中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王郡合肥工业大学 2019年博士导师: 魏兆军共202页

摘要 : 甘草作为卫生部颁布的药食同源的资源之一，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等多种活性。本论文以甘草为材料，研究甘草黄酮的提取、分离纯化出甘草查尔酮A和甘草查尔酮B;明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡及其机理;最... 展开甘草作为卫生部颁布的药食同源的资源之一，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等多种活性。本论文以甘草为材料，研究甘草黄酮的提取、分离纯化出甘草查尔酮A和甘草查尔酮B;明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡及其机理;最后，利用转录组和miRNA组学技术，从mRNA和miRNA整体水平明确甘草查尔酮A和甘草查尔酮B处理对HepG2肝癌细胞的调控。研究结果明确了甘草查尔酮A和甘草查尔酮B的抗癌机制，为把甘草开发为特殊医学食品建立了基础。甘草黄酮提取条件的优化及其分离鉴定。利用超声波辅助提取甘草黄酮的工艺优化为:乙醇浓度64.38％、提取时间2.1h、超声功率112.42W、液料比30.15∶1;在该条件下最大提取率为6.56％。利用高速逆流色谱技术和硅胶柱层析技术分离纯化得到甘草查尔酮A和甘草查尔酮B。甘草查尔酮A诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其机理。以制备的甘草查尔酮A处理肝癌HepG2细胞，甘草查尔酮A能显著抑制HepG2细胞的增殖，24h的IC50为65.96μM。甘草查尔酮A阻滞细胞周期在G2/M期，诱导细胞凋亡，并引起细胞内ROS水平的上升。甘草查尔酮A处理后，细胞周期相关基因的表达量发生变化，Survivin、CyclinB1以及CDK1的表达量降低，Weel、p21、CyclinD1和JNK1的表达量上升。甘草查尔酮A通过调控死亡受体通路和线粒体等通路的基因表达诱导HepG2细胞的凋亡，甘草查尔酮A处理后上述通路中的DR3、DR5、Caspases3、Caspases8、Caspases10、Fas、Bad、Bax、Bcl-2、Bak和PUMA基因的表达显著上升，PKCε、p70S6K和Akt的表达下降。因此，甘草查尔酮A通过调控死亡受体信号通路、线粒体信号通路中相关基因的表达，促使HepG2细胞凋亡。甘草查尔酮B诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其机理。甘草查尔酮B对HepG2细胞的抑制能力低于甘草查尔酮A，24h的IC50为110.15μM。甘草查尔酮B阻滞细胞周期在G2/M期，诱导细胞凋亡，并引起细胞内ROS水平的上升。甘草查尔酮B处理后，细胞周期相关基因的表达量发生变化，CDK1、CyclinB1、CHK2、CDC14B和CDC7的mRNA表达下调，而ZBTB17、CDC20、PKMYT1、GADD45A、GADD45B、SFN、CDKNIC、p21和p53的表达显著上调。CyclinB1、p21、p53、CDK1和p-CHK2的蛋白表达与mRNA表达趋势一致。死亡受体途径的相关基因在mRNA水平(TNF、TNF-R1、Caspase8、Caspases 8、Fas、FasL、FOS、JUN)的表达以及在蛋白水平(TNF-R1、Fas、Caspases 8)的表达均上调。线粒体途径中，除Bcl-xl外，Bid、Bak、PUMA、DIABLO、ENdoG、Caspase9和Caspase3的mRNA和蛋白表达水平均增加。Caspases8和Caspase9的抑制剂可以抑制甘草查尔酮B诱导的细胞凋亡。甘草查尔酮B通过调控死亡受体信号通路、线粒体信号通路路中相关基因的表达，促使HepG2细胞凋亡。甘草查尔酮A、B处理对肝癌HepG2细胞mRNA整体水平的影响。依据前面得出的IC50值，用浓度为70μM的甘草查尔酮A以及浓度为120μM的甘草查尔酮B处理HepG2，利用转录组技术明确其mRNA水平差异表达谱。甘草查尔酮A处理24h后，HepG2细胞表达量上调的基因有3414个，下调基因有2647个。甘草查尔酮B处理24h后，HepG2细胞表达量上调基因有2928个，下调基因有2601个。甘草查尔酮A处理后的差异基因主要富集在MAPK信号通路、FoxO信号通路和p53信号通路。甘草查尔酮B处理的差异基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路。甘草查尔酮A、B处理对肝癌HepG2细胞miRNA整体水平研究的影响。利用浓度为70μM的甘草查尔酮A以及浓度为120μM的甘草查尔酮B处理肝癌细胞HepG2，调查miRNA整体水平的变化。甘草查尔酮A处理24h后的上调的miRNA有54个，下调的miRNA有48个。甘草查尔酮B处理24h后的上调miRNA有50个，下调的miRNA有42个。甘草查尔酮A处理诱导的差异表达的miRNA的靶基因主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路及Ras信号通路。甘草查尔酮B处理诱导的差异表达的miRNA的靶基因主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路以及Rap1信号通路。miRNA组学的结果与转录组表达谱的结果一致。收起

