行石蜡包埋，切片后分别做HE染色和免疫组织化学染色，检测成骨/成牙本质向分化相关蛋白(OCN，DSP)表达强度，比较SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体内分化能力。 结果： 一、体外实验:四唑盐比色实验和流式细胞术显示两矿化诱导液组SCAP细胞的增殖能力都增高，其中MM2组的SCAP细胞增殖能力高于MM1组。两矿化诱导液组的碱性磷酸酶活性均高于对照组，其中MM2组的碱性磷酸酶活性明显提高(P＜0.01)。MM2组与其余两组相比，表现出更多的钙结节沉积。WesternBlot及Real-timeRT-PCR结果显示:MM2组的SCAP细胞早期成骨/成牙本质向分化相关指标表达明显高于MM1组的SCAP细胞的表达(如:DSP/DSPP、OCN/OCN;P＜0.05)，进一步从蛋白和基因水平证实，加KH2PO4的矿化诱导液能促进SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力。 二、体内实验，肾被膜下移植的含SCAP细胞团牙根片段两周后回收，HE染色显示:各组牙根片段内都有牙髓样组织形成，对照组没有新的矿化组织形成，两矿化诱导液组在根管内都有新的矿化组织形成，而MM2组的SCAP细胞团形成更多的矿化组织:免疫组织化学检测样本DSP和OCN的表达，MM1组OCN表达呈弱阳性，DSP表达呈阳性;MM2组OCN表达呈阳性，DSP表达呈强阳性，MM2组目的蛋白的表达明显比MM1组表达强。与其余两组相比较，MM2组SCAP细胞团表达更多的成骨/成牙本质向分化相关蛋白。 结果显示，含KH2PO4的矿化诱导液培养的SCAP细胞增殖能力增强，成骨/成牙本质向分化相关蛋白的表达水平上调。 结论： 本研究表明，加KH2PO4的矿化诱导液能增强SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力:与其他矿化诱导液相比，含KH2PO4的矿化诱导液矿化效能更高;KH2PO4可能是一种方便，经济的干细胞矿化诱导剂成分。 收起