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排序：

[学位论文] 刘仕勇第三军医大学 2005年博士导师: 杨辉共133页

摘要 : 本文在使用不同浓度BMP4细胞因子及其拮抗剂-Noggin诱导SVZa神经干细胞增殖、分化的基础上，利用启动子活体荧光标记技术，动态地显示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb，OB)神经干细胞和祖细胞分化过程中的表达，同时使用Nestin增强子、酪氨酸羟化酶... 展开本文在使用不同浓度BMP4细胞因子及其拮抗剂-Noggin诱导SVZa神经干细胞增殖、分化的基础上，利用启动子活体荧光标记技术，动态地显示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb，OB)神经干细胞和祖细胞分化过程中的表达，同时使用Nestin增强子、酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)和GFAP启动子活体标记动态地显示SVZa神经干细胞的分化过程，结合原位杂交结果，探讨BMP4在SVZa神经干细胞增殖和分化过程中的作用。同时通过Mash1启动子活性分析探讨BMP4与Mash1转录因子的关系。主要结果如下： 1.原位杂交显示BMP4mRNA在新生小鼠的表达在SVZa到嗅球的迁移通路上，BMP4mRNA高表达于嗅球的周边细胞，而在嗅球的中心区表达较低。在SVZa区域，BMP4mRNA为中等量表达，细胞呈散在分布，在包绕SVZa的星形胶质细胞鞘中表达增高。在RMS中，BMP4mRNA的表达较为低下，仅见到极个别阳性细胞。此外，BMP4mRNA在与SVZa相邻的SVZp具有相当高的的表达。以上结果提示BMP4在SVZa神经干细胞发育不同部位发挥不同的生理作用。 2.BMP4启动子活性分析SVZa神经干细胞转染pDsRed-Bmp4pro质粒，贴壁分化12小时后见到极少量红色荧光细胞。24-48小时后SVZ神经干细胞培养孔中阳性细胞明显增多，荧光蛋白表达高峰期在48小时，48小时后减弱，5天后基本消失，早期(48小时内)红色荧光蛋白主要表达于神经元细胞，晚期则主要表达于星形胶质细胞。 SVZa、RMS和OB祖细胞分化过程中的荧光蛋白表达过程与SVZa神经干细胞相类似，但OB的阳性细胞明显较SVZa增多，且始终主要在神经元样细胞内表达，而RMS的阳性细胞较少。荧光分光光度计检测显示荧光强度由高到低依次为OB、SVZa和RMS。以上结果表明BMP4在SVZa神经干细胞迁移和分化的不同部位和不同时期存在差异表达，提示BMP4在SVZa神经干细胞发育的不同时期、不同部位发挥不同的生理作用。 3.BMP4对SVZa神经干细胞增殖的影响细胞计数结果显示在1、2、5ng/ml浓度时，BMP4促进神经干细胞的增殖，以2ng/ml浓度最明显；10、20、50、100ng/ml浓度时，BMP4抑制神经干细胞的增殖，浓度越高，抑制作用越明显。流式细胞仪周期分析结果表明，在1-5ng/ml浓度时，静止期细胞减少，DNA合成期细胞增加，仍以2ng/ml浓度明显；10-100ng/ml浓度时，静止期细胞大量增加，分裂期和S期细胞锐减。以上结果提示不同浓度的BMP4通过对细胞周期的调控影响SVZa神经干细胞的增殖，低浓度BMP4促进增殖，而高浓度BMP4则抑制其增殖。 4.BMP4对SVZa神经干细胞分化的影响加入不同浓度的BMP4，2天时行MAP-2和NSE免疫荧光染色，结果显示NSE阳性细胞均增多，流式细胞仪检测SVZa神经干细胞分化结果表明，1-100ng/ml浓度BMP4在2天时均可促进SVZa向神经元分化，1-10ng/ml时逐渐增加，10-100ng时处于一平台；在7天时行NSE免疫荧光染色，结果显示NSE阳性细胞均有所减少，流式细胞仪检测也得到相似的结果。加入10ng/ml浓度的BMP4，在不同时相点显示神经干细胞向神经元的分化，结果表明，BMP4在分化早期使神经元比例增高，2天时达到高峰，4天时与对照组持平，此后下降。以上结果提示BMP4对体外培养的SVZa神经干细胞具有双重作用，在干细胞分化的早期增加神经元分化比例，晚期则抑制神经元的分化。 5.Noggin对BMP4的拮抗作用转染PEGFP-Noggin质粒后加入不同浓度的BMP4，行NSE免疫荧光染色，结果显示Noggin能拮抗BMP4的作用，在早期使神经元数目减少，在晚期使神经元数目增多。