关键词 : 甘草查尔酮A 查尔酮B 分离纯化抗癌活性

2. 君子兰查尔酮合酶基因和查尔酮异构酶基因的克隆及功能验证

[学位论文] 刘玥吉林农业大学 2021年硕士导师: 赵春莉共74页

摘要 : 君子兰（Clivia miniata）是一种同时具有观叶、观花两种观赏特性的花卉，作为长春市的市花使其拥有更高的经济价值，其花大且花期长但花色单一，多数为橙红色，严重制约了其观赏价值与经济价值的增长，因此研究其花色形成的机制以期提高其观赏性显得... 展开君子兰（Clivia miniata）是一种同时具有观叶、观花两种观赏特性的花卉，作为长春市的市花使其拥有更高的经济价值，其花大且花期长但花色单一，多数为橙红色，严重制约了其观赏价值与经济价值的增长，因此研究其花色形成的机制以期提高其观赏性显得尤为重要。植物的多种花色主要由类黄酮决定，查尔酮合酶（Chalcone Synthase，CHS）以及查尔酮异构酶（Chalcone Isomerase，CHI）是类黄酮生物合成途径的关键酶，对合成花青素起着至关重要的作用。本试验以君子兰为试验材料，利用君子兰转录组数据库，采用PCR的方法，克隆君子兰CHS、CHI基因家族全长cDNA序列；采用生物信息学方法分析CmCHSs、CmCHIs基因的基本信息，预测其结构以及功能；采用RT-PCR方法对CmCHSs、CmCHIs基因的时空特异性进行分析，探究其对植物中类黄酮的积累作用；构建原核表达载体pET-32-CmCHS/CmCHI，制备重组蛋白进行体外酶活性测定；构建真核表达载体pBI121-CmCHI，转基因拟南芥突变体，探究其表型、花青素含量恢复情况；采用双分子荧光互补法以及Gal4:GUS系统，对CmCHIs家族蛋白是否可以互作进行验证。本研究通过对CmCHSs、CmCHIs基因的生物信息学、基因表达量、酶活功能等进行探究，研究君子兰中查尔酮合酶、查尔酮异构酶的结构及功能，为君子兰的遗传转化、花色改良奠定了理论基础。主要研究结果如下： 1.生物信息学分析（1）通过本地BLAST从君子兰转录组数据库中筛选得到4条潜在的查尔酮合酶基因以及3条潜在的查尔酮异构酶基因，分别命名为CmCHS1、CmCHS2、CmCHS3、CmCHS4，以及CmCHI1、CmCHI2和CmCHI3，克隆ORF（开放阅读框）全长，NCBI数据比对发现，与其他物种中的查尔酮合酶、查尔酮异构酶基因同源性较高。（2）氨基酸序列比对和系统进化树分析显示：CmCHS1、CmCHS2、CmCHS3、CmCHS4与其他物种中CHS聚在一支，具有CHS典型保守结构域；CmCHI1、CmCHI2与其他物种中Ⅰ型CHI聚在一支，具有CHI典型保守结构域，CmCHI3与Ⅳ型CHI聚在一支，不具有CHI氨基酸催化位点，可能不具有CHI的功能。（3）构建重组载体GFP-CmCHSs/CmCHIs亚细胞定位结果显示，GFP在细胞质中发出绿色荧光。 2.CmCHS、CmCHI基因家族的表达具有时空特异性。根据CmCHS和CmCHI基因cDNA全长序列，设计特异性引物，利用RT-PCR方法对CmCHS和CmCHI基因在主要着色组织和不同开花时期进行了表达量分析。结果显示CmCHS和CmCHI基因表达量在红色组织表达量高，绿色组织表达量低，在花朵开放四个阶段中，大部分在发育后期表达量高，且与花青素含量呈现正相关趋势。 3.CmCHS与CmCHI体外酶活性测定（1）成功构建原核表达载体pET-32-CmCHSs，诱导重组蛋白，体外酶活检测结果发现，CmCHS1-CmCHS4可催化底物香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成产物柚皮素查尔酮，CmCHSs均具有查尔酮合酶功能。（2）成功构建原核表达载体pET-32-CmCHIs，诱导重组蛋白，体外酶活检测结果发现，CmCHI1、CmCHI2可催化底物柚皮素查尔酮生成产物柚皮素，具有查尔酮异构酶活性，而CmCHI3反应体系中只发生自发反应，蛋白没有催化作用。 4.CmCHIs转基因功能验证成功构建真核表达载体，将重组质粒pBI121-CmCHIs（GV3101）转入拟南芥突变体中，T3代CmCHI1/I2转基因拟南芥表型以及种皮颜色恢复至与野生型相似，而CmCHI3转基因拟南芥表型、种皮颜色没有变化。证明CmCHI1/I2基因具有查尔酮异构酶功能，与花色形成有关。 5.CmCHIs蛋白互作通过双分子荧光互补以及Gal4:GUS系统试验验证CmCHIs三个蛋白的互作关系，结果表明，CmCHI1/I2/I3相互之间都能够产生互作，其中CmCHI3可能作为增强子，增强对花色苷合成基因的蛋白活性。收起

关键词 : 君子兰花色形成机制查尔酮合酶查尔酮异构酶基因克隆

3. 油茶查尔酮合酶和异构酶基因cDNA的鉴定和序列分析

[学位论文] 耿俊丽中南林业科技大学 2006年硕士导师: 谭晓风共45页

摘要 : 油茶为山茶属多年生常绿乔木，是我国独有的食用木本油料树种，广泛分布于湖南、江西、广西等17个省(市、自治区)，1100多个县(市)。黄酮类化合物系色原烷或色原酮的衍生物，是一类在高等植物中大量存在的重要的次生代谢产物。它们有很多重要的... 展开油茶为山茶属多年生常绿乔木，是我国独有的食用木本油料树种，广泛分布于湖南、江西、广西等17个省(市、自治区)，1100多个县(市)。黄酮类化合物系色原烷或色原酮的衍生物，是一类在高等植物中大量存在的重要的次生代谢产物。它们有很多重要的功能，例如，参与花色的形成、UV防护、抵抗病原体等等。目前研究表明，它们还与人类的健康有着密切的关系，具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用。查尔酮合成酶是所有黄酮类化合物合成的关键酶，它介导了黄酮类化合物合成的第一步，催化3个分子的丙二酞辅酶A与1个分子对羟基苯丙烯酞辅酶A缩合成袖皮素查尔酮，并以此为支架经由查尔酮异构酶的异构作用使其他黄酮类化合物得以衍生出来。本项研究以近成熟油茶种子构建的cDNA文库为基础，从中钓取经EST数据初步分析并推断可能是查尔酮合酶基因和查尔酮异构酶基因的5条cDNA序列进行研究，克隆号分别为1080、1279、4211、1216和1249。首先用微量碱裂解法提取5个克隆的质粒DNA，然后进行PCR扩增和测序鉴定。5个克隆均扩增出特异谱带，其中1216号克隆和1249号克隆的扩增片断为1000bp左右，初步判断为查尔酮异构酶基因序列；1080、1279和4211号克隆的推断片断大小依次为860bp、1030bp和1500bp左右，初步判断为查尔酮合酶基因序列或片断。选择4211号克隆和1216号克隆进行完整序列的测序，结果显示，4211号克隆cDNA全长序列为1523bp，经与核酸数据库进行比对分析，确定为查尔酮合酶基因；该基因编码412个氨基酸，起始密码子为GTG，终止密码子为TAA，是个完整的CDS。经网上比对，发现该cDNA序列比核酸数据库中最长的查尔酮合酶基因cDNA序列还要多69个碱基，是目前世界上发现的最长的查尔酮合酶基因。1216克隆为查尔酮异构酶基因的cDNA，拼接校对后的长度为1002bp，编码206个氨基酸，起始密码子为GTG，终止密码子为TAG，是查尔酮异构酶基因的完整CDS。两个基因克隆现保存在中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室。本文还对上述两个基因的结构特点、编码氨基酸序列及二级结构进行了初步分析和预测。收起

关键词 : 油茶查尔酮合酶查尔酮异构酶基因鉴定基因序列分析

4. 含三氮唑结构的查尔酮的合成及抑菌活性

[学位论文] 孙雨佳河北师范大学 2022年硕士导师: 张萍共205页

摘要 : 查尔酮是一类具有多种生物活性的化合物，其结构中的共轭体系可干扰细菌的DNA复制，从而对多种致病菌表现出良好的抗菌活性。三氮唑是含有三个氮原子的五元杂环化合物，环上的氮原子可与生物体内的多种靶点相结合，因而具有多种生物活性。同时，三氮唑... 展开查尔酮是一类具有多种生物活性的化合物，其结构中的共轭体系可干扰细菌的DNA复制，从而对多种致病菌表现出良好的抗菌活性。三氮唑是含有三个氮原子的五元杂环化合物，环上的氮原子可与生物体内的多种靶点相结合，因而具有多种生物活性。同时，三氮唑环在一般的水解、氧化、还原和酶的降解等反应条件下依然保持其良好的稳定性，是唑类化合物中稳定性最高的结构，从而成为修饰药物分子的重要药效团。基于查尔酮和三氮唑这两类结构单元优良的生物活性，如果能将二者拼接在一个分子中，有望扩展其生物活性谱，提高药效。本文以取代苯为起始原料，合成了36个含有三氮唑的查尔酮并测试了其抑菌活性。令人惊喜的是，所合成的36个目标物对真菌和细菌均具有一定程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抗菌效果尤为突出，远优于阳性对照盐酸环丙沙星。本论文的主要研究内容如下： 1.以取代苯为起始原料，经解聚。对其中最后一步曼尼希反应进行了详细深入的研究，分离得到反应过程中生成的三个新化合物，通过对新化合物结构的分析，对实验进行了改进，提高了目标物的产率，并提出了该曼尼希反应的历程。 2.以取代苯为起始原料，经F-C酰基化反应、α-H的溴代反应、亲核取代反应和曼尼希反应等四步反应合成了第二类18个查尔酮：1-芳基-2-(1H-1,2,3/2H-1,2,3/1H-1,2,4-三氮唑)-2-丙烯-1-酮(10a-10f、10′a-10′f和17a-17f)。 3.通过1HNMR、13CNMR、元素分析和X-射线单晶衍射等手段对所合成的新化合物进行了结构表征。 4.测试了目标物对新生隐球菌标准珠、新生隐球菌临床珠、白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，进行了构效关系的分析，筛选出了对真菌和细菌高度抑制的先导化合物。收起