流式细胞仪检测证实了免疫荧光染色结果。以上结果提示Noggin可佶抗BMP4的作用，在分化早期抑制神经元的分化，晚期促进神经元的分化。 6.BMP4影响SVZa神经干细胞分化的活体荧光标记SVZa神经干细胞转染Nestin-GFP质粒，贴壁分化8小时后即出现较多阳性细胞，24小时后达到高峰，此后减弱。加入10ng/mlBMP4后，阳性细胞大幅减少，在24-48小时内与对照组比较尤为明显，此后差异逐渐减小。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后1-3天内Nestin增强子活性明显减弱，而在4-7天内与对照组无统计学差异。转染TH-GFP质粒8小时后见到个别阳性细胞，此后逐渐增多，48-72小时达到高峰。加入10ng/mlBMP4后，TH阳性细胞有所增加，在24-48小时内与对照组比较有明显差异。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后在1、2和3天时与对照组存在差异，而在4天后无明显差异。 SVZa神经干细胞转染GFAP-GFP质粒，贴壁分化8小时后见到阳性细胞，此后逐渐增多。加入10ng/mlBMP4后，阳性细胞均有所增加。与Nestin-GFP和TH-GFP标记不同的是，GFAP启动子活性在观察期内持续增多。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后GFAP启动子活性在观察期内(1-7天)持续增多，均有统计学差异。以上结果表明在分化的早期，BMP4使神经干细胞标志物(Nestin)的表达减少，多巴胺神经元(TH)的标志物增多，即神经前体细胞减少，而成熟神经元增多，而在晚期却没有统计学差异，这显示BMP4只是加速了神经干细胞和组细胞的分化，并没有特异性地诱导SVZa神经干细胞向神经元分化。 7.BMP4对Mash1启动子活性的影响SVZa神经干细胞转染Mash1-LacZ质粒，贴壁分化后1天行X-gal染色即出现一些阳性细胞，主要在细胞核内出现，结合相差显微镜观察发现大多为神经元样细胞着色。加入10ng/ml的BMP4，在分化后1-2天内阳性细胞数有所增加，此后阳性细胞数增加不明显，4天后则有所减少。细胞计数结果表明，加入BMP4后在分化的早期增强Mash1启动子活性，1天和2天时与对照组存在统计学差异，在晚期有减弱Mash1启动子活性的趋势，但与对照组比较差异不显著。以上结果提示BMP4在SVZa神经干细胞分化的早期诱导了Mash1转录因子的产生。通过对以上结果的综合分析，结合参考文献，本研究尚得出以下结论：1.本研究中采用的启动子活体荧光标记实现了BMP4表达的活体追踪，能够反映正常情况下内在蛋白的表达情况，而且动态地显示了神经干细胞向多巴胺能神经元和星形胶质细胞的分化过程，显示其为一种较好的活体追踪方法。 2.BMP4启动子活性分析显示，在分化的晚期红色荧光蛋白主要在胶质细胞内表达，流式细胞仪检测在7天时发现BMP4抑制神经元的分化，而启动子活性分析显示BMP4持续性增加GFAP启动子活性，因此BMP4本身对SVZa神经干细胞的特异性作用可能仍然为抑制神经元的分化，促使其向星形胶质细胞分化。 3.在嗅球周边区域，原位杂交和启动子活性分析显示BMP4为高表达，体外培养显示高浓度的BMP4抑制干细胞的增殖，促使其退出细胞周期而分化，由于在嗅球主要为已定向的神经元祖细胞，因此BMP4在嗅球周边区域的主要作用可能是促使祖细胞退出细胞周期启动祖细胞的分化。 4.在RMS和嗅球中央区，原位杂交和启动子活性分析显示BMP4的表达量低，而低浓度的BMP4促进祖细胞的增殖，不断进入细胞周期，因此在此部位，BMP4的作用可能为促进其增殖，维持神经元祖细胞状态而不使其继续分化。5.在SVZa，原位杂交和启动子活性分析显示为中等量的表达，因此BMP4在SVZa可能具有更为复杂的作用，它既可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化，还可能具有促进干细胞退出细胞周期的作用。在SVZp，原位杂交显示为高丰度的BMP4mRNA，表明其可能主要促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。 6.BMP4在SVZa神经干细胞分化的早期通过诱导Mash1转录因子的产生参与神经元的分化。收起