关键词 : 查尔酮三氮唑抑菌活性

5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制

[学位论文] 李静华中农业大学 2009年硕士导师: 夏仁学共59页

摘要 : 类黄酮(Flavonoids)是柑橘果实中抗氧化活性成分的重要来源之一,研究其代谢机制及其合成途径中关键酶基因的表达模式对柑橘类黄酮的开发和利用至关重要。本文以红肉脐橙(Citrus sinensis cv.Cara caga)和‘国庆四号’温州蜜柑(Citrusreticulata Blanc... 展开类黄酮(Flavonoids)是柑橘果实中抗氧化活性成分的重要来源之一,研究其代谢机制及其合成途径中关键酶基因的表达模式对柑橘类黄酮的开发和利用至关重要。本文以红肉脐橙(Citrus sinensis cv.Cara caga)和‘国庆四号’温州蜜柑(Citrusreticulata Blanco cv.Guoqing NO.4)为试材,克隆类黄酮合成途径中的两个关键酶基因——查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI),应用real-time PCR技术检测其在果实成熟过程中及不同器官和组织中的相对表达量,结合总黄酮含量及主要类黄酮组分的变化,探讨了CHS和CHI基因的表达模式及其对类黄酮积累的调控机制。主要研究结果如下: 1、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中总黄酮及三种主要类黄酮组分含量的变化规律。无论是总黄酮还是反式查尔酮、橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷,它们在两品种果皮中的含量均远高于其在同时期果肉中的含量。随着果实的成熟,总黄酮在两品种果皮中的含量均逐渐下降,而在果肉中变幅较小且差异不显著(P<0.05)。三种类黄酮组分在红肉脐橙果皮和果肉中的含量变化基本一致,均呈双峰变化趋势,即三者含量均先逐渐上升至转色期(11月5日)前后达到其峰值而后逐渐下降,最后又有所升高。随着果实的成熟,三种类黄酮组分在‘国庆四号’温州蜜柑果皮和果肉中的含量均基本呈下降趋势,但在果肉完全成熟时(10月30日)又均有所升高,而果皮中橙皮苷和柚皮素-7-β-芸香糖苷的含量在转色之后的10月20日前后都有一个先显著下降、然后显著升高、再下降的过程(P<0.05)。 2、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)基因克隆及其序列分析。克隆的CHS和CHI基因碱基序列长度分别为1425 bp和731 bp,在GenBank中的登录号分别为FJ887897和FJ887898。序列分析结果显示,其开放读码框(ORF)分别为1176 bp(64～1239 bp,编码392个氨基酸)和669 bp(16～684 bp,编码223个氨基酸)。 3、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑果实成熟过程中CHS和CHI基因的相对表达量。CHS和CHI基因在红肉脐橙果皮中均基本呈下调表达趋势,但CHI基因的下调幅度较大；在果肉中均是转色期(11月5日)之后下调表达,之前略有下降但变化不显著(P<0.05)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中也均为下调表达,但CHS基因的下调幅度较大；两者在果肉中均基本呈上调表达趋势,但表达量起伏波动较大。 4、红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑不同器官和组织中的总黄酮含量及CHS和CHI基因的相对表达量。两品种总黄酮含量均是叶中最高、茎次之,根中含量最低,仅分别为其叶中总黄酮含量的7.0％和5.3％。CHS和CHI基因表达在两品种间的差异较大,两基因在红肉脐橙中均是叶中的相对表达量最低,分别为0.02和0.06(均以根中表达量为参照值),其中CHS基因在幼果果肉中的表达量最高(5.52)、茎次之(3.12),CHI基因则是根中最高(1.0)、茎次之(0.65)。两基因在‘国庆四号’温州蜜柑中的相对表达量则均是叶中最高(分别为7.86和2.39)、茎次之(分别为7.81和1.44),CHS和CHI基因在根(1.0)和幼果果肉(0.10)中的相对表达量最低。 5、CHS和CHI基因表达对类黄酮积累的调控机制。两品种果实成熟过程中,CHS与CHI基因表达高度相关,其相关系数在红肉脐橙中分别为0.90(果皮中)和0.96(果肉中),在‘国庆四号’温州蜜柑中分别为0.98(果皮中)和0.85(果肉中)。CHS、CHI基因表达与总黄酮含量也高度相关,在红肉脐橙果皮中分别为0.89(CHS)和0.81(CHI),在‘国庆四号’温州蜜柑果皮中分别为0.89(CHS)和0.95(CHI)。此外,两基因表达与‘国庆四号’温州蜜柑果皮中反式查尔酮含量变化的相关系数分别达到了0.94(CHS)和0.99(CHI),与另外两种类黄酮组分的相关性也均较高(r=0.62～0.78)。由此表明,CHS和CHI基因共同构成了柑橘类黄酮合成途径中的限速酶,直接参与类黄酮积累的调控,但由于柑橘果实中其它物质的成分也比较复杂(如糖、酸、类胡萝卜素等),两基因对其类黄酮积累的调控机制还不甚明朗。收起