关键词 : 室管膜下层神经干细胞祖细胞骨形成蛋白

2. 大鼠短暂性局灶性脑缺血后神经细胞再生、碱性成纤维细胞生长因子表达及其相互关系的研究

[学位论文] 周建平南京医科大学 2003年硕士导师: 韩群颖;王鹤鸣共59页

摘要 : 目的:通过建立大鼠短暂性局灶性脑缺血模型,观察大鼠短暂性局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下层和齿状回颗粒下层神经细胞再生(neurogenesis)及相关区域碱性成纤维细胞生长因子(gFGF)表达的时间规律,分析神经细胞再生与碱性成纤维细胞生长因子间的关系.结... 展开

关键词 : 短暂性局灶性脑缺血尾壳核神经细胞再生碱性成纤维细胞生长因子室管膜下层 S期细胞

3. 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响

[学位论文] 任秀君北京中医药大学 2007年博士导师: 图娅共254页

摘要 : 研究目的：高脂血症(hyperlipidemia，HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致，表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等，属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素，有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的... 展开研究目的：高脂血症(hyperlipidemia，HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致，表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等，属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素，有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。为了减少和延缓中风的发生，减轻中风后机体状态，从高血脂阶段早期进行针刺干预，是针刺防治中风的新视角，具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风，神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分，本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型，并观察针刺的影响，探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预，是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌，从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化，促进脑损伤的修复和再生。研究方法：应用大鼠喂养经典高脂饲料，化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组：正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针三阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组，先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型，治疗Ⅰ组电针三阴交、丰隆穴10天后，两组同时电针三阴交、丰隆穴，针刺人中、百会穴，7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj—l表达情况。用酶联免疫法(ELISA)检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)浓度。实验结论： 1.高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。 2.高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化，和右侧脑匀浆中NSE的表达，但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子，如NGF、BDNF、bFGF的分泌。 3.脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化，促进缺血侧脑组织中NSE的分泌，促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。 4.高血脂合并脑缺血，可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化，促进缺血侧脑组织NSE的分泌，降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌，减弱大脑的自我保护作用。 5.针刺“丰隆”、“三阴交”，可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C，升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化，和右侧脑组织中NSE的分泌，但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。 6.针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分，改善脑缺血状态，降低缺血侧NSE的分泌，增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化，促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。 7.针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分，改善脑缺血状态，可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化，降低缺血侧脑组织中NSE的分泌，促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。 8.从高血脂阶段积极介入针刺治疗，可更好、更有效地调节血脂水平，改善脑缺血状态，明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化，降低缺血侧大脑NSE的分泌，促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。 9.针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌，降低NSE分泌，促进神经干细胞的增殖、迁移和分化，从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示，神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后，神经营养因子含量的升高，往往同神经干细胞的增殖同时出现，所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明，针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌，从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化，尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤，促进神经元的修复与再生。收起

关键词 : 高血脂脑缺血神经干细胞神经营养因子室管膜下层电针疗法合并症

4. 通络救脑注射液促进去皮层血管大鼠室管膜下区（SVZ）细胞增殖、分化和迁移作用的研究

[学位论文] 黄兵北京中医药大学 2005年硕士导师: 司银楚共85页

摘要 : 目的.在本实验中采用免疫组织化学方法研究去皮层血管促进SVZ神经细胞祖细胞和胶质细胞祖细胞增生,分化并形成迁移路至损伤部位参与修复的机制.结论:去皮层血管损伤可以促进室管膜下层细胞增殖、分化,并形成一定的迁移路,直接或间接弥散到达损伤区,并... 展开

关键词 : 去大脑皮层血管神经干细胞室管膜下层通络救脑注射液细胞增殖免疫组织化学

5. 三七总皂甙对去皮层血管成年大鼠前脑神经干细胞及神经营养因子作用的实验研究

[学位论文] 程龙北京中医药大学 2003年博士导师: 朱培纯共94页

摘要 : 近年来大量研究证实，成年哺乳动物脑内仍保留着具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞，它们位于侧脑室的室管膜下层（subependymal ventrical zone,SVZ）和海马齿状回的颗粒细胞下层（subgranular zone,SGZ）.神经营养因子如bFGF、BDNF能促进神经... 展开

关键词 : 碱性成纤维细胞生长因子颗粒细胞下层脑源性神经营养因子去大脑皮层血管三七总皂甙神经干细胞室管膜下层