关键词 : 柑橘类黄酮查尔酮合成酶查尔酮异构酶基因表达调控机制

6. 查尔酮缩氨基硫脲及氨基胍衍生物的合成及生物活性评价

[学位论文] 章虹佳南京大学 2012年硕士导师: 朱海亮共65页

摘要 : 很多具有查尔酮骨架的化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗寄生虫等多种生物活性，它们在化学界、医学家及药学界引起了广泛关注。其中，查尔酮的抗肿瘤活性表现出最为诱人的发展前景，其机制主要表现在抗血管生成以及抗微管蛋白聚合两个方面。同样，由于氨基... 展开很多具有查尔酮骨架的化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗寄生虫等多种生物活性，它们在化学界、医学家及药学界引起了广泛关注。其中，查尔酮的抗肿瘤活性表现出最为诱人的发展前景，其机制主要表现在抗血管生成以及抗微管蛋白聚合两个方面。同样，由于氨基硫脲和氨基胍化合物具有对人体低毒及较好的生物活性，从而也成为药物研究的一个热点。本论文设计合成了两个系列分别具有查尔酮氨基硫脲和查尔酮氨基胍基本骨架的新型化合物，并进行了系统的活性筛选和构效关系研究，其中多数化合物具有很好的EGFR抑制活性及抗tubulin聚合活性。根据基于结构设计的原理，借助于分子模拟计算技术，共设计合成了46个新化合物，并测试了所有化合物的生物活性，简述如下。 (1)合成了24个查尔酮氨基硫脲衍生物(4a-4x)，并测定了它们的EGFR抑制活性。首先借助于Autodock软件将不同取代的查尔酮化合物与EGFR蛋白分子进行模拟对接，得到对接的结合能以及抑制常数，并根据相互作用力和对接构象分析两者相互作用的分子机制。根据批量计算的结果筛选出其中24个化合物。其次分两步进行化学合成，第一步合成一系列不同取代的查尔酮化合物，第二步再与氨基硫脲接枝形成目标产物。然后对所有化合物进行结构鉴定，包括1H NMR、ESI-MS、元素分析以及晶体结构测定。最后对本系列化合物进行活性测定，主要包括抗HepG2增殖试验，EGFR抑制试验以及流式实验测试。结合分子模拟和生物活性筛选的结果，我们发现化合物4r对EGFR的抑制活性最好，IC50值为0.35μM，与阳性对照Erlotinib相当。 (2)合成了22个查尔酮氨基胍衍生物(5a-5v)，并测定了它们的抗tubulin聚合活性。首先借助于Autodock软件将不同取代的查尔酮化合物与tubulin蛋白分子进行模拟对接，得到对接的结合能以及抑制常数，并根据相互作用力和对接构象分析两者相互作用的分子机制。根据批量计算的结果筛选出其中22个化合物。其次分两步进行化学合成，第一步合成一系列不同取代的查尔酮化合物，第二步再与氨基胍接枝形成目标产物。然后对所有化合物进行结构鉴定，包括1H NMR、ESI-MS、元素分析以及晶体结构测定。最后对本系列化合物进行活性测定，主要包括抗MCF-7增殖试验，tubulin聚合活性测定，DAPI荧光染色试验以及细胞周期分析。结合分子模拟和生物活性筛选的结果，我们发现化合物5q抑制tubulin聚合的活性最好，IC50值为8.4±0.6 uM，与阳性对照colchicine相当。收起

关键词 : 化合物查尔酮氨基硫脲查尔酮氨基胍基本骨架合成工艺生物活性

7. 鬼箭锦鸡儿中查尔酮二聚体和查尔酮-异黄酮二聚体的抗炎活性研究

[学位论文] 王立娜天津大学 2019年硕士导师: 杨学东共131页

摘要 : 鬼箭锦鸡儿为豆科锦鸡儿属植物,别名鬼见愁、浪麻、腰冒、冠毛锦鸡儿等，藏文音译汉文名为“作毛兴”、“佐木兴”等。鬼箭锦鸡儿分布于中国青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、河北、山西、辽宁等省区，是主要生长在海拔3000?4700米的阴坡、半阴... 展开鬼箭锦鸡儿为豆科锦鸡儿属植物,别名鬼见愁、浪麻、腰冒、冠毛锦鸡儿等，藏文音译汉文名为“作毛兴”、“佐木兴”等。鬼箭锦鸡儿分布于中国青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、河北、山西、辽宁等省区，是主要生长在海拔3000?4700米的阴坡、半阴坡地带的落叶灌木。鬼箭锦鸡儿作为传统藏药藏锦鸡儿的主要基源植物，具有活血散瘀、凉血、降压、生肌止痛等功效，临床上与其它药物配伍用于治疗缺血性心脑血管病、高血压、多血症、月经不调等症。现代药理研究表明该植物具有抗炎、抗癌及抗病毒等活性。本论文在对锦鸡儿属植物的化学成分和药理活性进行综述的基础上，对该植物所含的两类特征成分，即查尔酮二聚体类和查尔酮—异黄酮二聚体类化合物的来源、药理活性以及生物合成途径进行了系统总结。对于鬼箭锦鸡儿二氯甲烷部分的化学成分，在前期研究工作的基础上开展了针对性分离工作，鉴定了分离得到的化合物，对分离得到的化合物进行了抗炎活性的测定与评价并对分离得到的新化合物的生物合成途径根据文献进行了合理的推测。在鬼箭锦鸡儿二氯甲烷萃取物化学成分研究中采用95%乙醇水溶液对鬼箭锦鸡儿红色木部心材粗粉进行回流提取，乙醇提取物水分散后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液浓缩后得到各萃取物。其中，二氯甲烷萃取物采用反相C18硅胶中压制备色谱进行分段分离，流动相为甲醇-水，梯度洗脱。中压制备色谱分离得到的各个部分在反相C18硅胶高压分析液相色谱上进行分离条件优化，将优化分离后的条件应用于制备型高压液相色谱，然后结合凝胶色谱法进行进一步的细分及纯化。综合运用多种现代波谱技术(MS、1H NMR、13CNMR、DEPT135、COSY、HSQC、HMBC、UV、IR、CD)对分离得到的8个化合物中的6个化合物进行了结构鉴定，其中，四个为新化合物，两个为首次从该植物中分离得到的已知化合物。新化合物包括两个异黄酮－查尔酮二聚体，即caraganinA(1)和caraganinB(2),和两个查尔酮二聚体，即caraganinC(3)和caraganinD(4)。两个已知化合物分别为5，7-二羟基-4′-甲氧基异黄酮和熊果醛。经过对Scifinder和Reaxy数据库进行化合物检索，发现新化合物1和2中的异黄酮和查尔酮之间的连接方式为新的C-C连接方式。采用现代波谱分析法对新化合物1～4的化学结构进行推导。根据化合物1的高分辨质谱数据推断其分子式为C33H28O9。氢谱显示化学位移在δH8.23处有一个尖锐的单峰，推测可能具有异黄酮的骨架存在。根据HMBC谱上的碳氢相关信号以及对比相关化合物的文献数据可以推断异黄酮骨架的存在。在低场区位于δH13.01处有一尖锐的单峰，推测为异黄酮的5位羟基，该羟基因为能与羰基形成分子内氢键，所以化学位移大幅度向低场移动。氢谱显示出化合物A环上存在两个间位偶合的氢，B环上两个对位取代的氢，C环上有一个ABX自旋系统，D环上有一个AA′BB′自旋系统。根据氢谱以及COSY谱中的相关信号可以推测一个丙烯基的存在。根据双键上两个氢信号间具有较大的偶合常数(J＝15.6Hz)可以推断该双键为反式构型。HMBC谱图中的相关信号表明H-7′与C-2″′存在相关，可以推断D环与C-7′相连，H-6′与H-6″和C-9′存在相关，可以推断B环与C环和C-9′相连。结构中C-9′的绝对构型通过对比实验测定的ECD谱和计算所得的ECD谱确定为R构型。化合物1的结构确定为R-(E)-3-(5-(1-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)allyl)-2,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one并命名为caraganinA。化合物2与化合物1的结构非常相似，不同之处仅在于化合物2的C环和D环的取代模式与化合物1不同。因此，其结构推导过程与化合物1相同。化合物2的结构确定为R-(E)-3-(5-(3-(2,4-dimethoxy-phenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)allyl)-2,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one，并命名为caraganinB。化合物1和2是首次发现的在异黄酮B环上的C-5′直接与二苯丙烯相互连接的结构。根据高分辨质谱数据推断化合物3的分子式为C33H32O6。根据氢谱以及COSY谱上H-2与H-3以及H-4存在相关，以及HMBC谱上H-2与C-9存在相关，H-5与C-4存在相关等信息可以推断出苯并二氢吡喃结构骨架的存在。根据氢谱和COSY谱可以推测出A环和B环皆为ABX自旋系统，C环和D环为AA′BB′自旋系统，以及反式双键的存在。HMBC谱上H-13与C-2″′的相关表明苯乙烯基的存在，H-6″与C-11的相关表明苄基的存在，H-6′与C-2存在相关表明B环中的C-1′与C-2相连，H-13与C-4存在相关表明苯乙烯基与C-4相连，H-4与C-11相关表明苄基与C-3相连。化合物3的相对构型由H-2/H-3,以及H-4/H-3的偶合常数以及NOESY谱确定，H-2/H-3以及H-4/H-3的偶合常数大于8Hz,表明H-2、H-3和H-4均为直立键，从NOESY谱上可以看到H-2与H-4存在相关，H-2和H-4都与H-11存在相关，因此确定H-2和H-4在同侧，H-3与H-2，H-4处于异侧。通过对比实验测定的ECD谱和计算所得的ECD谱，确定化合物3的绝对构型为2R,3R,4R。化合物3的结构确定为(2R,3R,4R)-(E)-2-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxybenzyl)-4-(4-hydroxystyryl)-7-methoxychromane，并命名为caraganinC。化合物4的分子式为C32H28O6，其化学结构化合物4与化合物3结构相似，不同之处在于化合物4的结构中多形成了B环与F环形成了另一个苯并二氢吡喃环，并且以及化合物4与化合物3的绝对构型也不相同。波谱数据综合分析确定其结构为(2S, 3R, 4R)-(E)-3-(4-hydroxybenzyl)-4-(4-hydroxystyryl)-7-methoxychroman-[2,4]-7-methoxychromane，并命名为caraganinD。经对异黄酮和查尔酮二聚体和查尔酮二聚体的药理活性进行综述，发现这两类成分有抗炎的作用，以及鬼箭锦鸡儿也具有抗炎的作用，本论文对分离得到的化合物进行了抗炎活性的筛选。当机体发生炎症反应时，组织会释放一系列的炎症因子。其中，一氧化氮(NO，即血管内皮舒张因子)在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用。同时，NO又是一种效应分子，在体内具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、调节脑血流、介导细胞毒效应和免疫调节、参与学习和记忆、动脉粥样硬化等。NO产生异常与某些疾病的发生发展有着密切关系。因此，近年来对NO的研究越来越受到广大科学工作者的重视。NO本身半衰期极短，血液中的NO主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、巨噬细胞等产生并以亚硝酸盐及硝酸盐式存在。运用Griess试剂将亚硝酸盐转化为深紫色的含氮化合物，测定该含氮化合物内发色团的的浓度可以间接测定NO的浓度。肿瘤坏死因子(TNF-α)是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促进其他细胞因子的合成和释放。白细胞介素-6(IL-6)能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化、参加机体的免疫应答，是炎症反应的促发剂。Elisa检测采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量检测。文献数据表明鬼箭锦鸡儿及其所含的特征类成分异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体均具有较好的抗炎活性。因此，本论文采用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型通过检测NO、IL-6、TNF-α等炎症因子的生成量对研究中分离得到的化合物进行了抗炎活性评价。实验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组和样品组等四组。通过在酶标仪上检测各孔吸光度值并根据公式或者建立标准曲线的方法来计算出各炎症因子的产生量，进而计算出各炎症因子的抑制率，并且根据相应的公式以及标准曲线计算出各炎症因子IC50值。实验结果表明，化合物2和4具有较强的抑制NO产生的活性，其IC50值分别为4.09和5.21μmol/L。通过对比化合物3和化合物4的结构可以看出，化合物4抑制NO生成的活性显著高于化合物3的原因可能与化合物4的结构中增加了一个桥环有关。化合物1和4在抑制炎症因子TNF-α产生过程中也表现出了一定的抑制活性，其IC50值分别为11.37和14.72μmol/L。天然有机化合物的生物合成途径研究有利于天然化合物的结构分类以及结构推测，并能指导仿生合成、指导组织培养生物活性物质，帮助定向寻找生物活性成分以及进行生物调控来提高活性成分的含量。通过对文献报道的所有异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体进行综述发现这两类成分的主要生物合成途径均包括加成反应和缩合反应。根据文献数据和基本的生物合成反应，本论文对分离得到的化合物1~4的生物合成途径进行了分析和合理的推测，发现化合物1和2可能是异黄酮的C-5′与查尔酮的β碳或者羰基碳通过α，β-不饱和酮的加成反应以及进一步的还原反应得到；化合物3和4可能是查尔酮先经过还原以及脱水反应形成中间体，然后此中间体再与一分子查尔酮通过[2+4]环加成反应、还原反应得到化合物3，或者此中间体与另一分子查尔酮通过[2+4]环加成反应、亲核取代反应及还原反应得到化合物4。收起

关键词 : 鬼箭锦鸡儿查尔酮二聚体查尔酮-异黄酮二聚体抗炎活性

8. 甘草查尔酮类衍生物的合成及抗宫颈癌活性研究

[学位论文] 杨旭超新疆医科大学 2016年硕士导师: 木合布力·阿布力孜共79页

摘要 : 目的：a.设计并合成查尔酮异甘草素类化合物；b.设计并合成含氟查尔酮异甘草素类化合物；c.对在间苯二酚中的Mannich反应应用的扩展，并利用Mannich反应合成查尔酮异甘草素Mannich碱类化合物；d.对上述三类化合物分别评价其对抑制子宫颈癌细胞的细胞增... 展开目的：a.设计并合成查尔酮异甘草素类化合物；b.设计并合成含氟查尔酮异甘草素类化合物；c.对在间苯二酚中的Mannich反应应用的扩展，并利用Mannich反应合成查尔酮异甘草素Mannich碱类化合物；d.对上述三类化合物分别评价其对抑制子宫颈癌细胞的细胞增殖和促癌细胞凋亡作用；e.结合优势基团合成目标化合物XVII，对目标化合物评价其抗宫颈癌细胞活性。方法：a.利用Claisen-Schmidt反应原理，通过微波固相合成5种目标化合物(I-V)，并进行结构表征；b.利用经典Claisen-Schmidt反应，在低温、碱性条件下合成7种目标化合物(VI-XII)，并进行结构表征；c.以间苯二酚、甲醛为原料、以两种含氮的化合物(叔丁胺和吡咯烷)为胺类物质，探索间苯二酚 Mannich反应的最佳条件；并利用异甘草素中的间苯二酚结构进行Mannich反应，以醋酸为溶媒，浓盐酸作催化剂的条件下合成4种含氮的Mannich碱的目标化合物(XIII-XVI)；d.以 SiHa(人子宫颈鳞癌细胞)和HeLa(子宫颈癌细胞)细胞株作为体外模型，利用MTT法考察目标化合物对宫颈癌细胞增殖的抑制活性，然后利用流式细胞仪测定目标化合物对宫颈癌细胞促凋亡作用。e.通过对三类物质的抗癌活性研究对比，合成最终化合物 XVII，利用MTT法考察目标化合物对宫颈癌细胞增殖的抑制活性，然后利用流式细胞仪测定目标化合物对宫颈癌细胞促凋亡作用。结果：a.快速高效合成了5个查尔酮异甘草素类化合物，其结构经1H-NMR，13C-NMR谱确认，产率在38.75%~58.9%；b.在较温和的条件下合成7个含氟查尔酮异甘草素类化合物，其结构经1H-NMR谱确认，产率在23.5%~45.2%；c.间苯二酚的Mannich反应得到证明；并在间苯二酚Mnanich反应的基础上合成4个异甘草素类化合物，其结构经1H-NMR谱确认，产率在7.5%~12.6%；d.在第一类化合物I-V中，对SiHa细胞的IC50在0.082~75.21μg·mL-1，对HeLa细胞的IC50在6.87~62.4μg·mL-1，IC50以化合物IV在对SiHa细胞干预72 h为最低，0.082μg·mL-1，在对HeLa细胞干预72 h为最低，6.87μg·mL-1；流式细胞仪的结果为，对SiHa细胞的总凋亡率在8.4%~43.6%，对HeLa细胞的总凋亡率在6.87%~62.4%；以化合物I，在浓度为100μg·mL-1对SiHa细胞的总凋亡率最高，43.6%，以化合物II，在浓度为25μg·mL-1对HeLa细胞的总凋亡率最高，92.3%。在第二类化合物VI-XII中，对SiHa细胞的IC50在3.35~25.21μg·mL-1，对HeLa细胞的IC50在10.25~42.54μg·mL-1，IC50以化合物VII在对SiHa细胞干预72 h为最低，3.35μg·mL-1，以化合物VII在对HeLa细胞干预72 h为最低，10.25μg·mL-1；在第三类化合物XIII-XVI中，对SiHa细胞的IC50在2.36~15.35μg·mL-1，对HeLa细胞的IC50在1.36~23.35μg·mL-1，IC50以化合物XV在对SiHa细胞干预72 h为最低，2.36μg·mL-1，以化合物XV在对HeLa细胞干预72 h为最低，6.87μg·mL-1。e.通过对三类物质的抗癌活性研究对比，合成最终化合物XVII，并计算其IC50，然后利用流式细胞仪测定目标化合物对宫颈癌细胞促凋亡作用。结论：通过三类不同的合成途径合成三类甘草查尔酮类化合物，并且对其目标化合物进行结构鉴定；各类甘草查尔酮类化合物对SiHa细胞和HeLa细胞表现出较显著的抑制活性和促进凋亡作用；然后结合三类化合物的构效关系，合成目标化合物XVII，得到较强的抑制宫颈癌细胞增殖和促宫颈癌细胞的凋亡作用。此结果对从甘草查尔酮异甘草素类衍生物中筛选出具有抗子宫颈癌的有效候选药物奠定重要的基础。收起

关键词 : 甘草查尔酮类衍生物查尔酮异甘草素合成路线抗宫颈癌活性

9. 橄榄叶类黄酮合成相关基因cDNA的克隆和生物信息学分析

[学位论文] 张庆举福建农林大学 2011年硕士导师: 陈清西共80页

摘要 : 本研究以‘长营’橄榄叶片为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了橄榄叶黄烷酮-3-羟化酶基因(flavonoid3-hydroxylase,F3H)和查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase,CHI)的cDNA全长序列以及查尔酮合成酶基因(chaleone synthase,CHS)的部分cDNA序列,为... 展开本研究以‘长营’橄榄叶片为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了橄榄叶黄烷酮-3-羟化酶基因(flavonoid3-hydroxylase,F3H)和查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase,CHI)的cDNA全长序列以及查尔酮合成酶基因(chaleone synthase,CHS)的部分cDNA序列,为橄榄黄酮化合物的生物合成调控及开发利用提供一定的理论基础。主要研究结果如下: 1.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶F3H基因cDNA全长橄榄叶F3H基因cDNA序列全长1295 bp,包含一个完整的开放阅读框1095bp,5’和3’非编码区分别为41 bp和159 bp,编码364个氨基酸,蛋白质分子量41084.9 Da,理论等电点pI5.47,总平均疏水性为-0.437,不稳定系数为42.34,属于不稳定蛋白。橄榄叶F3H基因cDNA序列与荔枝、柚子、龙眼、甜橙、陆地棉、海岛棉的同源性比较高,分别为84％、84％、83％、83％、82％、82％。对F3H保守区功能分析结果显示,F3H包含三个结构功能域:20G-FeⅡ-Oxy高度保守区域、PLN03176和PLN02515结构域。全酶催化以下反应:ProcollagenL—proline+2-oxoglutarate+O2procollagen trans-4-hydroxy-L-proline+succinate+C02。20G-FeⅡ-Oxy家族还具有赖氨酸水解酶、异青霉素合成酶及AlkB的活性。该序列的GenBank登录号为:JF728820。 2.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶CHI基因cDNA全长橄榄叶CHI基因cDNA序列全长1054 bp,包含一个开放阅读框672 bp,5’和3’非编码区分别为50 bp和332 bp,编码223个氨基酸,蛋白质分子量24247.9Da,理论等电点pI5.58,总平均疏水性为0.013,不稳定系数为34.60,属于稳定蛋白。序列对比表明,橄榄叶CHI基因cDNA序列与温州蜜柑、甜橙、柚子、杨树、美洲葡萄的同源性比较高,分别为80％、80％、80％、79％、78％。对CHI保守区功能分析结果显示,CHI包含一个Chaleone superfamily保守结构域。查尔酮异构酶是植物体内催化查尔酮到柚配苷的一种酶,在类黄酮合成过程中起到关键作用。该序列的GenBank登录号为:JF728821。 3.利用RACE和RT-PCR技术克隆橄榄叶CHS基因cDNA片段从橄榄叶中克隆获得的CHS基因cDNA序列长511 bp,5’非编码区碱基数为117 bp,推测编码146个氨基酸。经BLAST分析表明,该cDNA序列与其它多种植物CHS基因具有较高的同源性。对CHS保守区功能分析结果显示,CHS在16-146位氨基酸之间,包含部分cond_enzymes superfamily结构域。该酶家族是一类缩合酶,催化缩合反应,各模体之间结构相似性非常高,与脂肪酸的合成和降解、聚酮化合物的产生以及各种不同的天然产物有关。该序列的GenBank登录号为:JF728822。本实验继王云梅之研究,进一步克隆了黄酮代谢途径中的F3H和CHI基因的全长以及CHS基因的片段,以期为橄榄整个类黄酮代谢的表达调控、基因的进化及功能研究奠定一定的基础。收起

关键词 : 橄榄类黄酮基因克隆黄烷酮3-羟化酶查尔酮异构酶查尔酮合成酶

10. 含硫查尔酮席夫碱及其配合物的合成与表征

[学位论文] 赵越扬州大学 2008年硕士导师: 刘永红共115页

摘要 : 席夫碱及其配合物在立体化学、结构化学、异构现象、磁学、光谱学、动力学和反应机理、配位化学、分析化学、催化、稳定剂、染料和颜料、电光显示以及农业等领域都有着重要作用。肼基二硫代甲酸酯以及缩氨基硫脲衍生的席夫碱及其配合物具有很强的抗癌... 展开

关键词 : 含硫查尔酮席夫碱及其配合物合成